CN104263679A - 一种高效解磷菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种自主筛选的高效解磷细菌及其菌剂的制备方法，属于生物技术领域。该解磷细菌菌株被命名为Bacillus subtilis JT-1，经鉴定为枯草芽孢杆菌，已经于2014年8月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2014367。该解磷菌能够将难溶性无机磷转化为可供植物直接吸收利用的优质磷素化合物，可提高土壤中难溶性磷的生物有效性和磷肥利用效率，节肥增产，且在培育和发挥土壤生态肥力、保持农业生态平衡方面具有重要意义和应用价值。

Description

一种高效解磷菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种高效解磷菌及其应用。 
背景技术
磷是植物生长发育不可缺少的大量元素之一，是植物的重要组成成分，并以多种方式参与植物体内各种生理生化过程，对促进植物的生长发育和新陈代谢起着重要的作用，但是土壤中的磷绝大部分不能被植物直接吸收。据调查，中国有74％的耕地土壤缺磷，土壤中95％的磷为无效形式，植物很难吸收利用，其中难溶性有机磷一般占土壤全磷的20％-50％，占难溶性土壤磷总量的10％-85％。施入的磷肥本季节利用效率为5％-25％，大部分磷与土壤中的Ca2+、Fe3+、Al3+结合形成难溶性磷酸盐。大量使用化肥明显造成土壤板结、土壤保水力下降、草地退化、荒漠化严重等不良后果。因此，提高磷的利用率一直是农学、土壤学、生态环境和微生物学研究者关注的热点。 
解磷微生物是土壤中能够将无效磷转化为植物可以吸收利用的有效磷的一类特殊微生物功能群体，在自然及农业生态的磷素生物地化循环中起到了关键作用。解磷细菌是解磷微生物中重要的一类，通过活化土壤磷元素或影响植物根系分泌物的种类和数量，增加植物根系对K、Ca、Mg、Fe、Zn等营养元素的吸收，从而促进植物的生长发育。解磷细菌还通过分泌各种酶类或有机酸来活化土壤中的难溶态磷，并影响根际微生物的群落结构。大量研究表明，施用含有高效解磷细菌的微生物菌剂能显著促进植物生长、改善植株根际环境。因此，高效解磷微生物的筛选及其制备对于现代农业的发展至关重要。 
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有降解土壤难溶无机磷，为植物提供可以直接吸收的优质磷素的一种高效解磷菌Bacillus subtilis JT-1。 
本发明还要解决的技术问题是提供上述高效解磷菌的应用。 
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下： 
一种高效解磷菌，其分类命名为Bacillus subtilis JT-1，保藏于中国典型培养物保藏 中心(简称CCTCC)，保藏地址：武汉武汉大学，邮编：430072。菌种保藏号为CCTCC M 2014367，保藏日期为2014年8月5日。是发明人于湖北省宜昌杉树垭磷矿地区的磷矿土样中选育的菌株。 
菌株JT-1具有下述性质： 
1、菌落形态学特征： 
在蛋白胨琼脂培养基上30℃培养2～3天后显微镜观察到营养细胞为单细胞，杆状，0.5～3×0.5～3μm，有椭圆形芽孢。在上述培养基中30℃培养12h菌体可以大量生长。菌落呈白色，圆形，表面光滑，粘状，中间凸起。 
2、生理与生化特性： 
(1)培养温度：25～38℃，最适温度为30-32℃； 
(2)在pH5.0～9.0范围内生长； 
(3)革兰氏染色：阳性； 
(4)VP反应：阳性； 
(5)淀粉水解试验：阳性； 
(6)硝酸盐还原反应：阳性； 
(7)柠檬酸利用：阳性； 
(8)明胶液化：阳性； 
(9)苯丙酸脱氨酶试验：阴性； 
(10)M.R.：阴性； 
(11)脲酶试验：阴性； 
(12)丙酸盐利用：阴性； 
3、16S rDNA序列分析： 
测得16S rDNA大部分序列1418bp，如SEQ ID No：1所示。将所测序列从GeneBank数据库中的相关种进行比较，构建16S rDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株与枯草芽孢杆菌达到100％同源。所以认定本发明使用的是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，具体为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis JT-1。 
上述高效解磷菌在土壤解磷中的应用。 
上述高效解磷菌可与有机肥混合使用，也可以单独使用，改善根际微生物环境，促进植物生长，减少化肥用量。 
将高效解磷菌按如下方法制备成菌剂用于土壤的解磷： 
将斜面保存的解磷菌活化，接种于活化培养基上，培养18～24h；挑取活化培养基上的菌种，接种于发酵培养基中，30～35℃，培养12～24h，得发酵液用于土壤的解磷，或者将发酵液进行干燥处理得到干燥物用于土壤的解磷。 
其中，所述的活化培养基为LB培养基，所述的发酵培养基组分为：碳源10-100g/L，氮源1-40g/L，无机盐0.01-50g/L，溶剂为水，pH5.0～9.0。 
其中，所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油、淀粉和糖蜜中的任意一种或几种的组合；所述的氮源为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2HPO4和NH4NO3中的任意一种或几种的组合；所述的无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐和盐酸盐中的一种或几种的组合。 
上述高效解磷菌制备成颗粒剂、粉剂、溶液、悬浮液或棒剂用于土壤解磷。 
本发明的高效解磷菌在30℃，150rpm条件下振荡培养7d，可将5.0g/L Ca3(PO4)2解磷，水溶性磷含量为682.43-725.28mg/L。 
有益效果：本发明的高效解磷菌及其制备得到的菌剂具有以下优点： 
1.本发明从土壤中筛选出具有降解难溶性无机磷(如Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+等离子结合形成难溶性磷酸盐)的解磷菌Bacillus subtilis JT-1，并以解磷菌Bacillus subtilis JT-1为菌种发酵培养制备得到解磷菌剂，该解磷菌及其菌剂能够将难溶性无机磷转化为可供植物直接吸收利用的优质磷素化合物，可提高土壤中难溶性磷的生物有效性和磷肥利用效率，节肥增产，而且可改善土壤结构，提高土壤有机质含量，对充分发挥土壤生态肥力、保持农业生态环境的平衡等均具有极其重要意义和应用价值。 
2.本发明提供的解磷菌及其菌剂，不仅能增加土壤中的有效磷，而且能促进植物对其他营养元素的吸收，解磷菌可以吸附植物根系周围的锌、铜、钙等营养元素，改善植物营养；而且还可分泌生长调节物质，促进根系生长；并且解磷菌接种后，在植物根际大量生长繁殖，在一段时间内成为植物根际的优势菌，从而可抑制或减少病原微生物的繁殖机会，提高植物的抗病能力。 
3.本发明提供的解磷菌剂可将土壤中难溶性无机磷降解为植物可以利用的可溶性无机磷，向土壤中直接释放优质磷肥料，故不存在生产过程中向环境排放污染物，解磷微生物是一种真正意义上的环保型肥料；且本发明提供的解磷菌剂的制备方法，生产工 艺简单，生产效率高，能实现工业化大生产，具有良好的经济效应和社会效应。 
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。 
实施例1： 
按如下步骤制备本发明所述解磷菌剂： 
将4℃斜面保存的解磷菌Bacillus subtilis JT-1活化，接种于茄形培养瓶培养基(即活化培养基)上，培养18-24h。将长好的菌种转移至发酵培养基中，30-35℃，培养12-24h，得发酵液或发酵液干燥物，菌剂中的菌体数量可达到1×1010-9×1012CFU/g。 
所述茄形培养瓶中的培养基为LB培养基，发酵培养基组分为：葡萄糖10g/L，(NH4) 2SO40.5g/L，NaCl0.3g/L，MnSO4·4H2O0.03g/L，KH2PO41g/L，pH为6.0-8.0。 
以上所述的生产罐的发酵培养过程中无菌空气的通气量为0.6-0.8vvm，搅拌速度为180-200rpm。 
实施例2：菌株的解磷能力测定。 
在500mL三角瓶中分别加入100mL无机磷液体培养基，培养基成分为葡萄糖10g/L，(NH4)2SO41g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，NaCl0.3g/L，FeSO4·7H2O0.03g/L，MnSO4·4H2O0.03g/L，Ca3(PO4)25.0g/L。再接种1mL菌悬液，同时做不接种对照(培养基中加入1mL无菌水)，所有处理进行3次重复。在30℃，150rpm分别振荡培养7d，将培养液在6000rpm下离心20min，通过钼锑抗比色法测定解磷量(水溶性磷含量)为682.43-725.28mg/L，解磷率为68.2％-72.5％。解磷菌JT-1具有较高的解磷能力。 
实施例3：解磷菌剂可以提高农作物产量。 
解磷菌剂的发酵制备基本同实施例1。 
以小区水稻为实验对象，试验设2个处理，不加解磷菌剂(T1)和施加解磷菌剂(T2)菌剂用量为30kg/hm2，每个处理3次重复，小区长8m，宽3m，小区面积24m2，小 区四周设置保护行，2个处理除施加解磷菌剂不同外，其余施肥、浇水等管理措施均相同。 
表1.各处理对水稻的产量及其构成因素的影响 
由表1可知，解磷菌剂能明显提高水稻有效穗数、穗粒数和水稻产量，与不加菌剂对比增产36.1％。这说明解磷菌剂能显著提高农作物产量。 
实施例4：解磷菌剂可以减少施用的化肥。 
解磷菌剂的制备基本同实施例1。 
以盆栽小白菜为实验对象，试验设3个处理，其中处理1为试验对照普通肥料，处理2为普通肥料+解磷菌剂，处理3为减施30％质量的普通肥料+解磷菌剂。处理1和处理2施肥量为每千克土150mg，处理3施肥量为每千克土105mg，处理2和处理3的菌剂施用量为每千克土8mg。 
表2.解磷菌剂对盆栽小白菜生长特性及产量的影响 
解磷菌剂与肥料混施，能够促进小白菜根部的发育，使根增粗、增大，对小白菜植株株高、地下部鲜重、地上部鲜重都有明显的促进作用，可增产32.6％。当减施30％质量的肥料时，依然对白菜地上部鲜重都有显著的提高，可增产17.7％。这说明解磷菌剂可以有效的减少化肥的使用量。 
实施例5：解磷菌剂可以显著提高肥料利用率。 
解磷菌剂的发酵制备基本同实施例1。 
试验设计了3个处理，处理1为不施肥，处理2为施用普通复合肥，处理3为普通肥料+解磷菌剂。每个处理4次重复，共32盆，随机排列。所施加的肥料为400kg/hm2，菌剂用量为20kg/hm2。实验对象为玉米，通过计算磷肥的利用率，试验结果如下： 
表3组合型肥料增效剂对磷肥利用率的影响 
由表3可知，本发明中解磷菌剂对玉米P的利用率提高了31.7％，产量提高了59.4％。因此本发明中解磷菌剂能显著促进粮食作物增产，提高肥料利用率。 
实施例6：解磷菌剂显著提高农作物的品质。 
解磷菌剂的制备同实施例1。 
以甜瓜为实验对象，试验共设3个处理，3次重复。处理1为施加普通复合肥(450kg/hm2)，处理2为施加普通复合肥(450kg/hm2)+解磷菌剂(25kg/hm2)，处理3为减少施用30％质量的普通复合肥(360kg/hm2)+解磷菌剂(25kg/hm2)，甜瓜管理为日常管理。 
表4.解磷菌剂对甜瓜Vc和硝酸盐含量的影响 
与处理1相比，解磷菌剂可以提高Vc含量46.2％，降低硝酸盐含量25.1％。当减 少施用30％质量的复合肥时，解磷菌剂可以提高Vc含量23.1％，降低硝酸盐含量29.6％，有效的提高了甜瓜的品质。 

Claims (7)

1.一种高效解磷菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，菌株号为JT-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC M 2014367，保藏日期为2014年8月5日。
2.权利要求1所述的高效解磷菌在土壤解磷中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将高效解磷菌按如下方法制备成菌剂用于土壤的解磷：
将斜面保存的解磷菌活化，接种于活化培养基上，培养18～24h；挑取活化培养基上的菌种，接种于发酵培养基中，30～35℃，培养12～24h，得发酵液用于土壤的解磷，或者将发酵液进行干燥处理得到干燥物用于土壤的解磷。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的活化培养基为LB培养基，所述的发酵培养基组分为：碳源10-100g/L，氮源1-40g/L，无机盐0.01-50g/L，溶剂为水，pH5.0～9.0。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油、淀粉和糖蜜中的任意一种或几种的组合；所述的氮源为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2HPO4和NH4NO3中的任意一种或几种的组合；所述的无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐和盐酸盐中的一种或几种的组合。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，高效解磷菌制备成颗粒剂、粉剂、溶液、悬浮液或棒剂用于土壤解磷。
7.权利要求1所述的高效解磷菌在促进植物生长、减少化肥用量中的应用。
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