CN109679884A

CN109679884A - 一株能减少氮磷肥施用的玉米高效促生菌及其应用

Info

Publication number: CN109679884A
Application number: CN201910150243.6A
Authority: CN
Inventors: 隋新华; 陈腊; 米国华
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-02-28
Filing date: 2019-02-28
Publication date: 2019-04-26
Anticipated expiration: 2039-02-28
Also published as: CN109679884B

Abstract

本发明公开了一株能减少氮磷肥施用的玉米高效促生菌及其应用。本发明所提供的促生菌为芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.17040。本发明的芽孢杆菌菌株MGPR1可促进不同时期的玉米株高、地上及地下生物量、叶绿素、叶面积指数的显著增加，比缺氮、缺磷对照玉米产量显著增加12.56％(减氮50％)和7.73％(减磷100％)，并与正常施肥产量无显著差异。本发明所述芽孢杆菌MGPR1是一株稳定高效的减肥增效微生物肥料菌种资源。

Description

一株能减少氮磷肥施用的玉米高效促生菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一株能减少氮磷肥施用的玉米高效促生菌及其应用。

背景技术

我国农业生产中肥料施用量大但利用率不高且流失严重。化肥的长期过量施用对土壤也造成了一定的损伤，如土壤板结、酸化、盐碱化、微生物群体结构的破坏(有益微生物的减少，有害微生物的增多)等一系列问题，对食品安全也造成了一定的威胁。那么如何有效解决这些我国农业生产障碍问题和实现农业的可持续性发展？这正好与微生物肥料的功能相吻合，也正是微生物肥料的特点和专长。微生物肥料是实现我国农业绿色发展不可或缺的产品，我国比世界任何国家都更需要发展微生物肥料。

根据功能将微生物肥料划分为很多类型，促进农作物生长和产量的微生物肥通常由植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)构成。PGPR是指自由生活在土壤或附生于植物根系的一类可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌类。更重要的是有些PGPR能够诱导植物产生系统抗性(inducedsystemic resistance,ISR)，从而提高植物整体的抗病能力。其与植物的促生关系分为直接作用和间接作用。直接作用主要表现为：(1)PGPR可以通过自身固氮、溶磷、解钾或产生铁载体直接供给植物营养；(2)PGPR可形成植物激素、次生代谢产物和裂解酶等促进根毛形成、横向根的发育和主根生长进而促进植物生长；(3)PGPR可诱导植物根细胞中的基因转录和代谢合成，改善根系生理机能。间接作用常指生物防治作用，包括抗病和抗虫，抗病作用主要表现为：(1)PGPR通过分泌抗生素、抗菌蛋白或多肽等活性物质杀死病原菌；(2)PGPR通过与病原菌争夺营养和生态位产生拮抗作用；(3)PGPR通过信号物质诱导植物获得系统抗性等而减轻病菌的危害。抗虫作用是通过产生挥发性物质趋避害虫或吸引害虫天敌起到抗虫作用。此外，PGPR还有抗逆(盐碱、旱涝、农药、营养胁迫等)和污染土壤修复等作用。

尽管PGPR作用如此广泛，但其在大田应用中会受到多重因素的影响，如气候、土壤类型、土壤管理措施等非生物因子的干扰和植物基因型、植物不同发育阶段以及植物自身防御机制等生物因子的影响。这两大类因素都是影响PGPR应用效果的重要原因，因此应针对不同环境和植物类型筛选适合的微生物菌剂。虽然我国微生物肥料品种众多，但主要开发和应用对象都是瓜果蔬菜等经济价值较高的植物，适合于粮食作物的极少，适合玉米的就更少，加之现有的生物肥料成本高等原因，实际在玉米种植中农户根本用不起。因此，选育经济性好、适合我国东北地区的玉米高效微生物菌剂和耦合的应用技术，以达到减肥增效的目标，对于促进玉米农业绿色可持续发展十分必要和迫切。

发明内容

本发明的目的是提供一种能减少氮磷肥施用的玉米高效促生菌及其应用。

第一方面，本发明要求保护一种芽孢杆菌。

本发明所要求保护的芽孢杆菌具体为芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.17040。

本发明所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1经血琼脂平板培养法检测，溶血活性为阴性，表明对人畜无害。

本发明所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1经鉴定具有多种功能特征，主要包括：(1)促生功能：产IAA能力，IAA合成量为58.03μg/ml；具有解钾能力，可溶性解钾指数为2.34；具有产铁载体能力，可溶性指数为1.41。(2)抗逆性：可耐盐7％；耐酸pH5；耐碱pH10；耐干旱(30％PEG，重度干旱)。(3)耐药性：可耐受农业应用中普遍使用的杀虫剂吡虫啉(88ppm)和杀菌剂嘧菌酯(312.5ppm)的最大使用剂量。

第二方面，本发明要求保护一种菌剂。

本发明所要求保护的菌剂具体为活性成分为所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1的菌剂。

所述菌剂中除了含有作为活性成分的所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1外，还含有辅料。所述辅料可根据需要选择。

在本发明的一个实施例中，所述菌剂具体为液体菌剂，是通过采用添加有终浓度为0.1mg/ml的色氨酸的LB液体培养基培养所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1获得的；所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1在所述液体菌剂中的浓度为1×10^10-11cfu/ml。

第三方面，本发明要求保护所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1在作为植物根际促生菌中的应用。

第四方面，本发明要求保护所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1或所述菌剂在制备用于促进植物生长的产品中的应用。

其中，所述产品可为微生物肥料。

第五方面，本发明要求保护所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1的田间应用方法。

本发明所要求保护的所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1的田间应用方法，可包括如下步骤：

(A1)向所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1的菌液中添加微量元素；

(A2)将步骤(A1)获得的添加有微量元素的菌液喷洒于植物种子表面，阴干；

(A3)步骤(A2)阴干的种子，用1％的羧甲基纤维素钠溶液再拌种包衣，阴干；

(A4)播种。

进一步地，步骤(A1)中，所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1的菌液可通过采用添加有终浓度为0.1mg/ml的色氨酸的LB液体培养基培养所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1获得；所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1在所述菌液中的浓度可为1×10^10-11cfu/ml。其中，色氨酸为合成IAA的底物。

进一步地，步骤(A1)中，所述微量元素可以微量元素溶液的形式添加到所述菌液中；所述微量元素液的组成可如下：H₃BO₃ 2.86g/L，MnSO₄ 1.81g/L，CuSO₄·5H₂O0.80g/L，ZnSO₄ 0.22g/L，H₂MoO₄ 0.02g/L，余量为水；向所述菌液中添加的所述微量元素液的量可为每mL所述菌液添加1μL所述微量元素液。其中，所述微量元素的作用是增加营养提高细菌活性。

进一步地，步骤(A2)中，所述添加有微量元素的菌液的用量以使种子表面湿润即可。

进一步地，步骤(A3)中，所述1％的羧甲基纤维素钠溶液为含有终浓度为10g/L羧甲基纤维素钠的水溶液。配制方法如下：10g羧甲基纤维素钠(800～1200mPa·s)溶于1L去离子水，在60℃水浴中搅拌溶解至透明糊状胶液。所述1％的羧甲基纤维素钠溶液的用量可为每kg种子用50mL(保持菌剂附着和湿度)。

进一步地，步骤(A4)中，在进行完所述播种后还可包括浇水的步骤(保证菌株必要的湿度利于生存)。

第六方面，本发明要求保护所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1或所述菌剂或第五方面中所述的方法在促进植物生长中的应用。

在上述各方面中，所述促进植物生长可体现为在氮胁迫和/或磷胁迫的土壤中促进植物生长。在本发明的一个实施例中，所述氮胁迫和/或磷胁迫的土壤具体为我国东北地区(如吉林省，具体如吉林省四平市梨树县三棵树村)的土壤。

进一步地，所述氮胁迫是氮肥施用量为正常施用量的一半；所述磷胁迫是不施用磷肥。在本发明中，所述氮肥具体为尿素。

在上述各方面中，所述植物可为粮食作物。在本发明的一个实施例中，所述植物具体为玉米(如郑单958)。

在本发明中，所述促进植物生长具体可体现为如下中的全部或部分：

(B1)在所述植物的不同发育时期促进所述植物的株高增加；

(B2)在所述植物的不同发育时期促进所述植物的地上和/或地下生物量增加；

(B3)在所述植物的不同发育时期促进所述植物的叶绿素含量增加；

(B4)在所述植物的不同发育时期促进所述植物的叶面积指数增加；

(B5)促进所述植物的百粒重增加；

(B6)促进所述植物的穗粒数增加；

(B7)促进所述植物的产量增加；

所述不同发育时期为如下中的任一种：苗期(出苗后25天)、拔节期(出苗后50天)、吐丝期(出苗后75天)、成熟期(出苗后150天)。

本发明菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1分离自玉米根际土壤，该菌株具有多种促生特性如高产IAA，解钾，产铁载体等，并具有很强的适应性如耐干旱、耐受农药和耐酸碱等，是生物安全菌株。在减氮肥施用50％和减磷肥施用100％的情况下，田间施用该菌剂比未施用对照可显著增加不同发育时期的玉米株高、地上及地下生物量、叶绿素、叶面积指数，玉米产量分别提高了12.56％和7.73％，且产量水平与正常施肥的水平无显著差异。本发明为我国玉米主要种植区—东北地区提供了高效稳定促生的微生物种质资源，有利于促进我国农业绿色健康可持续发展。利用此菌，可减少氮肥的投入和减轻过量施用氮肥对环境造成的污染，符合我国可持续绿色农业发展的需要和低碳、环保、生态农业的要求。该发明专利扩大了我国粮食作物促生菌种质资源，为研发高效稳定的微生物肥料以及应用技术提供基础。

保藏说明

菌株名称：芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus sp.

参椐的生物材料(株)：MGPR1

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2018年12月27日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17040

附图说明

图1为芽孢杆菌MGPR1在LB固体培养基上的菌落形态。

图2为芽孢杆菌MGPR1产IAA定性分析图。

图3为IAA标准品以不同显色浓度绘制出的IAA标准曲线。

图4为芽孢杆菌MGPR1在解钾培养基上培养3d解钾圈图示。

图5为芽孢杆菌MGPR1在CAS培养基上培养3d产铁载体图示。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、芽孢杆菌MGPR1分离和鉴定

玉米在我国农业生产和发展中处于至关重要的地位，随着物质水平和科学技术的提高，玉米不再仅仅发挥作为食物原料的作用，在淀粉、制糖、榨油、酿酒，医药等领域的用途日益广泛。东北是我国玉米主要种植区之一，且东北黑土地也急需采取有效措施保护，以遏制黑土退化。本发明针对东北地区玉米生产及土壤现状，通过从玉米根际土壤中分离根际细菌并测定菌株的促生功能，如固氮、溶磷、解钾，产IAA，产铁载体，抗逆，抗病等，选出高效菌株，应用到我国玉米种植面积最大的吉林梨树的缺氮缺磷土壤长期定位试验田进行玉米大田应用效果研究，结果发现有一株菌在玉米不同生长阶段均有很好的促生效果。

一、材料和方法

1、实验材料

(1)土壤样品的采集

2017年9月15日于吉林省四平市梨树县三棵树村，采用5点采样法取玉米根际土壤，将样品混匀，放入无菌的自封袋里，于4℃冰箱保存并尽快分离。

(2)使用的培养基及试剂

①LB(Luria-Bertani Agar)培养基

胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10g，琼脂15-20g(固体培养基加)，去离子水1000mL，pH6.8-7.2，121℃灭菌20min。

②PKO(Pikovskaya's Medium)无机磷培养基

葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，NaCl 0.2g，KCl 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄0.03g，FeSO₄0.003g，酵母膏0.5g，Ca₃(PO₄)₂5g，琼脂18g(固体培养基加)，去离子水1000mL，pH6.8-7.0，121℃灭菌20min。

③蒙金娜有机磷培养基

葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄0.03g，卵磷脂0.2g，CaCO₃ 5g，酵母膏0.4g，琼脂18g(固体培养基加)，去离子水1000mL，pH6.8-7.2，121℃灭菌20min。

④解钾细菌培养基

蔗糖10g，酵母膏0.5g，(NH₄)₂SO₄ 1.0g，Na₂HPO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，CaCO₃1.0g，钾长石粉1.0g，琼脂18g(固体培养基加)，去离子水1000mL，pH6.8-7.0，121℃灭菌20min。

⑤改良YMA培养基(基础培养基)

甘露醇10.0g，K₂HPO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄ 0.2g，NaCl 0.1g，酵母粉1.0g，色氨酸10mg，琼脂18g(固体培养基加)，去离子水1000mL，pH6.8-7.2，121℃灭菌20min。

⑥CAS产铁载体培养基

溶液a：0.079g铬天青，50ml去离子水，10ml 1mmol/L的FeCl₃溶液(含10微升37％(质量分数)HCl的浓盐酸(商业制剂)。

溶液b：0.069g十六烷基三甲基溴化铵，40ml去离子水。

a溶液沿烧杯壁缓慢加入b溶液，摇晃混匀得CAS蓝色显色液。

0.1mol/L磷酸缓冲液：Na₂HPO₄·12H₂O 2.427g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.5905g，K₂HPO₄0.075g，NH₄Cl 0.250g，NaCl 0.125g，100ml去离子水(使用时稀释10倍)。

20％(20g/100ml)蔗糖溶液10ml，10％(10g/100ml)水解酪干素30ml，1mmol/LCaCl₂ 1ml，1mmol/L MgSO₄ 20ml，琼脂18g，0.1mol/L磷酸缓冲液和CAS蓝色显色液各50ml，121℃灭菌20min。

⑦血琼脂培养基

蛋白胨18g，酵母粉1g，NaCl 5g，琼脂15g-20g，去离子水1000mL，pH6.8-7.2。121℃灭菌20min后，待培养基冷却至50℃添加5％(5ml/100ml)脱纤维羊血，混匀后倒平板。

⑧耐盐培养基

配制LB培养基，其中NaCl按1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％NaCl(g/100ml)盐浓度分别称取加入，121℃灭菌20min。

⑨耐酸碱培养基

配制LB培养基7瓶，灭菌后在超静工作台中，用无菌稀盐酸和氢氧化钠溶液调整培养基的pH值分别到pH4、5、6、7、8、9、10，冷却至50℃左右倒平板。

⑩耐农药培养基

选取东北地区玉米常用除草剂、杀菌剂、杀虫剂各一种，按照说明书的最高使用浓度递减设4个浓度梯度，并计算出四个梯度的用量/100ml(表1)。灭菌后的LB培养基冷却至50℃左右，快速分别加入4个浓度梯度的农药量，迅速摇匀后倒平板。

表1实验所用农药梯度设置及相应农药含量

耐干旱培养基

耐干旱培养基采用聚乙二醇(PEG 6000)调节水势人工模拟干旱条件进行耐干旱菌株鉴定。共设置4个处理，PEG 6000含量分别为：0(CK)、10％(轻度干旱)、20％(中度干旱)和30％(重度干旱)。其对应的水势分别为：0，-0.185，-0.559，-1.122MPa，121℃灭菌20min。

试剂

Salkowski比色液：0.5mmol/L的FeCl₃溶液1ml与50ml 35％(质量分数)的高氯酸溶液(用70％(质量分数)的商业高氯酸制剂与水1：1混合配置而成)混合，显色液需现配现用，不能长时间保存。

无菌生理盐水：0.8g NaCl溶于100ml去离子水中，121℃灭菌20min。

(3)使用的引物信息

如表2所示。

表2本发明所用引物信息

2、实验方法

(1)菌株分离

0.5g土壤样品溶于50ml 0.8％(0.8g/100ml)无菌的生理盐水中，37℃，180rpm温和摇动1h(三个样品重复)形成土壤浑浊液原液；从原液中取1ml梯度稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，5个稀释梯度，充分摇匀获得梯度稀释液。吸取100μl上清液涂布于LB固体培养基，37℃培养至单菌落长出，挑取单菌落再平板划线纯化三次后保存。

(2)产IAA菌株的筛选

产IAA菌株定性测定：将分离纯化后的细菌接种于改良YMA液体培养基，每一菌株3个重复，摇床培养(37℃，180r/min)1d后，取50μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加入等体积的Salkowski比色液，并以加入50μL未接菌的YMA液体培养基与等体积比色液的混合溶液为对照。将白色陶瓷板于室温避光放置10min后观察，颜色变粉红者为阳性，表示能够分泌IAA，颜色越深表示分泌的强度越大，不变色为阴性，表示不能分泌IAA。

产IAA菌株定量测定：对初筛获得的能分泌IAA的细菌进行定量测定，培养条件同上。首先用分光光度法测定菌悬液的OD₆₀₀值，然后将菌悬液以10000r/min离心10min取上清液加入等体积Salkowski比色液，避光静置10min，测定其OD₅₃₀值。对照标准曲线计算单位体积发酵液中IAA的含量。标准曲线的绘制采用分析纯的IAA梯度稀释制备。分离得到一株产IAA含量较高的菌株，将其编号为MGPR1。

(3)安全性检测

将菌株MGPR1接种于血琼脂培养基中，37℃培养3d，观察有无溶血圈。有溶血圈出现代表菌株有溶血活性，对人畜有潜在威胁，则菌株应禁止应用于微生物肥料；若无溶血圈出现代表菌株无溶血活性，为安全菌种，可作为微生物肥料应用菌种。

(4)其他功能特征筛选

将菌株MGPR1接种于PKO无机磷培养基，蒙金娜有机磷培养基，解钾培养基以及CAS产铁载体培养基中，37℃培养3d，若菌体四周出现透明圈或晕圈，则表明菌株有相关的促生特性；若无透明或晕圈，则表明菌株无相应能力。

(5)抗逆性检测

将菌株MGPR1接于耐盐、耐酸碱培养基中，37℃培养3d，观察细菌生长情况。

(6)耐干旱

将菌株MGPR1接于耐干旱培养基中，37℃培养3d，观察细菌生长情况。

(7)耐药性

将菌株MGPR1接于耐农药培养基中，37℃培养3d，观察细菌生长情况。

(8)16s rDNA序列测序鉴定

利用Trelief^TM Plant Genomic DNA kit(TsingKe)试剂盒提取菌体DNA，并对16srDNA序列进行PCR扩增，所用正向引物为16s rDNA P1，反向引物为16s rDNA P6。扩增反应条件为：95℃5min；94℃1min，60℃30s，72℃90s，进行30个循环；最后72℃终延伸10min。PCR扩增产物检测合格后送至北京美吉桑格生物医药科技有限公司进行测序。

二、结果分析

1、菌株基本特征

菌株MGPR1接种于LB液体培养基，37℃，180r/min的培养箱中振荡培养24-36小时，该菌株可产芽孢；在LB固体培养基37℃恒温培养48h，观察其菌落形态，菌落呈淡黄色，圆形，表面光滑不透明，边缘缺刻，有时微皱；革兰氏染色为阳性，菌体杆状，具有端生鞭毛，运动，无夹膜，芽孢中生，椭圆形(图1)。

2、安全性检测结果

菌株MGPR1在血琼脂平板上培养3d，不出现溶血圈，溶血活性为阴性。

3、功能特征结果

功能特征鉴定结果如表3所示。芽孢杆菌MGPR1产IAA定性分析图如图2所示。IAA标准品以不同显色浓度绘制出的IAA标准曲线如图3所示。芽孢杆菌MGPR1在解钾培养基上培养3d解钾圈图示如图4所示。芽孢杆菌MGPR1在CAS培养基上培养3d产铁载体图示如图5所示。

表3菌株MGPR1的功能特征鉴定结果

功能特征	定性分析	可溶性指数(D/d)	定量分析
				产IAA能力	++		58.03μg/ml
溶有机磷能力	-	—	—
				溶无机磷能力	-	—	—
解钾能力	++	2.34	—
				产铁载体能力	+	1.41	—

注：+号表示阳性；-号表示阴性；+号越多代表能力越强；—表示未测。

4、抗逆性结果

如表4所示。

表4菌株MGPR1的抗逆性鉴定结果

抗逆性	菌株生长情况
		耐盐7％	++
耐酸pH4	-
		耐酸pH5	+
耐碱pH10	++
		耐干旱30％PEG	+

注：+表示菌株生长；-表示菌株未生长；++代表菌株生长情况比+更好。

5、耐药性结果

如表5所示。

表5菌株MGPR1的耐药性鉴定结果

注：+表示菌株生长；-表示菌株未生长；+号越多代表菌株生长情况越好。

6、菌株16s rDNA序列测序结果

双端测序序列用DNAMAN软件进行拼接，共1456bp，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。得到的16s rDNA序列(SEQ ID No.1)在NCBI网站进行BLAST比对，结果显示该菌株与Bacillus megaterium strain NPJ1相似性最高，同源性为100％。

鉴于以上对菌株MGPR1的鉴定结果，确定该菌为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。将该菌株于2018年12月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCCNo.17040。

实施例2、芽孢杆菌MGPR1的田间应用

一、芽孢杆菌MGPR1的田间应用方法

1、菌株活化及扩大培养：将保藏于-80℃冰箱的芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1CGMCC No.17040菌种采用三区划线方式活化于LB固体培养基，放于37℃恒温培养箱培养24小时，分离单菌落。将单菌落用无菌竹签挑至添加色氨酸(0.1mg/ml，作用：合成IAA的底物)的LB液体培养基中扩大培养，放于37℃，180转/分的摇床振荡培养至菌液OD₆₀₀＝1.5(以不接菌培养基为空白对照，菌液浓度为1×10^10-11cfu/ml)；

2、使用前在菌剂中滴加微量元素(1μL/ml，作用：增加营养提高细菌活性)混匀。微量元素液组成如下：H₃BO₃ 2.86g/L，MnSO₄ 1.81g/L，CuSO₄·5H₂O 0.80g/L，ZnSO₄ 0.22g/L，H₂MoO₄ 0.02g/L，将以上物品依次加入适量水中全部溶解后，用去离子水补足1L。

3、包菌剂：将混匀的菌液均匀喷在种子表面至种子表面湿润即可，放在阴凉处阴干；

4、包保护剂：阴干的种子用1％的羧甲基纤维素钠溶液(配制方法：10g羧甲基纤维素钠(800～1200mPa·s)溶于1L去离子水，在60℃水浴中搅拌溶解至透明糊状胶液)拌种包衣(50ml/kg)，保持菌剂附着和湿度，阴干；

5、人工或机器播种(建议播后浇水，保证菌株必要的湿度利于生存)。

二、芽孢杆菌MGPR1田间应用实例

试验地点设在吉林省四平市梨树县三棵树村；所选用玉米品种为当地普遍使用的品种郑单958；播种日期为2018年4月30日，播后浇水(即2018年5月1日浇水)；试验田分为三部分，低氮区、缺磷区和正常施肥区。氮磷区各850.5平方米，正常施肥区56.7平方米。低氮区施氮肥为尿素，施用量是正常施肥的一半，120kg N ha^-1；磷肥为过磷酸钙，正常施用量为85kg P₂O₅ha^-1；钾肥为氯化钾，正常施用量为67.5kg K₂Oha^-1，全部作为基肥混匀后一次性施入土壤；缺磷区不施磷肥，氮钾肥为正常施用量(同上)；正常施肥区正常施肥，不做接种生物菌剂处理，为阳性对照区CK⁺。其他两个肥料处理区都做接种生物菌剂处理，所用生物菌剂为芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1CGMCC No.17040。设不接种为阴性对照CK^-，每种处理三个重复。

筛选结果为芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1CGMCC No.17040在玉米不同生长发育阶段均可提高玉米植株的生物量以及最终产量，该菌促生效果显著高于CK^-，且与阳性对照CK⁺无显著差异，田间实验结果进一步证明此芽孢杆菌MGPR1可作为开发稳定高效的微生物肥料菌种资源。具体结果如表6至表9所示(表中同列标注不同字母表示彼此之间差异显著)：

表6应用MGPR1菌剂玉米苗期生物量一览表

表7应用MGPR1菌剂玉米拔节期生物量一览表

表8应用MGPR1菌剂玉米吐丝期生物量一览表

表9应用MGPR1菌剂玉米成熟期生物量一览表

<110> 中国农业大学

<120> 一株能减少氮磷肥施用的玉米高效促生菌及其应用

<130> GNCLN190311

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1456

<212> DNA

<213> Bacillus sp.

<400> 1

ggggcgggcg tgcctataca tgcagtcgag cgaactgatt agaagcttgc ttctatgacg 60

ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg caacctgcct gtaagactgg gataacttcg 120

ggaaaccgaa gctaataccg gataggatct tctccttcat gggagatgat tgaaagatgg 180

tttcggctat cacttacaga tgggcccgcg gtgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240

caccaaggca acgatgcata gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300

acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360

acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttaggga 420

agaacaagta caagagtaac tgcttgtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480

aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg 540

cgtaaagcgc gcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg 600

agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagaa aagcggaatt ccacgtgtag 660

cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcggcttt ttggtctgta 720

actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac 780

gccgtaaacg atgagtgcta agtgttagag ggtttccgcc ctttagtgct gcagctaacg 840

cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg 900

ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 960

gtcttgacat cctctgacaa ctctagagat agagcgttcc ccttcggggg acagagtgac 1020

aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080

gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt tagttgggca ctctaaggtg actgccggtg 1140

acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200

acacgtgcta caatggatgg tacaaagggc tgcaagaccg cgaggtcaag ccaatcccat 1260

aaaaccattc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagct ggaatcgcta 1320

gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380

cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtgagtaa ccgtaaggag ctagccgcct 1440

aaggtgacag aagaat 1456

Claims

1.芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.17040。

2.一种菌剂，其活性成分为权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1。

3.权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1在作为植物根际促生菌中的应用。

4.权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1或权利要求2所述的菌剂在制备用于促进植物生长的产品中的应用。

5.权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1的田间应用方法，包括如下步骤：

(A1)向权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1的菌液中添加微量元素；

(A4)播种。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(A1)中，所述芽孢杆菌(Bacillussp.)MGPR1的菌液是采用添加有终浓度为0.1mg/ml的色氨酸的LB液体培养基培养所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1所得；所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1在所述菌液中的浓度为1×10^10-11cfu/ml；

和/或

步骤(A1)中，所述微量元素是以微量元素溶液的形式添加到所述菌液中的；所述微量元素液的组成如下：H₃BO₃ 2.86g/L，MnSO₄ 1.81g/L，CuSO₄·5H₂O 0.80g/L，ZnSO₄ 0.22g/L，H₂MoO₄ 0.02g/L，余量为水；向所述菌液中添加的所述微量元素液的量为每mL所述菌液添加1μL所述微量元素液；

和/或

步骤(A3)中，所述1％的羧甲基纤维素钠溶液为含有终浓度为10g/L的羧甲基纤维素钠的水溶液；所述1％的羧甲基纤维素钠溶液的用量为每kg种子用50mL所述1％的羧甲基纤维素钠溶液；

和/或

步骤(A4)中，在进行完所述播种后还包括浇水的步骤。

7.权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1或权利要求2所述的菌剂或权利要求5或6所述的方法在促进植物生长中的应用。

8.根据权利要求3-7中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述促进植物生长为在氮胁迫和/或磷胁迫的土壤中促进植物生长；

进一步地，所述氮胁迫是氮肥施用量为正常施用量的一半；所述磷胁迫是不施用磷肥。

9.根据权利要求1-8中任一所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGPR1或菌剂或应用或方法，其特征在于：所述植物为粮食作物；

进一步地，所述粮食作物为玉米。

10.根据权利要求3-9中任一的应用或方法，其特征在于：所述促进植物生长体现为如下中的全部或部分：

(B1)在所述植物的不同发育时期促进所述植物的株高增加；

(B5)促进所述植物的百粒重增加；

(B6)促进所述植物的穗粒数增加；

(B7)促进所述植物的产量增加；

进一步地，所述不同发育时期为如下中的任一种：苗期、拔节期、吐丝期、成熟期。