CN110590417B

CN110590417B - 一种短小芽孢杆菌菌肥及其应用

Info

Publication number: CN110590417B
Application number: CN201910707171.0A
Authority: CN
Inventors: 张新慧; 张晓佳; 郎多勇; 张文晋; 张瑜; 崔高畅; 赵建军; 赵云生
Original assignee: Ningxia Medical University
Current assignee: Ningxia Medical University
Priority date: 2019-08-01
Filing date: 2019-08-01
Publication date: 2021-12-17
Anticipated expiration: 2039-08-01
Also published as: CN110590417A

Abstract

本发明公开了一种短小芽孢杆菌菌肥及其应用。本发明提供了短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus))G5 CGMCC No.16879在增强植物的碳氮代谢中的应用。本发明短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)G5对于提高农产品产量、改善农产品品质、减少化肥用量、降低成本、改良土壤、保护生态环境具有重要意义。

Description

一种短小芽孢杆菌菌肥及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域、农业领域，特别涉及一种短小芽孢杆菌菌肥及其应用。

背景技术

随着社会的发展，人们对环境污染、食品安全以及人体健康日益重视；而农业生产中化肥、农药的大量使用，不但造成了环境污染、农产品质量下降，还造成了农药和重金属等有害物质超标，严重危害了人体健康。2015年农业部提出了到2020年实现化肥、农药使用量零增长目标，大力推进化肥农药减量增效，引领种植业发展方式转变，其中推广应用微生物菌剂就是实现此目标的重要组成部分，一方面可使农业资源得到充分的利用，另一方面农业微生物的广泛使用可以大大减少化学农药、化肥的使用量，减少环境污染，降低生产成本，提高农产品的品质和效益，增加农产品的市场竞争力，为农业产业结构的调整和创汇提供新的生物产量和资源。

很多地区存在严重的干旱、盐碱胁迫，在这种胁迫下植物自身难以获得高的产量及质量，因此寻找保证植物质量及产量又对生态环境友好的办法迫在眉睫。微生物肥料是以活性微生物的生命活动导致作物得到所需养分的一种新型肥料生物制品。它是一种低炭、纯天然、无毒、无害、无污染的有机微生物菌剂，具有提高土壤肥力、增加土壤中有益微生物数量及活性、改善土壤活化性状、防止土壤板结，提高土壤保肥、保水能力等，促进作物生长、提高作物产量、改善和还原农产品品质等功能。

发明内容

本发明的目的是提供一种短小芽孢杆菌菌肥及其应用。

第一方面，本发明要求保护短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)G5或含有所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)G5的菌剂在如下任一中的应用：

(A1)增强植物的碳氮代谢；

(A2)制备用于增强植物的碳氮代谢的产品；

所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)G5在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.16879。

第二方面，本发明要求保护短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)G5或含有所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)G5的菌剂在如下任一中的应用：

(B1)提高植物体内硝酸还原酶(NR)酶活，或制备用于提高植物内体硝酸还原酶酶活的产品；

(B2)提高植物体内蔗糖转化酶(INV)酶活，或制备用于提高植物体内蔗糖转化酶酶活的产品；

第三方面，本发明要求保护短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)G5或含有所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)G5的菌剂在如下任一中的应用：

(C1)增加植物产量，或制备用于增加植物产量的产品；

(C2)改善植物品质，或制备用于改善植物品质的产品；

(C3)在植物栽培过程中减少化肥用量，或制备用于在植物栽培过程中减少化肥用量的产品；

(C4)改良土壤，或制备用于改良土壤的产品；

第四方面，本发明要求保护短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)G5或含有所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)G5的菌剂在如下任一中的应用：

(C1)促进植物种子萌发，或制备用于促进植物种子萌发的产品；

(C2)提高植物的抗氧化能力，或制备用于提高植物的抗氧化能力的产品；

(C3)提高植物体内渗透调节物质的含量，或制备用于提高植物体内渗透调节物质的含量的产品；

第五方面，本发明要求保护短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)G5或含有所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)G5的菌剂在如下任一中的应用：

(D1)提高植物种子发芽率，或制备用于提高植物种子发芽率的产品；

(D2)提高植物种子发芽势，或制备用于提高植物种子发芽势的产品；

(D3)提高植物种子发芽指数，或制备用于提高植物种子发芽指数的产品；

(D4)提高植物幼苗活力指数，或制备用于提高植物幼苗活力指数的产品；

(D5)提高植物体内谷胱甘肽含量，或制备用于提高植物体内谷胱甘肽含量的产品；

(D6)提高植物体内抗坏血酸含量，或制备用于提高植物体内抗坏血酸含量的产品；

(D7)提高植物体内可溶性糖含量，或制备用于提高植物体内可溶性糖含量的产品；

(D8)提高植物体内可溶性蛋白含量，或制备用于提高植物体内可溶性蛋白含量的产品；

在上述各方面中，所述菌剂的活性成分为所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)G5，还可含有其他辅料、助剂等。

进一步地，在本发明中所述菌剂为液体微生物菌剂。

更进一步地，所述液体微生物菌剂为将所述的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus))G5置于发酵培养基中培养后所得的发酵液。

具体地，在所述液体微生物菌剂中，所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus))G5的含量为495亿cfu/mL。

在本发明的具体实施方式中，所述发酵培养基的pH为7.0，溶剂为水，溶质及浓度如下：麦芽糖4.0％，大豆蛋白胨3.0％，KH₂PO₄ 0.01％；％均表示g/100mL。所述培养的温度为34℃，时间为42h。培养过程中的摇床转速230r/min。

发芽率(％)＝(发芽种子数/供试种子数)×100％；

发芽势(％)＝(规定日期内发芽种子数/供试种子数)×100％；

发芽指数＝Σ(第几日的发芽数/发芽试验第几日)。

幼苗活力指数＝幼苗生长量(长度或重量)*发芽指数。

在上述各所述应用中，接菌方式是将植物种子浸泡在前文第二方面中所述的液体微生物菌剂中。进一步地，将所述植物种子浸泡在所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)G5含量为495亿cfu/mL的所述液体微生物菌剂的100倍稀释液中6-8小时。

更进一步地，在将所述植物种子浸泡在所述液体微生物菌剂中之前还可包括对所述植物种子进行表面消毒灭菌的步骤。

在本发明中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。进一步地，所述双子叶植物可为甘草属植物。更进一步地，所述甘草属植物可为豆科植物。在本发明的具体实施方式中，所述植物具体为豆科植物甘草。

在前文第四至六方面所述的应用中，为正常条件、盐胁迫条件或者干旱胁迫条件下，所述增强植物的碳氮代谢、所述提高植物体内硝酸还原酶(NR)酶活、所述提高植物体内蔗糖转化酶(INV)酶活、所述促进植物种子萌发(提高种子活力)、所述提高植物的抗氧化能力、所述提高植物体内渗透调节物质的含量、所述提高植物种子发芽率、所述提高植物种子发芽势、所述提高植物种子发芽指数、所述提高植物幼苗活力指数、所述提高植物体内谷胱甘肽(GSH)含量、所述提高植物体内抗坏血酸(AsA)含量、所述提高植物体内可溶性糖含量和/或所述提高植物体内可溶性蛋白含量。

进一步地，所述盐胁迫为150mmol/L NaCl；所述干旱胁迫为10％PEG。

实验证明，本发明所提供的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)G5能够增强植物碳氮代谢、促进植物种子萌发、提高植物的抗氧化能力、提高植物体内渗透调节物质的含量，并且本发明研究科学的利用微生物资源，考虑实际生产及市场需求研发出一款具有提高植物抗逆性的微生物肥料。本发明对于提高农产品产量、改善农产品品质、减少化肥用量、降低成本、改良土壤、保护生态环境具有重要意义。

保藏说明

菌株名称：短小芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus pumilus

参椐的生物材料(株)：G5

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2018年12月6日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.16879

附图说明

图1为不同处理组间甘草幼苗胚根长度、胚根粗度、胚芽长度、胚芽粗度的结果。

图2为不同处理组间甘草幼苗发芽率。

图3为不同处理组间甘草幼苗发芽势。

图4为不同处理组间甘草幼苗发芽指数。

图5为不同处理组间甘草幼苗活力指数。

图6为不同处理组间甘草抗氧化系统变化。

图7为不同处理组间甘草碳氮代谢过程中NR、INV酶活。

图8为不同处理组间甘草渗透调节物质变化。

各图中，不同小写字母间表示差异显著。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明所涉及的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)G5是从采集来的乌拉尔甘草中分离得到的一株内生菌，经过形态学和生理生化特性鉴定，以及通过16SrDNA核糖体数据库的比对，其同源性最高的菌种为CTSP17；EU855198、CTSP18；EU855199、CTSP19；EU855200、CTSP20；EU855201，最终鉴定该菌株G5为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。该菌株已经于2018年12月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.16879。

实施例1、短小芽孢杆菌G5液体微生物菌剂的制备

1、菌种活化

将实施例1分离得到的短小芽孢杆菌G5菌株转接到NA固体培养基，37℃恒温培养48h，备用。

2、种子液的制备

挑取单菌落，接入装量为250mL NB培养基的250mL三角摇瓶中，置于控温摇床，30℃，170r/min培养24h，备用。

3、发酵培养基制备

发酵培养基采用本课题组前期改良后的短小芽孢杆菌专用发酵培养基：以麦芽糖用量4.0％，大豆蛋白胨用量3.0％，无机盐KH₂PO₄用量0.01％，其余为水制备发酵培养基，培养基pH7.0，装液量为100/250mL三角摇瓶。％均表示g/100mL。

4、菌种发酵培养

将步骤2所得种子液以2％(体积比)接种量接入步骤3配制的发酵培养基中，摇床转速230r/min，培养温度34℃，培养42h后所得发酵液即为液体微生物菌剂。

5、液体微生物菌剂

步骤4所得的液体微生物菌剂，其中短小芽孢杆菌G5的有效活菌数高达495亿cfu/mL(国家标准液体型微生物菌剂要求有效活菌数(cfu)，≥2.0亿cfu/mL)。

实施例2、短小芽孢杆菌G5液体微生物菌剂对植物的促生作用

一、材料

甘草种子收获于2017年，经宁夏医科大学药学院张新慧教授鉴定为甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)种子。净种后，将其装入牛皮纸袋置于冰箱冷藏室贮藏。

液体微生物菌剂：实施例1制备的短小芽孢杆菌G5的液体微生物菌剂。

二、种子预处理

本试验精选籽粒饱满、大小均一的甘草种子，先用85％浓H₂SO₄浸润45min，不定时搅拌，然后用蒸馏水冲洗3遍，再用0.1％的H₂O₂消毒10min，最后用蒸馏水冲洗数次至无黏性，洗净后置于烧杯中，用蒸馏水浸泡6-8h使种子充分吸水，待用。

三、实验设计

通过水培发芽试验，采用完全随机设计，盐基采用中性盐NaCl，浓度为150mmol/L；干旱采用10％PEG。

处理分别为对照(CK)、盐胁迫(S)、对照加菌(CK+B)、盐胁迫加菌(S+B)，干旱胁迫(D)，干旱胁迫加菌(D+B)。

加菌方式为浸种，将液体微生物菌剂稀释100倍浸泡种子6-8h。

选取充分吸水、饱满均一的甘草种子，吸干表面水分，将其均匀摆放在垫有双层无菌滤纸并加入5mL不同处理溶液的培养皿(9cm×9cm×3cm)中进行萌发，每皿40粒。实验条件为光照/黑暗(12/12h，28/20℃)。每天用称重法加蒸馏水至恒质量以保持恒定的处理液浓度。

实验开始第二天测定发芽数，到第六天基本发芽结束，第九天开始采样，采样过程中开始测定生长指标，测定幼苗胚芽、胚根长度、粗度，测定幼苗中抗氧化指标谷胱甘肽(GSH)含量、抗坏血酸(AsA)含量、渗透物质可溶性糖、可溶性蛋白的含量、碳氮代谢过程中硝酸还原酶(NR)、蔗糖转化酶(INV)酶活。

四、实验方法

1、发芽指标测定

发芽率(％)＝(发芽种子数/供试种子数)×100％；

发芽势(％)＝(规定日期内发芽种子数/供试种子数)×100％；

发芽指数＝Σ(第几日的发芽数/发芽试验第几日)。

幼苗活力指数＝幼苗生长量(长度或重量)*发芽指数。

2、生长指标测定

用直尺测定甘草胚芽、胚根长度，游标卡尺测定胚芽、胚根的粗度等生长状况。

3、抗氧化指标测定

A.谷胱甘肽(GSH)含量测定采取分光光度法：

(1)标曲：1μg/ml GSH取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml分别加PBS 0.2ml，TDNB 0.2ml，混匀后室温显色5min，补水2.6、2.4、2.2、2、1.8、1.6ml至3ml，测OD₄₂₀。

(2)提取测定：0.5g叶片加4ml浓度为5mmol/L的EDTA-TCA(3％TCA配制)研磨，离心，取上清液1ml加0.4ml浓度为1mol/L的NaOH调pH6.5-7，加0.2ml浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH7)和0.2ml浓度为0.01mol/L的DTNB(50mmol/L磷酸盐缓冲液配制，DTNB即5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸))，混匀后室温显色5min，加水2ml，测OD₄₂₀。

GSH(μg/g FW)＝C×Vt/Vs/FW。

其中，C为从标曲中查得的GSH的浓度；Vt为提取液体积；FW为样品的质量；Vs为测定时所用样品的体积。

B.抗坏血酸(AsA)含量测定

(1)标曲：10mg/L AsA各取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml分别加入1ml浓度为5％的TCA和1ml乙醇，0.5ml浓度为0.4％的H₃PO₄-乙醇(即用乙醇作溶剂，以H₃PO₄ 0.4％的体积比溶解于乙醇中)，1.0ml浓度为0.5％的BP(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉-乙醇)，0.5ml浓度为0.03％的FeCl₃-乙醇，补1、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml。30℃反应90min，测OD₅₃₄。

(2)提取测定：0.5g叶片加4ml浓度为5％的TCA，研磨，离心，上清液取1ml加入1ml浓度为5％的TCA，1ml乙醇，0.5ml浓度为0.4％的H₃PO₄-乙醇，1.0ml浓度为0.5％的BP(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉-乙醇)，0.5ml浓度为0.03％的FeCl₃-乙醇，30℃反应90min，测OD₅₃₄。以标准曲线计算AsA含量。

4、碳氮代谢指标测定

A.硝酸还原酶(NR)活性测定

植物从土壤中吸收的NO₃ ^-必须经代谢性还原才能被利用，因细胞组分中的N均呈高度还原态，而NO₃ ^-中的N为高度氧化态。

NR是硝酸盐同化中的第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对植物产量和品质有重要影响，因而NR活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一。

(1)硝酸还原酶(NR)活性测定所需试剂

亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO₂ 0.9857g溶于无离子水后定容至1000mL，然后再从刚刚的1000ml中吸取5mL定容至1000mL，即为含亚硝态氮的1μg/mL的标准液。

0.1mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液：Na₂HPO₄·12H₂O 30.0905g与NaH₂PO₄·2H₂O2.4965g，加无离子水溶解后定容至1000mL。

1％磺胺溶液：1.0g磺胺溶于100mL浓度为3mol/L的HCl(25mL浓盐酸加水定容至100mL即为3mol/L HCl)中。

0.02％萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100mL无离子水中，贮于棕色瓶中。

0.1mol/L KNO₃磷酸缓冲液：2.5275g KNO₃溶于250mL 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液。

0.025mol/L pH8.7的磷酸缓冲液：8.8640g Na₂HPO₄·12H₂O，0.0570g K₂HPO·3H₂O溶于1000mL无离子水中。

提取缓冲液：0.1211g半胱氨酸、0.0372g EDTA溶于100mL浓度为0.025mol/L pH8.7的磷酸缓冲液中。

(2)标准曲线制作：取7支洁净烘干的15mL刻度试管按表1顺序加入试剂，配成含有0～2.0μg亚硝态氮的系列标准溶液。摇匀后在25℃下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮(μg)为横坐标(x)，吸光度值为纵坐标(y)建立回归方程。

表1制作标准曲线时各溶液加入量

(3)样品中硝酸还原酶活力测定

第一步，酶的提取：称取0.5g鲜样(叶与根均可)，剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻30min，取出置冰浴中加少量石英砂及4mL提取缓冲液，研磨匀浆，转移于离心管中在4℃、4000r/min下离心15min，上清液即为粗酶提取液。

第二步，酶的反应：取粗酶液1mL于10mL试管中，加入1.2mL 0.1mol/L KNO₃磷酸缓冲液混匀，在25℃水浴中保温30min。

第三步，终止反应和比色测定：保温结束后立即加入1mL上述的1％磺胺溶液终止酶反应，再加1mL上述的0.02％萘基乙烯胺溶液，显色15min后于4000r/min下离心5min，取上清液在540nm下比色测定吸光度。根据回归方程计算出反应液中所产生的亚硝态氮总量(μg)。

(4)NR活性计算公式

B.蔗糖转化酶(INV)的测定

DNS试剂配制：将0.63gDNS和26.2mlNaOH(2mM)溶液，加到50mL含有18.2g酒石酸钾钠的热水中，再加0.5g结晶酚和0.5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至500ml，至于棕色瓶中备用。

标曲制备：取11支25ml的刻度试管，编号，按表2所示的量，精确加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液和3,5-二硝基水杨酸试剂。摇匀各管，沸水浴加热5min，取出后立即放人盛有冷水的烧杯中冷却至室温，以蒸馏水定容至25mL，充分混匀。在540nm波长下，用1号管调零，分别读取2号-11号比色管的吸光度(abs)。以abs为纵坐标，葡萄糖mg数为横坐标，绘制标准曲线图。

表2标准曲线试剂量

(1)酶的提取：0.5g(叶与根均可)剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100ml，在冰箱中浸提3小时，4000转离心15分钟，上清液即为酶的粗提液。

(2)酶活性的测定：吸酶液1ml，放入试管中(以煮沸酶液10分钟钝化酶的试管作对照)，加入pH6.0的缓冲液5ml及10％蔗糖溶液1ml，在37℃水浴中保温30分钟，取出后立即吸取2ml加入1.5ml的3,5-二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5分钟，冷却定容至20ml，测定540nm波长下的OD值，查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度：Y(μg/ml)。

(3)结果计算：

A＝Y×V/(T×W×1000)

A：转化酶的活性(mg/gfw/h)；

Y：上式计算得酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml)；

V：酶反应液的总体积；

T：反应时间0.5h；

W：材料鲜重(fw)；

一个处理3次重复。

所需试验台仪器：容量瓶(100ml)，刻度试管(20ml×4，1个对照)，移液管(5ml×l,2ml×l,1ml×1)，研钵。

所需试剂：

10％(w/v)蔗糖溶液现用现配：称取10g加入用蒸馏水定容至100ml。

5、渗透调节物含量的测定

A.可溶性蛋白的测定

(1)可溶性蛋白测定所需试剂

G-250考马斯亮蓝：100mg考马斯亮蓝溶于50ml 90％(V/V)乙醇，加入85％(质量浓度)H₃PO₄100ml，再用蒸馏水定容至1000ml，常温下保存1个月。

(2)样品提取

取样品(叶与根均可)0.5g放入预冷的研钵中磨碎后加入5ml提取液进一步充分研磨至匀浆，转移至10ml具塞刻度试管中，并分2次冲洗，3000r/min离心15min后上清液定容至10ml，取2ml离心管加入2ml上清液后12000r/min、4℃离心20min，4℃保存(2天内有效)。取上清液作为酶提取液。

(3)可溶性蛋白测定采取考马斯亮蓝G-250法

取酶液1ml(调零对照用蒸馏水替代)，蒸馏水0.9ml于试管中，加考马斯亮蓝G-250试剂5ml，充分混匀，放置2min后测定595nm波长吸光值。用牛血清蛋白作标准曲线。

样品可溶性蛋白含量(mg/g FW)＝C×V_T/V₁/W/1000

式中：C-查标准曲线所得每管蛋白质常量(mg)；V_T-提取液总体积(ml)；V₁-测定所取提取液体积(ml)；W-样品鲜量(g)。

标准曲线的制作：以牛血清蛋白(BSA)为标准蛋白质。称取100mg BSA，溶于蒸馏水并定容至100ml，则其浓度为1000μg/ml。按表3在6支具塞试管中分别加入BSA浴液和蒸馏水，配制成0-100μg/ml牛血清蛋白溶液各1ml，混匀后加入5ml考马斯亮蓝G-250浴液加盖塞，混匀，室温静置2min，在595nm处检测吸光度。以测得的吸光值为纵坐标，表中各管蛋白浓度为横坐标，做标准曲线。

表3标准曲线试剂用量

管号	1	2	3	4	5	6
							1000mg/LBAS(ml)	0	0.02	0.04	0.06	0.08	0.10
蒸馏水(ml)	1.00	0.98	0.96	0.94	0.92	0.90
							蛋白质(μg)	0	20	40	60	80	100

B.可溶性糖含量测定(蒽酮比色法)

实验步骤：称取0.5g植物鲜样(叶与根均可)剪碎混匀，放入试管，加入10ml蒸馏水，塑料薄膜封口，在沸水浴中提取30min，冷却后吸取提取液1ml，加入蒽酮浓硫酸试剂5ml，在沸水浴中加热1min，冷却后在630nm条件下测定吸光值。调零对照上清液用蒸馏水代替。用蔗糖标准液代替上清液制作标准曲(mlg)

可溶性糖含量％＝(C×V/V₁)/(W×10⁶)×100％

式中：C-查标准曲线值(μg)；V-提取液总体积(ml)；V₁-测定时所吸取样液的体积(ml)；W-样品重(g)。

标准曲线的制作：(1)1％蔗糖标准溶液：将分析纯蔗糖在80℃下烘干至恒重，精确称取1g，加蒸馏水溶解并定溶至100ml。(2)100μg/ml蔗糖标准液：精确吸取1％蔗糖标准液1ml至100ml容量瓶并用蒸馏水定溶至刻度。(3)取10ml刻度试管6支，从0-6分别编号，按表4加入100μg/ml蔗糖标准液和蒸馏水。(4)按顺序依次向试管中加入5mL蒽酮浓硫酸试剂，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中加热1min。冷却后在630nm条件下测定吸光值。以吸光度为横坐标，蔗糖浓度为纵坐标,绘制标准曲线。

所需试剂：

蒽酮浓硫酸试剂：1.0g蒽酮溶丁100ml浓硫酸中，贮于棕色瓶中(当日配登)。

表4标准曲线试剂用量

五、实验结果

不同处理组间甘草幼苗胚根长度、胚根粗度、胚芽长度、胚芽粗度的结果如图1所示，甘草胚根长度、胚根粗度、胚芽长度、胚芽粗度接种微生物菌剂后均有不同程度的增长，最高在干旱胁迫下接种菌剂较干旱胁迫下未接种菌剂甘草胚芽长度增长33％。

不同处理组间甘草幼苗发芽率如图2所示，甘草幼苗发芽率接种微生物菌剂后均有不同程度增长。

不同处理组间甘草幼苗发芽势如图3所示，甘草幼苗发芽势接种微生物菌剂后均有不同程度增长，最高在干旱胁迫下接种菌剂较干旱胁迫下未接种菌剂甘草的发芽势显著增长14％。

不同处理组间甘草幼苗发芽指数如图4所示，甘草幼苗发芽指数接种微生物菌剂后均有不同程度增长，最高在干旱胁迫下接种菌剂较干旱胁迫下未接种菌剂甘草的发芽指数显著增长15％。

不同处理组间甘草幼苗活力指数如图5所示，甘草幼苗活力指数接种微生物菌剂后均有不同程度增长，最高在干旱胁迫下接种菌剂较干旱胁迫下未接种菌剂甘草的幼苗活力显著可增长18％。

不同处理组间甘草抗氧化系统变化如图6所示，甘草抗氧化系统指标中GSH、AsA接种微生物菌剂后，对盐胁迫下的甘草幼苗的影响尤为显著。盐胁迫下接种菌剂甘草幼苗中GSH含量较未接种菌剂显著提高44％，AsA含量较未接种菌剂显著提高64％。

不同处理组间甘草碳氮代谢过程中NR、INV酶活如图7所示，接种微生物菌剂后甘草幼苗碳氮代谢过程指标中NR、INV，对盐胁迫、干旱胁迫下的甘草幼苗均有显著影响，干旱胁迫下接种菌剂甘草幼苗中NR酶活性较干旱胁迫下不接种菌剂显著增加77％，盐胁迫下接种菌剂INV酶活性较盐胁迫下未接种菌剂显著增加445.5％。

不同处理组间甘草渗透调节物质变化如图8所示，在接种微生物菌剂后，甘草渗透调节物质指标中可溶性糖、可溶性蛋白，对盐胁迫下的甘草幼苗的影响尤为显著。盐胁迫下接种菌剂甘草幼苗中可溶性糖含量较未接种菌剂显著提高140％，可溶性蛋白含量较未接种菌剂显著提高45％。

Claims

1.含有所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）G5的菌剂在增强植物的碳氮代谢中的应用；

所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）G5在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.16879；

所述菌剂为液体微生物菌剂；

所述液体微生物菌剂为将所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)）G5置于发酵培养基中培养后所得的发酵液；

所述发酵培养基的pH为7.0，溶剂为水，溶质及浓度如下：麦芽糖4.0%，大豆蛋白胨3.0%，KH₂PO₄ 0.01%；%均表示g/100mL；

所述培养的条件为：34℃摇床震荡培养42h；摇床转速230r/min；

在所述液体微生物菌剂中，所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)）G5的含量为495亿cfu/mL；

所述应用为应用于盐胁迫条件或者干旱胁迫条件。

2.含有所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）G5的菌剂在如下任一中的应用：

（B1）提高植物体内硝酸还原酶酶活；

（B2）提高植物体内蔗糖转化酶酶活；

所述菌剂为液体微生物菌剂；

所述培养的条件为：34℃摇床震荡培养42h；摇床转速230r/min；

所述应用为应用于盐胁迫条件或者干旱胁迫条件。

3.含有所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）G5的菌剂在如下任一中的应用：

（C1）促进植物种子萌发；

（C2）提高植物的抗氧化能力；

（C3）提高植物体内渗透调节物质的含量；

所述菌剂为液体微生物菌剂；

所述培养的条件为：34℃摇床震荡培养42h；摇床转速230r/min；

所述应用为应用于盐胁迫条件。

4.含有所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）G5的菌剂在如下任一中的应用：

（D1）提高植物种子发芽率；

（D2）提高植物种子发芽势；

（D3）提高植物种子发芽指数；

（D4）提高植物幼苗活力指数；

（D5）提高植物体内谷胱甘肽含量；

（D6）提高植物体内抗坏血酸含量；

（D7）提高植物体内可溶性糖含量；

（D8）提高植物体内可溶性蛋白含量；

所述菌剂为液体微生物菌剂；

所述培养的条件为：34℃摇床震荡培养42h；摇床转速230r/min；

所述应用为应用于盐胁迫条件。

5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述应用中，接菌方式是将植物种子浸泡在所述液体微生物菌剂中。

6.一种如权利要求1中所用的短小芽孢杆菌的液体微生物菌剂。