CN110373334B - 棘孢木霉hn082102及其应用 - Google Patents

棘孢木霉hn082102及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及的是棘孢木霉HN082102及其应用，这株棘孢木霉（Trichodema asperellum）HN082102，该菌株的保藏编号为CGMCC No.17977。本发明所提供的棘孢木霉菌株具有良好的促进种子萌发、促进作为根部生长以及解除盐对作物生长抑制作用的效果，在NaCl含量3%的PDA上生长72小时后，菌丝长度为8.5厘米；在NaCl含量5%的PDA上生长120小时后，菌丝长度为8.5厘米；在NaCl含量7%的PDA上生长168小时后，菌丝长度为8.1厘米；在NaCl含量9%的PDA上生长168小时后，菌丝长度为5.04厘米。

Description

棘孢木霉HN082102及其应用
一、技术领域
本发明首次发现了一株棘孢木霉HN082102，该菌株的拉丁文分类命名为：Trichodema asperellum，该菌株已于2019年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号：CGMCC No.17977。
本发明涉及的是用于农业生产的棘孢木霉菌，具体涉及的是棘孢木霉HN082102及其应用。
二、背景技术
由于人为破坏，造成土地环境的不断恶化，土壤的荒漠化和盐碱化越来越严重，人类拥有的耕地资源越来越少。据不完全统计，全球盐碱化面积为9.5411亿公顷，我国盐碱化面积为9913万公顷，占比重为10.4％，且呈逐年增加的趋势。我国盐碱土和盐碱化的形成，使得植物无法存活。土壤盐碱化往往导致植物的新陈代谢和光合作用受到影响，减少植物对养分和微量元素的摄取。
木霉菌是一种生防木霉菌，能促进植物生长，同时可以有效解除盐对植物的胁迫作用。因此，寻找耐盐的新的木霉菌株将对农业生产，特别对盐渍化土壤的利用来讲具有重要的意义。
三、发明内容
本发明的一个目的是提供棘孢木霉HN082102，这株棘孢木霉HN082102用于促进农作物根部生长、抑制植物病原菌生长；本发明的另一个目的是提供这株棘孢木霉HN082102的应用。
本发明采用的技术方案是：这株棘孢木霉(Trichodema asperellum)HN082102，该菌株的保藏编号为CGMCC No.17977。
上述方案中棘孢木霉(Trichodema asperellum)HN082102的几丁质酶活为1.2043U/ml，β-1，3-葡聚糖酶为0.7854U/ml。
上述方案中棘孢木霉(Trichodema asperellum)HN082102的耐盐性能力为：在NaCl含量3％的PDA上生长72小时后，菌丝长度为8.5厘米；在NaCl含量5％的PDA上生长120小时后，菌丝长度为8.5厘米；在NaCl含量7％的PDA上生长168小时后，菌丝长度为8.1厘米；在NaCl含量9％的PDA上生长168小时后，菌丝长度为5.04厘米，具有较好的耐盐能力。
所述的棘孢木霉(Trichodema asperellum)HN082102解除盐对作物生长抑制作用的影响。
上述棘孢木霉(Trichodema asperellum)HN082102用于促进农作物根部生长。
上述棘孢木霉(Trichodema asperellum)HN082102用于抑制植物病原菌生长。
上述方案中植物病原菌为香蕉枯萎病菌、芒果炭疽病菌、番茄灰霉病菌中的任意一种或多种。
有益效果：
本发明所提供的棘孢木霉菌株具有良好的促进种子萌发、促进作为根部生长以及解除盐对作物生长抑制作用的效果。
保藏说明
菌种名称：棘孢木霉HN082102；
拉丁名：Trichodema asperellum；
保藏编号：CGMCC No.17977；
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院；
保藏日期：2019年6月19日。
四、附图说明
图1为本发明棘孢木霉菌株β-1,3-葡聚糖酶活性测定所用葡萄糖标准曲线；
图2为本发明棘孢木霉菌株几丁质酶活性测定所用N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线。
图3对豇豆解除盐的抑制作用。
图4棘孢木霉HN082102解除盐对豇豆生长的影响。
五、具体实施方式：
下面结合具体实施例详细描述本发明，所述实施例用于理解而不是限制本发明。
一株新的棘孢木霉(Trichodema asperellum)HN082102，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.17977。
这株棘孢木霉(Trichodema asperellum)HN082102菌丝在PDA平板上初期菌落为白色，丝状分布，分生孢子初期为白色棉团状，中期转为黄绿色，后期分生孢子呈绿色。孢子呈圆形或椭圆形，壁光滑，分生孢子梗常呈现对称分布，瓶梗与主轴夹角约90°距顶端较远处可产生至多三级分枝，瓶梗直、安瓿形、中间稍有加粗，基部缢缩，有椰子香味。
实施例1：棘孢木霉HN082102的分离和保藏
1、棘孢木霉菌株HN082102，采集自海南省东方市的海边海泥水中，于海南大学1507实验室分离获得。
土样采集：土壤的采集选用五点对角线取样法。即在采集地块的对角线选5等分点，然后用深度25cm的的取土器在每一个点钻取约15-20cm的土样，再将5份土混合均匀，四分法取约50g的土样装入自封袋。在实验室内分装到50ml的塑料瓶中，4℃保存待用。
木霉菌分离：采用稀释平板法，从冰箱中取10g土壤样品装入盛有90ml灭菌水和5-10粒直径4mm玻璃珠的三角瓶，然后在200r/min的摇床上摇30min。取5ml倒入盛有45ml灭菌水的三角瓶中，混匀后，再吸取5ml转入盛有45ml灭菌水的三角瓶中，充分混匀后吸取0.2ml于直径9cm的平板上，用涂布器涂抹均匀，放于28℃恒温培养箱中培养。48-72h后挑取产绿色分生孢子的菌落，转接到PDA平板上，28℃恒温培养箱中继续培养，待菌落直径长到4-5cm时再次转接PDA平板28℃恒温培养。
2、棘孢木霉菌株HN082102菌种保藏
棘孢木霉菌株HN082102于2019年6月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行真空冻干保藏，保藏编号为CGMCC No.17977，保藏期限为30年。
3、通过形态学鉴定结合分子生物学(基因测序)鉴定结果为棘孢木霉。ITS4序列见序列表1。
实施例2：β-1,3-葡聚糖酶活性测定
1、DNS试剂的配制:称取酒石酸钾钠91g溶于500mL蒸馏水中，向溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸3.15g和NaOH 20g，加热搅拌，使之溶解，再加入苯酚2.5g，无水亚硫酸钠2.5g，搅拌使之溶解，冷却后定容至1000mL，贮于棕色瓶中。
2、β-1，3-葡聚糖酶产酶培养基配制：酵母粉3g，NaNO3 0.3g，MgSO4·7H2O 0.05g，K2HPO4 0.1g，FeSO4·7H2O 0.001g，KCl 0.05g，用蒸馏水定容至100ml，121℃高压蒸汽灭菌。
3、葡萄糖标准曲线的制定
标准葡萄糖溶液：准确称取经105℃烘干至恒重的无水葡萄糖1000mg，溶于蒸馏水中，定容至1000mL，得到1mg/ml的葡萄糖标准溶液。取7支带刻度的试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2ml的葡萄糖溶液，后加入3mlDNS，最后定容至5ml，置于沸水中水浴5min，冷却后加蒸馏水定容至25ml，摇匀，于540nm波长下测OD值。以葡萄糖实际含量(mg/ml)为横坐标，OD值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，结果如附图1所示。
4、β-1，3-葡聚糖酶活性测定
将棘孢木霉HN082102接种PDA平板培养，48h后用直径5mm打孔器打取菌落边缘三块菌饼于PD培养液中。将100ml PD培养液装入250ml三角瓶，置于28℃，180rpm摇床培养。72h后用真空抽滤器抽干菌丝，取1g菌丝接种于100ml产酶培养基，置于28℃，180rpm摇床培养，设置三个重复。于第三天测定β-1，3-葡聚糖酶酶活。取粗酶液0.5ml，置于40℃水浴锅中预热2min后加入经40℃预热的0.1mg/ml的昆布多糖溶液lmL，50mM乙酸钠缓冲液(pH＝5)0.5ml，混匀。于40℃准确反应1h后，立即加入0.75mLDNS溶液以终止反应，混匀后沸水浴准确反应15min，立即取出放入冰水浴中冷却至室温，25℃放置2min，再加入5ml蒸馏水混匀。反应液混匀后，取150μl反应混合液加入96孔加样板，在540nm测定吸光度，与标准曲线对比，计算酶活数值。
一个β-1,3-葡聚糖酶酶活单位定义：在特定条件下(40℃，pH＝5)，以1h催化分解昆布多糖产生l u g葡萄糖酶量。
表1棘孢木霉HN082102的β-1,3-葡聚糖酶活性
Figure BDA0002155819110000051
本发明棘孢木霉菌株HN082102具有较好的β-1,3-葡聚糖酶活性。
实施例3：几丁质酶活性测定
1、胶态几丁质的制备：取10g几丁质加入少许蒸馏水研磨，然后溶解于375ml浓盐酸中。4℃冰箱放置24h，使几丁质完全溶解，然后用纱布过滤，滤液用蒸馏水定容至1000ml，并不断搅拌。3000rpm离心10min，弃上清液，沉淀用蒸馏水冲洗，溶解后再离心，反复操作10-15次直至溶液pH呈中性为止，最后定容至1000ml。
2、几丁质酶产酶培养基：几丁质0.5g，MgSO4·7H2O 0.06g，FeSO4·7H2O 0.01g，NH4NO3 0.3g，KH2PO4 0.2g，用蒸馏水定容至100ml，121℃高温灭菌。
3、N-乙酰葡萄糖标准曲线的制定：
配制N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)1mg/ml的标准溶液，取7支容积＞25ml试管，加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml试剂，后加入1.5mlDNS试剂，最后定容为5ml，将各管混匀，在沸水中准确加热5min，取出后立即用冷水冷却至室温，再向每个试管加入20ml蒸馏水，摇均。依次取混匀液150u L加入到96孔板中，使用酶标仪在540nm下按照NAG浓度从低到高测定吸光值，以NAG浓度(mg/mL)为横坐标，OD值为纵坐标，绘制出标准曲线，结果如附图2所示。
表2棘孢木霉HN082102的几丁质酶活性
Figure BDA0002155819110000061
本发明棘孢木霉菌株HN082102具有较高的几丁质酶活性。
实施例4：棘孢木霉(Trichodema asperellum)HN082102耐盐性测试.
将棘孢木霉HN082102接种于PDA平板上，28℃培养72-96h，分别从菌落边缘用5mm的打孔器打取菌饼，然后同时转接在不同盐浓度的PDA平上，将平板置于28℃培养，观察其生长状态。
表3棘孢木霉HN082102在不同盐浓度下菌丝生长长度
Figure BDA0002155819110000071
“+”、“++”、“+++”、“++++”分别表示孢子占培养皿面积的1/4，1/2，3/4，满皿；字母代表孢子颜色。“w，qg，yg，g”分别表示“白色，浅绿色，黄绿色，绿色”孢子颜色。
实施例5：棘孢木霉(Trichodema asperellum)HN082102解除盐对豇豆抑制作用的测定
如图3所示，田间播种豇豆，待豇豆叶片长出两片子叶后，选取生理状况相同的豇豆幼苗移植到盆栽里(图3左图)，定植7d后，进行盆栽实验，设计四个处理，菌、盐、菌+盐为试验组，清水处理(CK)为对照。将棘孢木霉HN082102制成孢子悬浮液浓度为107个/mL，每盆施加木霉孢子悬浮液100ml进行灌根处理，2d后在盆栽中施加200mL NaCl盐水溶液作为盐胁迫处理组，盐水浓度为300mmol/L；每处理40株豇豆幼苗，3次重复。在灌盐水后的第14d测定植株根部以上高度、根系根长(图4)。
A:只灌棘孢木霉HN082102；B:清水处理组(CK)；C：灌棘孢木霉HN082102和300mmol/L NaCl盐水溶液；D:300mmol/L NaCl盐水溶液处理。
实施例6：棘孢木霉(Trichodema asperellum)HN082102用于促进种子萌发。
孢子悬浮液制备：将棘孢木霉HN082102菌株接种于PDA平板，28℃培养72-96h后，然后用涂布器刮取PDA平板上的木霉孢子，制成孢子悬浮液浓度为1×107。
孢子悬浮液对种子萌发的影响：选健康和大小均一的黄瓜、青菜、水稻、甜瓜、番茄种子，经75％酒精消毒10min后，再用无菌水冲洗3次。每皿分别加入30粒黄瓜种子、50粒青菜种子、50粒水稻、30粒甜瓜和50粒番茄种子，然后向每个培养皿中分别加入孢子悬浮液15ml，使其完全没过种子，2h处理后，将处理后的种子放入垫有双层滤纸的直径为90mm的无菌培养皿中。以无菌水处理作为对照(CK)，共设置5个处理和1个对照，每个处理和对照重复3次。7d后测量发芽率。
表4本发明棘孢木霉HN082102促种子萌发效果
Figure BDA0002155819110000081
通过表4可以看出，本发明棘孢木霉HN082102能够提高种子萌发率，促进了种子萌发。
实施例7：棘孢木霉(Trichodema asperellum)HN082102促进作物的根生长。
筛选200粒大小基本相同，饱满的西瓜、茄子、番茄、黄瓜、辣椒种子经75％乙醇和1％(v/v)的次氯酸钠消毒10min后，用无菌水冲洗3遍，装入5个培养皿(每皿40粒)进行催芽，待出芽后，选择具有相同出芽状态的种子播种于装有灭菌育苗土的苗盘。生长30d后，选取大小、生长一致幼苗做实验材料。将棘孢木霉HN082102菌株接种于PDA平板，28℃培养72-96h后，然后用涂布器刮取PDA平板上的木霉孢子，制成孢子悬浮液浓度为1×107。将孢子悬浮液50ml灌入幼苗根部，以无菌水处理作为对照(CK)，共设置5个处理和1个对照，每个处理和对照重复3次。于15d后将幼苗拔出，用清水清洗干净，晾干表面水分后收集作物的根，测量根的长度。然后剪下作物的根，将根部擦干，称其鲜重。
表5本发明棘孢木霉HN082102促根生长效果
Figure BDA0002155819110000091
本发明棘孢木霉HN082102对4种作物根生长有一定的促进作用。
实施例8：棘孢木霉(Trichodema asperellum)HN082102抑菌活性和重寄生能力测定
将棘孢木霉HN0832108菌株和植物病原真菌接种于PDA平板上，28℃培养72-96h，分别从菌落边缘用5mm的打孔器打取菌饼，然后同时转接在PDA平板上，两菌饼相距5cm；将平板置于28℃培养10天后观察计算抑菌率及重寄生能力，不接木霉菌的，只接病原菌的为对照，试验重复3次。抑菌率及重寄生能力，按以下公式和标准计算：
抑菌率(％)＝((对照病原菌半径-对峙病原菌半径)/对照病原菌半径)×100％
重寄生能力分级标准：
+++++：木霉菌完全覆盖病原菌。
++++：木霉菌丝中等覆盖病原菌。
+++：木霉菌丝微弱覆盖病原菌。
++：木霉菌丝极微弱覆盖病原菌。
+：木霉菌丝与病原菌丝之间互不覆盖。
表6本发明棘孢木霉HN082102的抑菌效果和重寄生能力
Figure BDA0002155819110000101
序列表1：
Figure BDA0002155819110000102
Figure BDA0002155819110000111
序列表
<110> 海南大学
<120> 棘孢木霉HN082102及其应用
<130> 1
<141> 2019-08-02
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 619
<212> DNA
<213> 棘孢木霉(Trichoderma asperellum)
<400> 1
gcatttaatg ctttcatcat ttttggcaca atcatatgcc cgacaattct gctctcagtt 60
tttgtctttt ttttccagcg tcaccccgct ttgccagtct acctacccct cctttggcac 120
agcaaaaatt ttctggctgc cttgtttggc ttttagtggg gtgtcaaatt ttttggcagc 180
aaccccgcta tcgccactgc acctcttcca tcacccacca catgctattt gctcaatcgc 240
gtcgtctttt tttgttcatt atgctgatca tgcttcaatc aataggaagc cgccgaactc 300
ggcaagggtt ccttcaagta tgcgtgggtt cttgacaagc tcaaggccga gcgtgagcgt 360
ggtatcacca tcgacattgc cctctggaag ttcgagactc ccaagtacta tgtcaccgtc 420
attggtatgt tttggactct tctctctagc tatcgacatt ccaagtccgc cattctaaca 480
tgctcttccc acagacgctc ccggtcaccg tgatttcatc aagaacatga tcactggtac 540
ctcccaggct gactgcgcta tcctgattat cgctgccggt actggtgagt tcgaggctgg 600
tatctcccaa gggatggca 619

Claims (6)

1.一种棘孢木霉（Trichodema asperellum）HN082102，该菌株的保藏编号为CGMCCNo.17977。
2.根据权利要求1所述的棘孢木霉（Trichodema asperellum）HN082102，其特征在于：所述的棘孢木霉（Trichodema asperellum）HN082102的几丁质酶活为1.2043 U/ml，β-1，3-葡聚糖酶为0.7854 U/ml。
3.根据权利要求2所述的棘孢木霉（Trichodema asperellum）HN082102，其特征在于：所述的棘孢木霉（Trichodema asperellum）HN082102的耐盐性能力为：在NaCl含量3%的PDA上生长72小时后，菌丝长度为8.5厘米；在NaCl含量5%的PDA上生长120小时后，菌丝长度为8.5厘米；在NaCl含量7%的PDA上生长168小时后，菌丝长度为8.1厘米；在NaCl含量9%的PDA上生长168小时后，菌丝长度为5.04厘米，具有较强的耐盐能力。
4.根据权利要求3所述的棘孢木霉（Trichodema asperellum）HN082102，其特征在于：所述的（Trichodema asperellum）HN082102用于解除盐对作物生长抑制作用。
5.一种权利要求1或3所述的棘孢木霉（Trichodema asperellum）HN082102的应用，其特征在于：棘孢木霉（Trichodema asperellum）HN082102用于促进农作物根部生长，农作物为西瓜、茄子、番茄、黄瓜、辣椒。
6.一种权利要求1或3所述的棘孢木霉（Trichodema asperellum）HN082102的应用，其特征在于：棘孢木霉（Trichodema asperellum）HN082102用于抑制植物病原菌生长，所述的病原菌是香蕉枯萎病菌、芒果炭疽病菌、番茄灰霉病菌中的任意一种或多种。
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CN109749943B (zh) * 2019-03-06 2022-02-11 重庆市农业科学院 一种棘孢木霉菌及其应用

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