CN109749943B - 一种棘孢木霉菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.3.19218。该菌对茶树炭疽病病原菌Colletotrichum gloeosporioides、苹果腐烂病病原菌Phytophthora plurivora具有显著的抑制作用，其产生的抑菌物质也能抑制茶树炭疽病、苹果腐烂病病原菌的生长；并且本发明棘孢木霉菌还能促进茶苗生长，是一种环境安全性好，具有生物防治潜力和促生功能的菌株。

Description

一种棘孢木霉菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物及生物肥料技术领域，更具体的说是涉及一种棘孢木霉菌及其应用。

背景技术

木霉菌(Trichoderma spp.)广泛存在于土壤、植株根际、叶面、树皮及枯枝落叶中，生长繁殖能力强，不仅对环境有较强的适应性且较易建立种群优势，还能产生多种具有拮抗作用的代谢物质、丰富的酶类及促生因子，是应用最广的益生菌之一。

目前国内对木霉菌的研究主要集中在哈茨木霉T.harzianum、深绿木霉T.atroviride、绿色木霉T.virens、里氏木霉T.reesei和长枝木霉T.longibrachiatum。而棘孢木霉T.asperellum是近年我国新记录的木霉菌菌种，对其开发利用尚处于起步阶段。

茶树是一种多年生的作物，主要以嫩梢为收获物；茶树炭疽病的发生可致茶树大量落叶，进而使得树势衰弱，影响翌年春茶萌发，造成产量下降。目前，茶园主要采用喷洒农药或轻修剪剪除病叶的方法防治该病害，但农药的长期施用不仅不能有效的防治炭疽病，反而会使病菌抗性增强。此外，化学肥料的施用不当也是造成炭疽病流行的一个重要原因，有研究显示，大量使用氮肥容易使炭疽病流行，并且对茶树根系造成伤害，引起根腐病的发生；偏施矿质氮肥容易使得蚧、螨类吸汁型有害种群数量增多。因此，在减少氮肥使用的同时利用生物防控手段防控茶树炭疽病，并提高茶树系统抗性，对提升茶叶品质具有重要的现实意义。

苹果腐烂病病原菌Phytophthoraplurivora是苹果树新发生的病害，染病果树需要彻底刮尽病部组织，并且及时涂药，操作繁琐且容易造成病菌二次侵染。

因此，如何获得一种集防治、促生功能为一体的生防菌成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种棘孢木霉菌，其不仅能够促进茶苗生长，还可有效降低茶树炭疽病以及苹果腐烂病的发病率。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种棘孢木霉菌，命名为棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.3.19218，保藏时间为2019年1月9日。

本发明棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01生长速度快，在PDA上培养3d即可长满直径为9cm的培养皿，菌丝最初呈白色，后转为深绿色，菌丝层厚度适中，呈现密集的毡状，菌落背面呈暗绿色。

上述棘孢木霉菌在促进茶苗生长和/或病害防控中的应用。

优选地，上述棘孢木霉菌在抑制茶树炭疽病、苹果腐烂病原菌中的应用。

一种生物防治剂，包括棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01或棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01的发酵产物。

一种生物防治剂的制备方法，包括如下步骤：将棘孢木霉菌Trichodermaasperellum TC01活化后，接种于PDA平板上28℃培养7d得到菌落，向培养皿中加入无菌水，刮洗表面的分生孢子，用4层灭菌纱布过滤，得到分生孢子悬浮液。

一种生物防治剂的制备方法，包括如下步骤：将棘孢木霉菌Trichodermaasperellum TC01活化后，接种于PDA平板上28℃培养2d，收集菌丝搅拌磨碎，接种至PDB培养基中，120r/min、28℃恒温振荡培养7d，用4层灭菌纱布进行过滤，得到发酵液。

由上述技术方案可知，本发明公开的棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01对茶树炭疽病、苹果腐烂病病原菌均具有显著的抑制作用，其产生的抑菌物质也能抑制茶树炭疽病、苹果腐烂病病原菌的生长；采用棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01分生孢子悬浮液、发酵液对茶苗进行灌根处理均能有效促进茶苗生长，并且降低炭疽病的发病率；此外，还能显著降低苹果腐烂病发病率。

附图说明

图1所示为棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01在PDA培养基上的形态特征；

图2所示为棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01与茶树炭疽病病原菌B6对峙培养试验结果；

其中，a为棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01与茶树炭疽病病原菌B6对峙培养；b为茶树炭疽病病原菌B6对照菌落；

图3所示为棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01与苹果腐烂病病原菌A对峙培养试验结果；

其中，a为棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01与苹果腐烂病病原菌A对峙培养；b为苹果腐烂病病原菌A对照菌落；

图4所示为棘孢木霉菌T.asperellum TC01寄生于病原菌Colletotrichumgloeosporioides B6；

图5所示为棘孢木霉菌T.asperellum TC01寄生于PhytophthoraplurivoraA。

图6所示为棘孢木霉菌T.asperellum TC01对茶苗的促生结果

其中，a为空白对照组CK；b为发酵液处理组T；

图7所示为棘孢木霉Trichoderma asperellum TC01发酵液(100倍)对苹果腐烂病Phytophthoraplurivora的防控试验结果；

其中，a为空白对照组；b为发酵液处理组；c、d为单接病原菌未进行发酵液处理组。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01的分离及鉴定

1.采集重庆永川地区土壤，并采用稀释平板法进行分离，置于28℃恒温培养箱中培养，待菌落长出后挑取菌丝转移到新PDA培养基上进行编号保存。

PDA培养基配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、蒸馏水1000ml，操作步骤为：将马铃薯去皮，切小块，放入烧杯中，加水煮沸30min，过滤去除马铃薯残渣，向滤液中加入葡萄糖、琼脂，融化，定容至1000ml，最后溶液121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却备用。

2.提取分离纯化后菌株的基因组DNA，采用ITS4/ITS5进行PCR扩增，扩增序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

将扩增序列在Genebank数据库TrichoBLAST中进行比对，分类命名为棘孢木霉Trichoderma asperellum。如图1所示，棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01在PDA上培养3d即可长满直径为9cm的培养皿，菌丝最初呈白色，后转为深绿色，菌丝层厚度1-2mm，呈现密集的毡状，菌落背面呈暗绿色。

实施例2棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01对病原菌的抑制作用

取染茶树炭疽病的茶树叶片及染苹果腐烂病的苹果枝条，取病健交界处组织进行组织分离，分离得到纯培养菌株，经柯赫氏法则确定病原菌，命名为茶树炭疽病病原菌Colletotrichum gloeosporioides B6及苹果腐烂病病原菌PhytophthoraplurivoraA。

分别将棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01和供试病原菌菌种(茶树炭疽病病原菌或苹果腐烂病病原菌)在PDA培养基上扩大培养，培养三天，使其生长势一致。采用平板对峙培养法，用直径5mm的打孔器取新鲜培养的棘孢木霉菌Trichoderma asperellumTC01和供试病原菌菌丝块。将TC01与供试病原菌菌丝块分别同时接入PDA平板(培养皿直径9cm)，两者相距5cm，3次重复。分别以棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01和供试病原菌在PDA上的纯培养为对照，25℃恒温培养，逐日观察菌落的生长和TC01的抑制作用，测量相向半径，计算抑菌率，抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-对峙菌落直径)/对照菌落直径]×100％。

利用平板对峙培养方法，比较TC01与茶树炭疽病病原菌B6生长抑制效果，结果如图2所示，TC01对茶树炭疽病病原菌B6的抑菌率为86.6％，如图3所示，对苹果腐烂病病原菌A的抑菌率为75％。棘孢木霉菌T.asperellum TC01以孢子粘附、菌丝缠绕的方式重寄生于病原菌Colletotrichumgloeosporioides B6(图4)和PhytophthoraplurivoraA(图5)。

实施例3棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01代谢挥发物对病原菌的抑制作用

将TC01和供试病原菌菌种(茶树炭疽病病原菌或苹果腐烂病病原菌)同时扩大培养，培养三天，使其生长势一致。采用对扣培养法，用5mm打孔器分别在TC01菌株、供试病原菌的菌落边缘打取新鲜菌丝块，将菌丝块分别放置在含20ml PDA的9cm培养皿中央，将TC01和供试病原菌皿底两两对扣，病原菌皿底在下，TC01皿底在上，用封口膜进行包裹处理，每个处理3次重复，以两面都是病原菌的处理作为空白对照，28℃恒温培养箱中培养7d后，计算抑菌率，抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-对扣菌落直径)/对照菌落直径]×100％；结果显示，TC01代谢挥发物对茶树炭疽病病原菌B6的抑菌率为55％，并且抑制其产孢；对苹果腐烂病病原菌A的抑菌率为55％，供试组无藏卵器产生。

实施例4棘孢木霉Trichoderma asperellum TC01发酵液对茶树炭疽病的防控作用及对茶苗的促生作用

制备发酵液：将菌株活化后，接种在铺有玻璃纸的PDA平板上28℃培养2d，收集菌丝(约为0.5g)将其搅拌磨碎，接种至含有100mLPDB培养基(马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000ml)的250mL三角瓶中，120r/min、28℃恒温振荡培养7d，用4层灭菌纱布进行过滤，得到发酵液。

田间常规管理盆栽一年生茶苗植株，设置4组试验：

(1)CK：无菌水灌根；

(2)B：无菌水灌根，叶片接种炭疽病病原菌；

(3)BT：TC01发酵液(100倍)灌根处理茶苗，叶片接种炭疽病病原菌；

(4)T：TC01发酵液(100倍)灌根处理茶苗。每个处理设置3个重复，每盆灌根量为20ml，每隔7d进行一次灌根处理，共进行4次。

接种10d后，调查病情指数，根据病情分级标准计算病情指数和相对防效，病情分级标准如下：

0级:叶片健康无病；

1级:1％-25％叶片面积发病；

2级:26％-50％叶片面积发病；

3级:51％-75％叶片面积发病；

4级:76％以上面积叶片黄化溃烂。

病情指数＝[∑(病级数×该级发病叶片数)/(调查总数×最高病级数)]×100；

相对防效(％)＝[(无菌水灌根叶片病情指数-发酵液灌根叶片病情指数)/无菌水灌根叶片病情指数]×100。

结果如表1所示，施用TC01菌株发酵液(100倍)后病情指数由58.3下降至33.3，相对防效42.88％。

表1施用TC01菌株发酵液后病情指数

按照五点取样法，45d时进行取样。对所有样品的单株进行株高、茎粗、地上(下)鲜重、地上(下)干重测量，通过以上测量指标，运用SPSS软件进行显著性差异分析，如表2、图6所示，TC01菌株发酵液(100倍)对茶苗有促生作用。

表2TC01菌株发酵液对茶苗有促生作用

实施例5棘孢木霉Trichoderma asperellum TC01分生孢子悬浮液对茶苗的促生作用及对茶树炭疽病的防控效果

制备分生孢子悬浮液：将棘孢木霉Trichoderma asperellum TC01菌株接种于PDA培养基上，28℃黑暗培养7d，得到TC01菌株菌落；在培养皿中加入20ml无菌水，刮洗表面的分生孢子，用4层灭菌纱布进行过滤，得到分生孢子悬浮液，调节浓度为1×10⁷个分生孢子/ml。

盆栽试验：一年生茶苗植株，叶片接种炭疽病病原菌，并且使用TC01分生孢子悬浮液进行定期灌根处理，设置3个重复，每盆灌根量为20ml(浓度为1×10⁵个分生孢子/ml)，每隔7d进行一次灌根处理，共进行4次；以清水为对照组。

第45d时取样，对所取样品的单株进行株高、根长、茎粗、地上鲜重、地下鲜重、地上干重、地下干重的测量，通过以上测量指标，运用SPSS软件进行显著性差异分析，结果如表3所示。

表3棘孢木霉Trichoderma asperellum TC01分生孢子悬浮液对茶苗的促生作用

实施例6棘孢木霉Trichoderma asperellum TC01发酵液(100倍)对苹果腐烂病Phytophthoraplurivora的防控作用

发酵液的制备同实施例4。

枝条接种试验，设计3组处理，均为有伤接种：

(1)接种病原菌Phytophthoraplurivora A于接种点上；

(2)先在接种点及周边均匀喷洒1ml发酵液(100倍)，待干后接种病原菌Phytophthoraplurivora A(0.5mm菌丝块)；

(3)接种空白琼脂块于接种点上；

灭菌脱脂棉浸润无菌水放于接种点，包裹保鲜膜保湿48h后取下，10d后观察症状。结果如图6所示：

与对照相比(图7a)，单接病原菌(图7c)不仅韧皮部出现褐色病斑，而且扩展到木质部(图7d)。

与对照相比(图7a)，发酵液对病斑扩展有一定程度的抑制作用(图7b)，病斑仅局限在接种点周围。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 重庆市农业科学院

<120> 一种棘孢木霉菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 616

<212> DNA

<213> Trichoderma asperellum

<400> 1

tcctccgctt attgatatgc ttaagttcag cgggtattcc tacctgatcc gaggtcaaca 60

tttcagaaag ttgggtgttt tacggacgtg gacgcgccgc gctcccggtg cgagttgtgc 120

aaactactgc gcaggagagg ctgcggcgag accgccactg tatttcgggg ccggcacccg 180

tgtgaggggt cccgatcccc aacgccgatc ccccggaggg gttcgagggt tgaaatgacg 240

ctcggacagg catgcccgcc agaatactgg cgggcgcaat gtgcgttcaa agattcgatg 300

attcactgaa ttctgcaatt cacattactt atcgcatttc gctgcgttct tcatcgatgc 360

cagaaccaag agatccgttg ttgaaagttt tgattcattt tgaatttttg ctcagagctg 420

taagaaatac gtccgcgagg ggactacaga aagagtttgg ttggttcctc cggcgggcgc 480

ctggttccgg ggctgcgacg cacccggggc gtgaccccgc cgaggcaaca gtttggtaac 540

gttcacattg ggtttgggag ttgtaaactc ggtaatgatc cctccgctgg ttcaccaacg 600

gagaccttgt tacgac 616

Claims (6)

1. 一种棘孢木霉菌，其特征在于，棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC NO.3.19218。

2.根据权利要求1所述的一种棘孢木霉菌在促进茶苗生长中的应用。

3.根据权利要求1所述的一种棘孢木霉菌在抑制茶树炭疽病病原菌Colletotrichum gloeosporioides、苹果腐烂病原菌Phytophthora plurivora中的应用。

4.一种生物防治剂，其特征在于，包括权利要求1所述棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01或棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01的发酵产物。

5.一种生物防治剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01活化后，接种于 PDA 平板上28℃培养7d得到菌落，向培养皿中加入无菌水，刮洗表面的分生孢子，用4层灭菌纱布过滤，得到分生孢子悬浮液。

6.一种生物防治剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述棘孢木霉菌Trichoderma asperellum TC01活化后，接种于 PDA 平板上28℃培养2d，收集菌丝搅拌磨碎，接种至 PDB 培养基中，120 r/min、28℃恒温振荡培养7d，用4层灭菌纱布过滤，得到发酵液。

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