CN109880764B - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治苹果病害中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BV2007，保藏号为CGMCC No.16738，同时公开了以该菌株为活性成分的微生物菌剂，该微生物菌剂对苹果腐烂病菌、轮纹病菌、尖孢镰刀菌和层出镰刀菌等病原菌引起的病害具有有效的防治作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种菌株，尤其涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其在苹果病害防治中的应用。
背景技术
苹果腐烂病是由苹果黑腐皮壳（Valsa mali Miyable et Yamada）引起的一种真菌病害。该病害在多个国家都有分布，在我国的西北、东北和华北等地的苹果产区，苹果腐烂病发生分布较为广泛，是我国苹果生产上最重要的病害之一。该病害发生轻则削弱树势，降低苹果产量，重则引起死枝死树，甚至造成毁园。
苹果轮纹病又常被称为粗皮病、疣皮病、轮纹褐腐病、烂果病等，在澳大利亚和美国等地被称为白腐病（Apple white rot）。该病害在世界各苹果产区均有发生，主要分布在中国、朝鲜以及日本，近年来有蔓延和加重的趋势，已成为苹果生产中的重大威胁。
苹果再植病害（Apple Replant Disease）是指在前茬种植过苹果的老果园土壤中，再次种植苹果幼苗时，幼苗根部坏死，地上部和地下部发育不良，出现干旱和营养不良的症状，从而导致产量的损失。据报道，在美国、加拿大、德国、瑞士、荷兰、希腊、日本和意大利等国家均发生过该病害，并产生了巨大的经济损失。
苹果病害连年加重，目前农药防治是主流。然而我国每年农药使用量普遍超标，平均每亩施用量比发达国家高出一倍。全国受农药污染的农田约万公顷，主要农产品中的农药残留大部分都超标。因此，苹果病害的防治技术急需改善和提升，而生物防治苹果病害是替代化学农药的可行途径之一。
生物防治有微生物防治、抗生素防治、植物源农药防治。微生物防治，是利用两个生物之间进行营养和空间的竞争，其实质是利用有益生物和微生物代谢产物对病害进行防治。这些拮抗菌主要包括放线菌、真菌和其他微生物。现已报道的木霉菌的培养滤液、杨凌糖丝菌Hhs.015、植物内生BAR1-5放线菌的无菌发酵滤液等对防治苹果病害都有一定的抑制效果。抗生素防治中，生产上常用的抗生素有农用抗生素S-921、程廉研制的11371发酵液等抗生素，均有较好的抑制效果。植物源农药，我国现在已经发现的植物有213个科1957个属10027个种，这些植物中具有杀菌和抑菌作用的有1000多种，所能利用的资源较为丰富。随着生物技术的发展，如何开发更好的微生物制剂对苹果病害进行更为有效的防治，一直是本领域急需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一株贝莱斯芽孢杆菌及以其为活性成分的微生物菌剂，该微生物菌剂对苹果腐烂病菌、轮纹病菌、尖孢镰刀菌和层出镰刀菌等病原菌引起的病害具有有效的防治作用。
本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌是贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BV2007，该菌株已于2018年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.16738。该菌株从山东省海阳市苹果园土壤中分离并纯化所得，对苹果腐烂病害、苹果轮纹病害、苹果再植病害具有明显抑制效果。
本发明利用贝莱斯芽孢杆菌BV2007制备的微生物菌剂对上述病原菌的菌丝生长具有抑制作用，并给出了微生物菌剂在离体枝条上的保护、治疗效果和盆栽试验及田间防治效果。
本发明的有益效果在于，为抑制苹果病害提供了一个高效的微生物菌剂，为防治苹果病害开辟了一个有效途径；本发明的微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染；本发明使用的微生物菌剂制备方法简单、便于使用，成本低廉，易于推广应用。
附图说明
图1为贝莱斯芽孢杆菌BV2007抑制苹果尖孢镰刀菌的抑制效果图；
图2为贝莱斯芽孢杆菌BV2007抑制苹果轮纹病菌的抑制效果图；
图3为贝莱斯芽孢杆菌BV2007抑制苹果腐烂病菌丝生长的抑制效果图；
图4为贝莱斯芽孢杆菌BV2007抑制苹果轮纹病菌丝生长的抑制效果图；
图5为贝莱斯芽孢杆菌BV2007对离体枝条的保护作用效果图；
图6为贝莱斯芽孢杆菌BV2007对离体枝条的治疗作用效果图；
图7为贝莱斯芽孢杆菌BV2007对苹果枝干轮纹病害作用效果图；
图8为贝莱斯芽孢杆菌BV2007对苹果再植病害作用效果图；
图9为贝莱斯芽孢杆菌BV2007的16s rDNA基因的系统发育分析。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进一步进行说明。
实施例1：平板对峙培养法初筛贝莱斯芽孢杆菌BV2007菌株及菌株对4种苹果病原菌的菌丝生长的拮抗作用
微生物菌剂的制备方法：
（1）将低温保存的贝莱斯芽孢杆菌BV2007菌株在活化培养基上活化，挑取单菌落在活化培养基上，在30-32℃培养16-24小时，得活化的菌株；所述活化培养基为：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂17 g/L，水1000 mL，PH自然；
（2）用无菌的牙签刮取一步骤（1）活化的菌株并接种到100 ml 种子培养基中，在28℃，220 r/min的摇床中震荡培养48 h制成种子液；所述种子培养基为：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，水1000 mL，PH自然；
（3）取摇好的种子液5 mL于另一个已灭菌的100 ml 种子培养基中，继续放入摇床中28℃，220 r/min震荡培养48 h制备成液体制剂（细菌发酵液）。将制备好的发酵液倒入离心管中，4℃，10000 r/min离心20 min，用注射器吸出上清液，将上清液通过孔径为0.22 µm的细菌过滤器过滤除菌得液体制剂（无菌发酵滤液）。
所述的微生物菌剂中贝莱斯芽孢杆菌BV2007活菌数为2×108~1×1010cfu/g。
试验方法：用PDA培养基倒平板，取培养好的病原菌，用打孔器（ø=8.0 mm）在菌落边缘打孔，挑取打好的病菌菌饼置于平板的一侧，在其对侧相距4 cm处放置已灭菌的滤纸片，在滤纸片中央滴加20 µL细菌发酵液，在超净台中待其挥发掉滤纸上水分，封口，置于25℃的生化培养箱内培养，以滤纸片滴加无菌水的处理为对照。每个处理重复5次，本试验重复2次，待对照接近长满培养皿时测量抑菌带宽度，计算抑菌率。抑菌率计算公式如下：
试验结果如表1所示，本发明的微生物菌剂对腐烂病菌、轮纹病菌、尖孢镰刀菌和层出镰刀菌的菌丝生长具有明显的抑制作用，其中对尖孢镰刀菌抑制效果最好，达到了71.28%，其次是层出镰刀菌、腐烂病菌和轮纹病菌，抑制率分别达到69.57%、66.12%和58.12%，其中对尖孢镰刀菌和轮纹病菌效果如附图1至2所示。
实施例2：生长速率法复筛含有贝莱斯芽孢杆菌BV2007的微生物菌剂对4种苹果病菌的菌丝生长的拮抗作用
微生物菌剂的制备方法同实施例1。
试验方法：将PDA培养基熔化，待其冷却到50℃左右，取5 mL无菌发酵滤液与95 mL的PDA迅速混匀，倒入平皿中制成含5%无菌滤液的平板，冷却后将直径 8.0 mm的病菌菌饼放入平板中央，以未加滤液的平板为对照，每个处理重复5次，本试验重复2次。当对照菌落刚长满培养皿时用十字交叉法测量各处理菌落直径，计算抑菌率。抑菌率公式如下：
试验结果如表1所示，本发明的微生物菌剂对腐烂病菌、轮纹病菌、尖孢镰刀菌和层出镰刀菌的菌丝生长具有明显的抑制作用，其中对腐烂菌抑制效果最好，达到了85.24%，其次是轮纹病菌、尖孢镰刀菌和层出镰刀菌，抑制率分别达到72.66%、65.27%和61.29%，其中对腐烂病菌和轮纹病菌效果如附图3至4所示。
实施例3：含有贝莱斯芽孢杆菌BV2007的微生物菌剂（液体）对离体枝条模拟试验的作用效果
微生物菌剂的制备方法同实施例1。
（1）离体枝条处理
采集生长状况良好，健康无病虫，直径为1.5-2.5 cm的富士苹果枝条，将其放入0-3℃冷库中短期保存备用。使用前将其裁剪成长度为30 cm长的枝条，剪掉所有叶片，用自来水将枝条清洗干净，75%的酒精浸泡约2 min，用3%的次氯酸钠进行表面消毒，最后用无菌水冲洗干净，把冲洗后的枝条放在室内自然晾干，枝条形态学上端涂凡士林保湿。
（2）微生物菌剂对苹果树腐烂病离体枝条的保护作用
试验方法：将处理好的枝条用6.0 mm的灭菌打孔器在枝条表面打孔，每根枝条打三个孔作为1个重复，每组处理5个枝条作为5次重复。每个处理枝条的3个孔分别滴加50 μL微生物菌剂（细菌发酵液或无菌滤液），以无菌水和3%甲基硫菌灵涂抹剂分别处理的枝条作为空白对照和阳性对照。室温下自然阴干后接种直径6 mm腐烂病菌菌饼，用保鲜膜包裹接种部位，并将离体枝条插在灭菌的湿沙粒中，再将其放置在25℃相对湿度为100%的人工气候箱中保湿培养。48 h后去除保鲜膜和菌饼，待无菌水处理对照组全部发病后测量腐烂病病斑长径和短径，按椭圆形面积公式计算病斑面积。本试验重复3次，根据调查结果统计发病率并计算防治效果。
（3）微生物菌剂对苹果树腐烂病离体枝条的治疗作用
试验方法：将处理好的离体枝条用直径6.0 mm的灭菌打孔器在枝条表面打孔，每个枝条打3个孔作为1个重复，每组处理重复5个枝条作为5次重复。在离体枝条打孔处用直径6 mm的腐烂病菌菌饼接种，用保鲜膜包裹接种部位，将枝条插在灭菌的湿沙粒中，再将其放置在25℃相对湿度为100%的人工气候箱中保湿培养。接种60 h后待接种部位发病后将保鲜膜去除，用刮刀将病斑全部刮净，然后用移液枪吸取液体微生物菌剂（细菌发酵液或无菌滤液）50 μL涂抹到病斑刮除处，用无菌水和甲基硫菌灵药剂分别处理的枝条分别作为空白对照和阳性对照。晾干后将枝条插在灭菌湿沙粒中，继续放置在人工气候箱中保湿培养。待无菌水处理对照组病斑全部复发后测量病斑长径和短径，本试验重复3次，计算发病率、复发病斑面积和防治效果。
试验结果如表2与表3所示，本发明的微生物菌剂（液体）对腐烂病的防治有较好的效果，其中微生物菌剂－发酵液对苹果树腐烂病具有明显的防治效果，在保护作用中防治效果达到73.58%，3%甲基硫菌灵的防治效果为98.08%，在治疗作用中防治效果达到72.68%，3%甲基硫菌灵的防治效果为97.99%；另外微生物菌剂－无菌滤液对苹果树腐烂病的防治效果也较好，在保护作用中防治效果达到54.74%，3%甲基硫菌灵的防治效果为98.08%，在治疗作用中防治效果达到42.88%，3%甲基硫菌灵的防治效果为97.99%，效果如附图5与附图6所示。
实施例4：含有贝莱斯芽孢杆菌BV2007的微生物菌剂（膏剂）对田间盆栽苹果树腐烂病的防治效果
微生物菌剂的制备委托张家口宣化佳园现代农业科技开发有限公司制备, 膏剂是将发明物菌株加入添加剂、保护剂中，添加剂为二氧化硅、轻质碳酸钙、高岭土、膨润土、稻壳粉、麦壳粉或秸秆粉中的至少一种；保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、海藻酸钠或壳聚糖中的至少一种或多种混合物。按重量配比计，贝莱斯芽孢杆菌BV2007发酵液1份，其中贝莱斯芽孢杆菌BV2007活菌数为2×108~1×1010 cfu/g；添加剂0.5~3份；保护剂0.01~0.05份。
（1）微生物菌剂对苹果树腐烂病田间枝条的保护作用
试验方法：在河北农业大学苹果试验园选取长势相近的盆栽富士苹果树，用直径为8 mm的打孔器在2-3年生枝条表面上打孔，每个枝条打3个孔作为1个重复，每组处理重复5个枝条作为5次重复，然后涂抹微生物菌剂，用保鲜膜包裹处理的伤口部位保湿。3 d后去除保鲜膜并在打孔处用8 mm腐烂病菌菌饼接种，然后再用保鲜膜包裹保湿1周，以无菌水和甲基硫菌灵药剂处理的枝条分别作为阴性对照和阳性对照。观察记录接种点的发病情况，计算发病率和防治效果（同上述离体枝条保护的计算方法）。
（2）微生物菌剂对苹果树腐烂病田间枝条的治疗作用
试验方法：在河北农业大学苹果试验园选取长势相近的盆栽富士苹果树，用直径为8 mm的打孔器在2-3年生枝条表面上打孔，每个枝条打3个孔作为1个重复，每组处理重复5个枝条作为5次重复，然后每个孔分别接种腐烂病菌菌饼，用保鲜膜包裹保湿，约1周接种处发病后去掉保鲜膜，刮除病斑，涂抹微生物菌剂，以无菌水和甲基硫菌灵药剂处理的枝条分别作为阴性对照和阳性对照，包裹保鲜膜保湿，待对照组复发后观察腐烂病的复发情况，计算复发率、病斑面积和防治效果（同上述离体枝条治疗的计算方法）。
试验结果如表4所示，本发明的微生物菌剂（膏剂）对腐烂病（田间）的防治有较好的效果，其中在保护作用中防治效果达到84.10%，3%甲基硫菌灵的防治效果为90.29%，在治疗作用中防治效果达到68.06%，3%甲基硫菌灵的防治效果为83.47%。
实施例5：含有贝莱斯芽孢杆菌BV2007的微生物菌剂（膏剂）对苹果枝干轮纹病的保护防治效果
试验方法：在山东沂源于家北坡村苹果种植园、山东沂源南刘庄村和芦峪村苹果种植园进行，选取病瘤数不超过试验面积30%的区域，15 cm一段，分别进行涂微生物菌剂和不涂微生物菌剂处理。处理区域病瘤数量尽量保持一致。选3棵树，每棵树划分6个区域。处理当天对试验区域进行病瘤数量和发病占所选区域百分比调查，并记录。于6个月后对试验区域进行第二次调查，再6个月后对试验区域进行第三次调查。通过计算涂微生物菌剂和不涂微生物菌剂位置病瘤数增长量和发病面积所占百分比的变化，计算防效。
试验结果如表5所示，本发明的微生物菌剂（膏剂）对三个不同试验点的苹果枝干轮纹病均有显著地防治效果，其中试验点3防治效果最显著，达到89.93%，其次是试验点2，防治效果达到79.37%，最后是试验点1，防治效果达到53.94%，效果如附图7所示。
实施例6：含有贝莱斯芽孢杆菌BV2007的微生物菌剂（粉剂）对苹果再植病害的保护防治效果
微生物菌剂(粉剂)的制备委托张家口宣化佳园现代农业科技开发有限公司制备。粉剂是由发明物菌株在水中可均匀分散的制剂，本发明的可湿性粉剂除加有白碳黑、轻质碳酸钙、陶土、硅藻土等稀释剂或惰性物质以外，它含有离子型或非离子型表面活性剂（润湿剂、分散剂），例如：脂肪醇聚乙二醇醚硫酸盐、脂肪酰胺N---甲基牛黄酸钠盐，脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠十二烷基苯黄酸钠—钙，木质素黄酸钠—钙等之中的一种或多种物质，含量为1—30%，还包含渗透剂T、氮酮、YZ---901通常用量为0.1---20%。
试验方法：在河北农业大学苹果试验园2018年3月将已生长4年的苹果苗挖除，全园深翻，2018年4月10日再植，品种：富士，高接砧木，株行距：1m×1m，再植前将老根、病根捡出。定植幼苗时分3个处理，分别为施用贝莱斯芽孢杆菌BV2007的微生物菌剂1.00 kg/株，腐熟有机肥1.00 kg/株， 15-15-15复合肥133 g/株（CK）。栽植时首先挖坑，然后将菌剂、复合肥与土壤混合均匀，待树苗放入坑内后，扶正，将混有菌肥或复合肥的土壤植入坑内，压实。施用贝莱斯芽孢杆菌BV2007的微生物菌剂处理果树定植后结合2×108 CFU/mL液体菌剂稀释300倍灌根，每株用水9升，其他处理用不加菌剂的水9升。每处理为3株，各处理重复4次。
2018年4月再植苹果树，定植后对苹果树的株高、根长、干重、病株率及植株死亡率进行测定，得到初始值，一个生长季节后对苹果树的株高、根长、干重、病株率及植株死亡率进行测定，并每隔半月进行测量，得到测量值。
树体增长指标测量：
（1）株高
初始值测量：于春季种植时对树体进行测量，用卷尺（精确到1cm）测量株高顶端生长点到地面的距离即为株高。
终值测量：经过一个生长季后对树体再次进行测量，测量方法与初始值的测量一致。
株高增长度 = 终值－初值
（2）根长
初始值测量：于春季种植时对树体进行测量，用卷尺（精确到1cm）测量根系的长度，即为根长。
终值测量：经过一个生长季后对树体再次进行测量，测量方法与初始值的测量一致。
根长增长度 = 终值－初值
（3）干重
经过一个生长季节后对处理植株干重进行测量。
（4）病株率
观察并记录植株发病的数量，计算植株发病率。
（5）植株死亡率
观察并记录植株死亡的数量，计算植株死亡率。
试验结果如表6所示，本发明的微生物菌剂（粉剂）对再植苹果砧木（八棱海棠）均有不同的影响，其中处理与对照在株高、根长、干重、病株率及死亡率等指标上均有明显的差异，效果如附图8所示。
实施例7：贝莱斯芽孢杆菌BV2007 CGMCC No.16738的筛选与保藏
（1）土壤样品采集
土壤采集于山东省海阳市苹果园土壤中，过筛去除杂质备用。
（2）土壤样品处理
分别量取50 ml、25 ml纯净水加入250 ml、150 ml锥形瓶中，密封。并放入湿热灭菌锅中121℃灭菌20 min；取少量样品用网筛进行漏筛，除去大块土壤或小石子，留下细碎土壤；将这些细土壤放在研钵中研磨成粉；在灭菌期间，称量研磨好的土壤1g；待锥形瓶冷却至常温时，向250 ml锥形瓶中加入称量好的土样，然后放到200 rpm的摇床上震荡2 h。
（3）土壤微生物BV2007的分离
系列稀释：土壤悬浮液静置5 min后，从250 ml锥形瓶中移取25 ml上清液于150ml锥形瓶中，摇匀。作为10-2稀释液，再从10-2稀释液中移取1 ml液体，加入到9 ml水中，作为10-3稀释液。再从10-3稀释液中移取1 ml液体，加入到9 ml水中，作为10-4稀释液，同理依次稀释，每次吸取悬液，注意把悬浮液摇匀。
倒平板：将灭菌后的活化培养基放入微波炉中，将其溶化并冷却至50℃-60℃的培养基放入超净台中，分别将培养基倒入标有10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2 培养皿中，每浓度三个重复，培养基冷却至完全凝固。
涂布分离：用100 µl的移液枪分别吸取100 µl稀释好的土壤悬浮液滴加到活化培养基上，用无菌涂布器均匀地涂散开，每一浓度做三次重复。
培养观察：28℃恒温培养箱倒置培养，分别在24 h、48 h、72 h和96 h取出培养皿观察菌落生长情况，并进行计数统计。
（4）土壤微生物BV2007纯化与保藏
从上述平板上分离的细菌挑取单菌落，在新的活化培养基平板上划线获得单菌落，每个重复三次，得到该菌株BV2007的纯培养。
该菌株已于2018年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16738。
实施例8：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BV2007的种属鉴定
根据菌株的菌落形态特征、菌体形态特征、革兰氏染色性状、芽孢染色性状，有关生理生化鉴别试验，参照《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰氏细菌鉴定手册》进行鉴定。
（1）菌落特征和菌体形态特征
根据活化培养基上生长的菌株BV2007的菌落形态，初步判断其为细菌菌落，培养24 h的菌落为不透明的乳白色，呈近圆形，边缘不整齐，表面有皱摺，中间有突起。
菌株BV2007经染色后置于光学显微镜下观察，菌体呈杆状，革兰氏染色呈阳性，芽孢呈椭圆形中生。
（2）生理生化性质鉴定
参考东秀珠和蔡妙英的方法进行测定，采用硝酸盐还原试验、明胶液化、淀粉水解试验、VP反应、碳水化合物利用试验（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇）等进行该菌株的生理生化测定，试验结果见表7。
（3）分子生物学鉴定
用16S r DNA基因序列进行鉴定，按照DNA抽提试剂盒说明书提取DNA并检测，对具有特异性DNA条带的样品进行PCR扩增。PCR 扩增反应体系（25 μL）为：PCR Master Mix12.5 μL、27F和1492R各1 μL、模板DNA 1 μL、dd H2O 9.5 μL。PCR 反应条件：94 ℃预变性5min；94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，进行35个循环；最后72℃延伸10min，4℃临时保存。PCR产物经0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测，然后将具有阳性克隆条带的PCR产物送北京华大基因有限公司测序。将反馈回来的序列结果在GenBank 数据库中进行相似性比较，并下载相似性高于98%的序列构建系统发育树，发现BV2007菌株的基因序列与Bacillus velezensis位于一个分支上，相似度均达93%以上（如图9所示）。结合菌落特征、菌体形态特征、生理生化鉴定结果，将BV2007菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。
Claims (6)
1.贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BV2007，保藏号为CGMCC No.16738。
2.含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌BV2007的微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于所述的微生物菌剂为液体制剂、膏剂或粉剂。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述膏剂中还含有添加剂和保护剂；
其中，所述添加剂为二氧化硅、轻质碳酸钙、高岭土、膨润土、稻壳粉、麦壳粉或秸秆粉中的至少一种；
所述保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、海藻酸钠或壳聚糖中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于由如下组分按重量配比制成：
贝莱斯芽孢杆菌BV2007发酵液1份，其中贝莱斯芽孢杆菌BV2007活菌数为2×108~1×1010 cfu/g；
所述添加剂0.5~3份；
所述保护剂0.01~0.05份。
6.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌BV2007或权利要求2~5任一项所述的微生物菌剂在防治苹果病害中的应用，所述苹果病害的病原菌为腐烂病菌、轮纹病菌、尖孢镰刀菌和层出镰刀菌中的一种或任意几种。
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