CN109628341B - 深红紫链霉菌及其生物防治菌剂和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体公开了深红紫链霉菌及其生物防治菌剂和制备方法。该深红紫链霉菌FX28，保藏编号为CGMCC No.15771。由该深红紫链霉菌FX28和/或深红紫链霉菌FX28发酵代谢产物所制成的生物防治菌剂，对多种农作物病原真菌的菌丝生长均有拮抗抑制作用，尤其对琯溪蜜柚炭疽病菌孢子萌发具有良好的抑制作用，丰富了生防资源。将所述深红紫链霉菌FX28或深红紫链霉菌FX28的发酵液或发酵上清液或发酵上清稀释液，用于防治琯溪蜜柚炭疽病，防治效果好，解决了现有技术中化学防治带来的病原菌抗药性、果实农药残留、生态平衡遭到破坏、严重污染人类赖以生存的自然环境等问题，有利于琯溪蜜柚的无公害生产。

Description

深红紫链霉菌及其生物防治菌剂和制备方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及深红紫链霉菌及其生物防治菌剂和制备方法。

背景技术

生物防治具有无毒、无残留、可利用资源丰富等优点，利用拮抗微生物防治植物病害是解决上述问题的有效方法，且该方法是以生态系统调控为主的可持续控制技术，具有对环境友好、效果持久、针对性强，不破坏生态平衡等优点。放线菌(Actinomycetes)是一类具有重要经济价值和实用价值的微生物，种类丰富，且广泛分布于自然界中，其产生的抗生素及其次生代谢物质在植物生物防治方面具有重要作用。

琯溪蜜柚炭疽病是琯溪蜜柚生产中最主要的病害之一，可危害琯溪蜜柚果实、叶片、花和枝梢，潜伏期较长，爆发性强，造成琯溪蜜柚树势衰弱及落果烂果。琯溪蜜柚炭疽病由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起。目前，该病的防治主要以化学防治和选育抗病品种为主，但培育抗病品种周期长，存在抗性退化，防治效果不理想。化学药剂虽然在一定程度上减轻该病的危害，但长期使用却导致了一系列令人担忧的问题，特别是近几年来果农用药次数和混用农药品种逐年增多，造成病原菌抗药性、果实农药残留、生态平衡遭到破坏、严重污染人类赖以生存的自然环境等等。

目前，尚未发现用于拮抗琯溪蜜柚炭疽病的生防菌。

针对深红紫链霉菌，我们检索到授权公告号为CN103555636B的发明专利，专利名称为：一种深红紫链霉菌及其应用。该发明专利具体公开了从吉尔吉斯斯坦贾拉拉巴州的野生核桃林中取样，分离、筛选、生理生化鉴定，得到一株深红紫链霉菌JG-1，保藏号CGMCCNo.7921。该深红紫链霉菌具有蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶阴性，α-淀粉酶、酯酶、脂肪酶阳性，可广泛用于α-淀粉酶、酯酶、脂肪酶生产领域。但该深红紫链霉菌并未公开涉及到对多种植物病原菌具有拮抗抑制作用的特性，更未公开涉及到可用作拮抗琯溪蜜柚炭疽病的生物防治菌剂。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供深红紫链霉菌及其生物防治菌剂和制备方法，所述深红紫链霉菌的保藏编号为CGMCC No.15771，经试验证明，该菌株对多种植物病原菌具有拮抗抑制作用，特别是，该菌株用于琯溪蜜柚炭疽病的防治具有很好的效果，解决了现有技术中，化学防治带来的病原菌抗药性、果实农药残留、生态平衡遭到破坏、严重污染人类赖以生存的自然环境等问题。

本发明提供一株深红紫链霉菌(Streptomyces violaceorubidus)FX28菌株，属于链霉菌属(Streptomyces)，于2018年5月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.15771，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

深红紫链霉菌FX28菌株的获得：选择福建省漳州市南靖县靖城镇草坂村琯溪蜜柚园改种甜椒的健康甜椒植株的根际土壤，铲去表土层，取10-15cm处土样，将土壤样品用无菌水稀释10³倍，利用高氏一号培养基在28℃条件下培养，采用常规的平板稀释培养法分离获得。分离纯化后的深红紫链霉菌(Streptomyces violaceorubidus)FX28转入高氏一号培养基，在28℃条件下培养、扩繁后得到深红紫链霉菌FX28菌株。

该深红紫链霉菌(Streptomyces violaceorubidus)FX28菌株经16S rDNA序列对比分析，与已知放线菌的链霉菌Streptomyces violaceorubidus(基因登录号NR042309)的16S rDNA同源性最高，达到99％。

所述的深红紫链霉菌FX28菌株，能使明胶液化、牛奶凝固而不胨化、水解淀粉，不能使纤维素分解、硝酸盐还原和色氨酸分解，也不能产生H₂S和黑色素；可以利用蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、甘油、D-阿拉伯糖、鼠李糖、D-甘露醇、α-半乳糖、肌醇、D-木糖作为碳源生长，不能利用棉子糖、D-果糖。可利用L-赖氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、天冬酰胺、L-酪氨酸、L-色氨酸作为氮源生长，不能利用L-谷氨酸。对NaCl的耐受性较强，能在含5％NaCl的培养基上生长，对温度也有较强的耐受性，可在10～38℃之间生长，28℃为生长最适温度,菌株适宜生长的pH范围6.5～8.5之间，最适pH为7.2，能耐受6～12的pH范围。

所述的深红紫链霉菌FX28菌株，在高氏一号培养基上生长茂盛，气生菌丝丰茂，28℃培养1～6d菌落光滑、无孢子生成，第7d开始有灰白色孢子丝从菌落中间长出，5d后开始逐渐变为灰色至深灰色，能产生紫红色水溶性色素。

所述的深红紫链霉菌FX28菌株，在显微镜下观察，基内菌丝无横隔膜，弯曲，高度分枝，孢子丝松敞或紧密螺旋形，时常不规则，丛生或轮生，孢子丝成熟后形成串珠状的孢子链，孢子丝断裂后形成椭球形孢子。

所述深红紫链霉菌FX28和/或所述深红紫链霉菌FX28的发酵代谢产物均可用于制备生物防治菌剂。

其次，本发明提供了一种生物防治菌剂。

该生物防治菌剂由所述深红紫链霉菌FX28的溶液、或者所述深红紫链霉菌FX28的发酵液、或者所述深红紫链霉菌FX28的发酵上清液的一种或者多种混合而成。

所述生物防治菌剂可用于防治农作物病原真菌。

进一步地，所述的农作物病原真菌包括蜜柚炭疽病菌、蜜柚黑星病菌、番茄叶霉病菌、辣椒枯萎病菌、榕树炭疽病菌、多肉黑斑病菌、榕树炭疽病菌、多肉黑斑病菌、辣椒根腐病菌、蜜柚黑点病菌、兰花茎基腐病菌和香蕉枯萎病菌中的至少一种。优选地，所述农作物病原真菌为琯溪蜜柚炭疽病菌。

该生物防治菌剂防治方法为：将所述深红紫链霉菌FX28溶液、所述深红紫链霉菌FX28发酵液、所述深红紫链霉菌FX28的发酵上清液、所述深红紫链霉菌FX28发酵上清液的1-10倍稀释液中至少一种，施用于农作物叶片或根茎部位。

通过系列试验证明：本深红紫链霉菌(Streptomyces violaceorubidus)FX28菌株抑菌谱广，对琯溪蜜柚炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)、辣椒枯萎病菌(Fusarium oxysporium)、榕树炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、多肉黑斑病菌(Alternaria alternata)、蜜柚黑点病菌(Diaporthesp)、蜜柚黑斑病菌(Phyllosticta citriasiana)、香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusariumoxysporium f sp.cubense)、兰花茎腐病菌(Fusarium sp.)、水稻恶苗病菌(Fusariummoniliforme)、玉米穗腐病菌(Fusarium porliferatum)、辣椒根腐病菌(Fusarium sp.)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)均有抑菌活性。

深红紫链霉菌(Streptomyces violaceorubidus)FX28菌株对琯溪蜜柚炭疽病菌的平板对峙试验中活菌抑菌带宽度达12.0～13.1mm，发酵液生长速率法测定菌丝抑制率达到85.52％～87.34％，发酵液悬滴法测定孢子萌发抑制率，发酵液浓度为50％时，抑制率达90.52％，人工接种防治试验表明其发酵液中生物活性物质对琯溪蜜柚炭疽病具有显著的防治效果，保护作用和治疗作用分别达84.31％和71.67％，与生产上防治琯溪蜜柚炭疽病的化学药剂相比其防治效果差异不显著，且具备低毒、无残留、与环境友好的优点。

再其次，本发明还提供了一种生物防治菌剂的制备方法。

包括发酵步骤：于培养基中发酵培养所述的深红紫链霉菌FX28，并获得所述深红紫链霉菌FX28发酵液。

进一步地，还包括离心过滤步骤：对所述所述深红紫链霉菌FX28发酵液进行过滤，得到所述深红紫链霉菌FX28发酵上清液。

进一步地，所述培养基按质量体积百分比计，包括以下原料：酵母提取物0.1％～0.5％，麦芽浸粉1.0％～10.0％，葡萄糖0.1％～0.5％，碳酸钙0.1％～0.5％，NaCl 0.1％～0.5％。优选地，所述培养基包括以下原料：酵母提取物0.2％；麦芽浸粉5.0％；葡萄糖0.2％；碳酸钙0.3％；NaCl 0.2％。

进一步地，所述培养基的pH为7.0～7.2；所述发酵培养的条件为：发酵温度26～30℃，转速150～200r/min下培养6～8天。

有益效果：

本发明通过对健康甜椒植株根际土壤进行微生物分离和病原菌对峙培养，分离纯化得到了一株对人畜安全、抑菌谱广、具有较好应用前景的生防菌株-深红紫链霉菌FX28菌株。该深红紫链霉菌FX28菌株的发酵液对多种供试病原菌菌丝生长均有一定的抑制作用，对蜜柚炭疽病菌、番茄叶霉病菌、辣椒枯萎病菌具有较强的抑制作用，其抑制率均大于85％；对榕树炭疽病菌、多肉黑斑病菌、辣椒根腐病菌、蜜柚黑点病菌、兰花茎基腐病菌、香蕉枯萎病菌的抑制率大于60％。丰富了生防资源。

该深红紫链霉菌FX28菌株可用于防治琯溪蜜柚炭疽病，FX28菌株发酵液对琯溪蜜柚炭疽病菌孢子萌发具有良好的抑制作用，发酵液原液对孢子有很强的抑制作用，抑制率达100％，当发酵液稀释到30％时，抑制率达79％以上，同时促进琯溪蜜柚植株的生长。

本发明所提供的包含有深红紫链霉菌FX28和/或所述深红紫链霉菌FX28发酵代谢产物的生物防治菌剂，属于生物制剂，用来防治琯溪蜜柚炭疽病，防治效果好，解决了现有技术中化学防治带来的病原菌抗药性、果实农药残留、生态平衡遭到破坏、严重污染人类赖以生存的自然环境等问题，不会对环境和生态造成污染，可减少生产中化学药剂的使用量和残留量，降低用药成本，同时改善生态环境，有利于琯溪蜜柚的无公害生产。

附图说明

图1深红紫链霉菌FX28菌株依据16S rDNA序列构建的系统发育树。

图2深红紫链霉菌FX28菌株的孢子链和孢子形态(光学显微镜下40×)。

图3深红紫链霉菌FX28菌株的气生菌丝和孢子丝形态(光学显微镜下40×)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

实施例1：深红紫链霉菌FX28菌株的获得

选择福建省漳州市南靖县靖城镇草坂村的琯溪蜜柚改种甜椒的甜椒植株的根际土壤，铲去表土层，取10-15cm处土样，将土壤样品用无菌水稀释10³倍，利用高氏一号培养基在28℃条件下培养，采用常规的PDA平板稀释培养法分离获得。分离纯化后的深红紫链霉菌(Streptomyces violaceorubidus)FX28转入高氏一号培养基，在28℃条件下培养、扩繁后得到深红紫链霉菌FX28菌株。该深红紫链霉菌FX28菌株于2018年5月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.15771，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

高氏一号培养基及PDA平板培养基的制作参见中国农业出版社1998年出版的方中达著作的植病研究方法。

实施例2：深红紫链霉菌FX28菌株在各种培养基上的培养特征

将深红紫链霉菌FX28菌株分别接种于8种不同的培养基，28℃培养36～48h开始有菌落出现，72～96h后孢子开始产生。菌落多褶皱，不易挑起，直径为1.5～1.8cm，孢子堆颜色浅灰色至深灰色。不同的培养基上菌落的形态、孢子丝的颜色、气生菌丝的颜色、基内菌丝的颜色、产生可溶性色素、生长情况均有不同，根据《链霉菌鉴定手册》提供的方法和色版进行观察、比对，结果如表1所示。

表1 菌株FX28在各种培养基上的培养特征

注：“—”：不产可溶性色素，“+”：越多生长越旺盛

从表1结果可知：将深红紫链霉菌FX28菌株在多数培养基上产生可溶性色素；气生菌丝由浅粉色变为强烈红色或暗红色、基内菌丝为浅黄粉至暗红色。

该深红紫链霉菌FX28菌株，能使明胶液化、牛奶凝固而不胨化、水解淀粉，不能使纤维素分解、硝酸盐还原和色氨酸分解，也不能产生H₂S和黑色素；可以利用蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、甘油、D-阿拉伯糖、鼠李糖、D-甘露醇、α-半乳糖、肌醇、D-木糖作为碳源生长，不能利用棉子糖、D-果糖。可利用L-赖氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、天冬酰胺、L-酪氨酸、L-色氨酸作为氮源生长，不能利用L-谷氨酸。对NaCl的耐受性较强，能在含5％NaCl的培养基上生长，对温度也有较强的耐受性，可在10～38℃之间生长，28℃为生长最适温度,菌株适宜生长的pH范围6.5～8.5之间，最适pH为7.2，能耐受6～12的pH范围。

该深红紫链霉菌FX28菌株，在高氏一号培养基上生长茂盛，气生菌丝丰茂，28℃培养1～6d菌落光滑、无孢子生成，第7d开始有灰白色孢子丝从菌落中间长出，5d后开始逐渐变为灰色至深灰色，能产生紫红色水溶性色素。

该深红紫链霉菌FX28菌株，在显微镜下观察，基内菌丝无横隔膜，弯曲，高度分枝，孢子丝松敞或紧密螺旋形，时常不规则，丛生或轮生，孢子丝成熟后形成串珠状的孢子链，孢子丝断裂后形成椭球形孢子。

实施例3：16S rDNA序列分析：

细菌基因组提取试剂盒提取菌株FX28基因组DNA后，采用16S三段引物为518R：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'、1100R:5'-GGGTTGCGCTCGTTG-3'和926F:5'-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3'，进行16S rDNA的PCR扩增。回收PCR扩增产物，经连接、转化、鉴定后，阳性克隆送生工生物工程(上海)有限公司测序，序列全长为1295bp。将所得序列提交到GenBank数据库进行BLAST分析比对，发现与FX28同源性较高的菌株均属于链霉菌属，选取10个典型菌株的16S rDNA序列用MEGA5.0软件构建系统发育树(图1)。结果表明，菌株FX28与Streptomyces violaceorubidus(基因登录号NR042309)相似性达到99％，并结合形态学特性和培养特征，将菌株FX28鉴定为深红紫链霉菌(Streptomycesviolaceorubidus)。

本发明中深红紫链霉菌FX28菌株经生工生物工程(上海)有限公司检测鉴定，其16S rRNA基因序列如下(全长为1295bp)：

TGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGATCCTCGCAGGCATCTGTGAGGTTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACTCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCAAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGT

实施例4：深红紫链霉菌FX28菌株的抑菌试验

A、平板对峙法：采用平板对峙法测定深红紫链霉菌FX28菌株对植物病原菌的拮抗作用。先将供试病原菌进行平板活化，再打制成菌饼(Φ＝4mm)，菌饼紧贴培养基的表面，供试病原菌的菌饼带菌丝的一面朝下紧贴于PDA平板(Φ＝90mm)中央，在其两侧25mm处放置2个(Φ＝4mm)纸片，然后用无菌移液枪吸取100uL的发酵液分别滴在2个纸片上，做好标记，每处理重复3次。28℃培养3～7d后，测量拮抗菌菌落边缘与病菌菌落边缘之间的抑菌距离(见表2)。

表2深红紫链霉菌FX28菌株对13种植物病原菌菌丝生长拮抗作用

注：表中数据为平均数±标准差。同列数据后不同大、小写字母表示经Duncan

氏新复极差方法检验在P<0.01和P<0.05水平差异显著，下同。

从表2结果可知：深红紫链霉菌FX28菌株对所有供试病原真菌均有一定的拮抗作用。其中对蜜柚炭疽病菌、蜜柚黑星病菌、番茄叶霉病菌、辣椒枯萎病菌、榕树炭疽病菌、多肉黑斑病菌有较强的拮抗作用，其抑菌带大于10mm；对其它7种供试病原真菌的拮抗作用较弱，其抑菌带均小于10mm。

B、制抑菌丝生长速率法：采用菌丝生长速率法测定深红紫链霉菌FX28菌株发酵液的抑菌活性。用冷却至45℃的PDA培养基将发酵产物稀释10倍后，取10mL含毒培养基倒入直径9.0cm的灭菌培养皿内，制成平板，以加无菌水培养基的PDA平板为对照，再将病原菌菌饼(Φ＝4mm)置于平板中央，于28℃下培养3～7d，用十字交叉法测量供试病原真菌菌落生长直径，重复3次，计算菌丝生长抑制率(见表3)。

菌落直径(mm)＝测量直径-菌饼直径

菌丝生长抑制率＝(对照菌落生长直径－处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径×100％

表3 深红紫链霉菌FX28菌株发酵液对13种植物病原菌菌丝生长的抑制作用

从表3结果可知：，深红紫链霉菌FX28菌株的发酵液对多种供试病原菌菌丝生长均有一定的抑制作用，对蜜柚炭疽病菌、番茄叶霉病菌、辣椒枯萎病菌具有较强的抑制作用，其抑制率均大于85％；对榕树炭疽病菌、多肉黑斑病菌、辣椒根腐病菌、蜜柚黑点病菌、兰花茎基腐病菌、香蕉枯萎病菌的抑制率大于60％。

C、抑制孢子萌发法：采用悬滴法测定菌株发酵液对供试植物病原真菌孢子萌发的抑制作用。将培养好的病原真菌孢子用无菌水从培养基上洗脱，用多层纱布过滤除以除去病菌菌丝，再加入一定量的吐温-80的葡萄糖，充分振荡使孢子团分散，制成孢子悬浮液。孢子浓度以在显微镜下观察时每视野的分生孢子量为20～30个为宜。将药液以孢子悬浮液稀释成梯度浓度，设置溶剂及空白对照。将药液滴加于凹玻片的凹槽处，每个浓度重复3次，将滴加好药剂孢子混合液的载玻片放在保湿的培养皿中，置25℃培养箱中，4h后开始检查萌发率。在低倍镜下每重复随机检查200个孢子，凡孢子的芽管超过孢子短直径之半时判为萌发孢子，计算孢子萌发抑制率(结果见表4)。

萌发率＝萌发孢子数/萌发孢子数×100％

抑制率＝(对照孢子萌发率－处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率×100％

表4 深红紫链霉菌FX28菌株发酵液对琯溪蜜柚炭疽病菌孢子萌发的抑制作用

从表4结果可知：深红紫链霉菌FX28菌株发酵液对琯溪蜜柚炭疽病菌孢子萌发具有良好的抑制作用，发酵液原液对孢子有很强的抑制作用，抑制率达100％，当发酵液稀释到30％时，抑制率达79％以上。

实施例5：生物防治菌剂A-深红紫链霉菌FX28发酵上清液5倍稀释液的制备

首先按照发酵培养基配方(w/v)：酵母提取物0.2％、麦芽浸粉5％、葡萄糖0.2％、CaCO₃ 0.3％、NaCl 0.2％、pH值7.0，用自来水配制相应的发酵培养基，用500ml的三角摇瓶每瓶分装150ml,高压蒸汽灭菌30分钟；其次将深红紫链霉菌FX28菌株，以无菌方法接种于上述已配制分装并灭菌好的发酵培养基中，八层纱布封口扎紧，置于180r/min旋转摇床上，28℃恒温振荡培养7d，得到发酵醪液；然后将上述发酵醪液以6000r/min离心15min，通过除菌滤器除去菌丝体，获得发酵上清液，对该发酵上清液稀释5倍，即为生物防治菌剂A。

实施例6：生物防治菌剂B-深红紫链霉菌FX28发酵液的制备

首先按照发酵培养基配方(w/v)：酵母提取物0.1％、麦芽浸粉10％、葡萄糖0.1％、CaCO₃ 0.1％、NaCl 0.1％、pH值7.2，用自来水配制相应的发酵培养基，用500ml的三角摇瓶每瓶分装250ml,高压蒸汽灭菌45分钟；其次将深红紫链霉菌FX28菌株，以无菌方法接种于上述已配制分装并灭菌好的发酵培养基中，八层纱布封口扎紧，置于150r/min旋转摇床上，26℃恒温振荡培养8d，得到发酵液，即为生物防治菌剂B。

实施例7：生物防治菌剂C-深红紫链霉菌FX28发酵上清液的制备

首先按照发酵培养基配方(w/v)：酵母提取物0.5％、麦芽浸粉1％、葡萄糖0.5％、CaCO₃ 0.5％、NaCl 0.5％、pH值7.1，用自来水配制相应的发酵培养基，用500ml的三角摇瓶每瓶分装100ml,高压蒸汽灭菌25分钟；其次将深红紫链霉菌FX28菌株，以无菌方法接种于上述已配制分装并灭菌好的发酵培养基中，八层纱布封口扎紧，置于200r/min旋转摇床上，30℃恒温振荡培养6d，得到发酵醪液；然后将上述发酵醪液以4000r/min离心30min，通过除菌滤器除去菌丝体，获得发酵上清液，即为生物防治菌剂C。

实施例8：生物防治菌剂对琯溪蜜柚炭疽病防治试验。

琯溪蜜柚炭疽病病原菌侵染：接种用1a生琯溪蜜柚嫁接苗，将琯溪蜜柚炭疽病菌在PDA培养基26℃恒温培养5～7d后，用7mm打孔器打菌饼备用，用5号昆虫针(Φ＝0.7mm)刺伤叶面(嫩叶)，挑取病菌菌饼(Φ＝4mm)倒扣于叶片边缘，每片叶子接一块菌饼，用脱脂棉蘸无菌水保湿，没处理5株，每株3片叶子，3次重复，保湿7天后去除菌饼。

发酵液抑菌对比：于接种前15d、10d、5d和接种处理去掉菌饼后5d、10d、15d，分别将FX28发酵上清液5倍稀释液(生物防治菌剂A)、50％多菌灵的600倍稀释液、70％丙森锌600倍稀释液及清水对照均匀喷洒于被琯溪蜜柚炭疽病菌侵染的叶片上，定时观察叶片发病情况，计算防治效果(如表5)。

防治效果(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100％病情指数分级标准，参考柑橘炭疽病叶片分级标准:

0级：无病斑；

1级：病斑面积占整个叶片面积的5％以下；

3级：病斑面积占整个叶片面积的6％～10％；

5级：病斑面积占整个叶片面积的11％一25％；

7级：病斑面积占整个叶片面积的26％～50％；

9级：病斑面积占整个叶片面积的51％以上。

表5 放线菌FX28对琯溪蜜柚炭疽病的盆栽防治效果

从表5结果可知：去掉菌饼15d后调查发病率和病情指数，对照叶片发病率和病情指数分别为84.45％和31.36；病原菌接种前喷洒深红紫链霉菌FX28 5倍稀释液处理的叶片发病率为17.78％，病情指数为4.94，病原菌接种后喷洒深红紫链霉菌FX28发酵上清液5倍稀释液(生物防治菌剂A)处理的发病率和病情指数分别为35.55％和8.89，保护作用和治疗作用分别为84.31％和71.67％；用50％多菌灵的600倍稀释液和70％丙森锌600倍稀释液处理的保护作用分别为87.45％和88.22，治疗作用分别为73.99％和73.96％。实验发现对照叶片在之后几周病斑扩大，有的嫩叶腐烂，干燥后病斑处可见黑色的分生孢子器；经过药剂处理的叶片病斑几乎没有继续扩大，病斑处未见分生孢子器。实验结果表明，深红紫链霉菌FX28发酵上清液5倍稀释液(生物防治菌剂A)对琯溪蜜柚炭疽病菌有显著的抑制作用，即使蜜柚感染了炭疽病，也有较好的防治效果；虽然其保护作用和治疗作用略低于50％多菌灵的600倍稀释液和70％丙森锌600倍稀释液，但差异不显著。

用生物防治菌剂B和生物防治菌剂C，对琯溪蜜柚炭疽病进行防治试验，试验结果同样证明：生物防治菌剂B和生物防治菌剂C对琯溪蜜柚炭疽病菌有显著的抑制作用，即使蜜柚感染了炭疽病，也有较好的防治效果。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都涵盖在本发明范围内。

深红紫链霉菌FX28菌株16S rRNA基因序列表

序列表

<110> 漳州市农业科学研究所

<120> 深红紫链霉菌及其生物防治菌剂和制备方法

<130> 1

<141> 1

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 16S rRNA

<211> 1295

<212> DNA

<213> Streptomyces violaceorubidus

<400> 1

tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgggcaat ctgccctgca ctctgggaca agccctggaa 60

acggggtcta ataccggata ctgatcctcg caggcatctg tgaggttcga aagctccggc 120

ggtgcaggat gagcccgcgg cctatcagct tgttggtgag gtaatggctc accaaggcga 180

cgacgggtag ccggcctgag agggcgaccg gccacactgg gactgagaca cggcccagac 240

tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gaaagcctga tgcagcgacg 300

ccgcgtgagg gatgacggcc ttcgggttgt aaacctcttt cagcagggaa gaagcgaaag 360

tgacggtacc tgcagaagaa gcgccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 420

gggcgcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagagct cgtaggcggc ttgtcacgtc 480

ggttgtgaaa gcccggggct taactccggg tctgcagtcg atacgggcag gctagagttc 540

ggtaggggag atcggaattc ctggtgtagc ggtgaaatgc gcagatatca ggaggaacac 600

cggtggcgaa ggcggatctc tgggccgata ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc 660

gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacgg tgggcactag gtgtgggcaa 720

cattccacgt tgtccgtgcc gcagctaacg cattaagtgc cccgcctggg gagtacggcc 780

gcaaggctaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggcggag catgtggctt 840

aattcgacgc aacgcgaaga accttaccaa ggcttgacat acaccggaaa gcatcagaga 900

tggtgccccc cttgtggtcg gtgtacaggt ggtgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 960

agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtc ccgtgttgcc agcaggccct 1020

tgtggtgctg gggactcacg ggagaccgcc ggggtcaact cggaggaagg tggggacgac 1080

gtcaagtcat catgcccctt atgtcttggg ctgcacacgt gctacaatgg ccggtacaat 1140

gagctgcgat accgcaaggt ggagcgaatc tcaaaaagcc ggtctcagtt cggattgggg 1200

tctgcaactc gaccccatga agtcggagtc gctagtaatc gcagatcagc attgctgcgg 1260

tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgt 1295

Claims (10)

1.一株深红紫链霉菌，其特征在于：该菌株的分类命名为(Streptomycesviolaceorubidus)FX28，其保藏编号为CGMCC No.15771。

2.如权利要求1所述的一株深红紫链霉菌的应用，其特征在于：所述深红紫链霉菌FX28和/或所述深红紫链霉菌FX28的发酵代谢产物用于制备生物防治菌剂。

3.一种由权利要求1所述的深红紫链霉菌制成的生物防治菌剂，其特征在于：所述生物防治菌剂由所述深红紫链霉菌FX28的溶液、或者所述深红紫链霉菌FX28的发酵液、或者所述深红紫链霉菌FX28的发酵上清液的一种或者多种混合而成。

4.根据权利要求3所述的生物防治菌剂，其特征在于：所述生物防治菌剂用于防治农作物病原真菌；所述的农作物病原真菌包括蜜柚炭疽病菌、蜜柚黑星病菌、番茄叶霉病菌、辣椒枯萎病菌、榕树炭疽病菌、多肉黑斑病菌、榕树炭疽病菌、多肉黑斑病菌、辣椒根腐病菌、蜜柚黑点病菌、兰花茎基腐病菌和香蕉枯萎病菌中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的生物防治菌剂，其特征在于：所述农作物病原真菌为琯溪蜜柚炭疽病菌。

6.根据权利要求4或5所述的生物防治菌剂，其特征在于，将所述深红紫链霉菌FX28的溶液、所述深红紫链霉菌FX28的发酵液、所述深红紫链霉菌FX28的发酵上清液、所述深红紫链霉菌FX28的发酵上清液的1-10倍稀释液中至少一种，施用于农作物叶片或茎杆部位。

7.一种如权利要求3至6任一项所述的生物防治菌剂的制备方法，其特征在于，包括发酵步骤：于培养基中发酵培养所述的深红紫链霉菌FX28，并获得所述深红紫链霉菌FX28的发酵液。

8.根据权利要求7所述的生物防治菌剂的制备方法，其特征在于，还包括离心过滤步骤：对所述深红紫链霉菌FX28的发酵液进行过滤，得到所述深红紫链霉菌FX28的发酵上清液。

9.根据权利要求7或8所述的生物防治菌剂的制备方法，其特征在于，按质量体积百分比计，所述培养基包括以下原料：酵母提取物0.1％～0.5％，麦芽浸粉1.0％～10.0％，葡萄糖0.1％～0.5％，碳酸钙0.1％～0.5％，NaCl 0.1％～0.5％。

10.根据权利要求7或8所述的生物防治菌剂的制备方法，其特征在于，所述培养基的pH为7.0～7.2；所述发酵培养的条件为：发酵温度26～30℃，转速150～200r/min下培养6～8天。

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