CN108587969B - 可防治棉花黄萎病的大丽轮枝菌的菌株hcx-01的制备及其应用 - Google Patents

可防治棉花黄萎病的大丽轮枝菌的菌株hcx-01的制备及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可防治棉花黄萎病的大丽轮枝菌的菌株 HCX‑01的制备及其应用。本发明所提供的菌株为Bacillus safensis菌 HCX‑01，是从南阳师范学院棉花试验田中的抗性棉根系土壤菌种中筛选到的芽孢菌菌属，其保藏编号：CCTCC NO.M2018153。本发明提供了HCX‑01菌株用于抑制大丽轮枝菌的应用，及其在棉花黄萎病防治中的应用。HCX‑01能够在人工培养基上培养，容易获得和培养，以利于工厂化生产和推广应用。HCX‑01菌的发酵液对大丽轮枝菌孢子悬液处理12h之后的孢子萌发率仅有9.7%，相对于空白的39.6%有较好的抑制效果。本发明利用生物技术有效的降低了棉花大丽轮枝菌对棉花的危害，同时同化学药剂相比避免了环境污染等方面的问题。

Description

可防治棉花黄萎病的大丽轮枝菌的菌株HCX-01的制备及其 应用
技术领域
本发明属于生物防治植物病害技术领域，具体涉及一种可防治棉花黄萎病的大丽轮枝菌的菌株 HCX-01的制备及其应用。
背景技术
棉花黄萎病是棉花生产上最重要的病害之一。素有棉花“癌症”之称，该病是由大丽轮枝菌引起的一种土传性维管束病害，其病原菌存活力强, 菌核在土壤中无寄主情况下可存活10多年之久，病原菌群体遗传多样性丰富, 易变异等。此外，大丽轮枝菌的寄主范围极广，国外报道可为害38科660种植物，其中农作物184种，杂草153种。我国经鉴定，寄主植物至少20科80种，大田作物包括向日葵、茄子、辣子、番茄、烟草、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜、花生、菜豆、绿豆、大豆、芝麻、甜菜等作物。其中棉花是世界上分布最广、种植面积最大的经济作物之一，也是受危害最为严重的农作物之一，棉花黄萎病是是世界性的危险病害，也是中国棉花生产中的严重病害，并且由于大丽轮枝菌能形成休眠结构的微菌核，其对不良环境有较强的抵抗力，能耐80℃高温和-30℃低温，故在极端条件下可以形成有较强保护作用的微菌核，当外界环境适合其萌发时又可以形成具有较强感病性的真菌状态。我国每年棉花黄萎病的的发病面积将近占全国种植面积的15%~20%，严重年份甚至可以达到50%之多，有些病害严重的种植区域可能会发生绝收的现象。黄萎病不但降低了棉花的产量而且也会降低棉花的纤维品质、种子产量和种子的产油量等，进而造成较为严重的经济损失。
目前，虽然可以通过传统的轮作、土壤改良及化学防治等途径加以控制棉花黄萎病，但是这些方法都具有一定的局限性和不足之处，其操作性、适应性差效果不是很理想，近些年来，随着人们环境意识的增强，化学药物试剂的应用逐步受到限制，除了继续探索低毒，低残留，高选择性的化学农药外，人们更关注开发生防制剂以作为化学农药的补充或替代品。因此，对黄萎病的生防研究自然成为重点和焦点问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述问题，提供一种菌株易培养、对大丽轮枝菌的防治效果高、对环境污染小等益处的可防治棉花黄萎病的大丽轮枝菌的菌株 HCX-01的制备及其应用。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案具体如下：
本发明所提供的菌株为Bacillus safensis菌 HCX-01，是从南阳师范学院棉花试验田中的抗性棉根系土壤菌种中筛选到的芽孢菌菌属，已于2018年04月08日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：湖北省武汉市武昌区八一路229号武汉大学校内），保藏编号：CCTCC NO.M2018153。其具有以下生物学特性：在LB平板培养基上菌落呈圆形，饱满，表面湿润光滑，菌苔亮白色；在扫描电子显微镜下观察形态为杆状细菌、无鞭毛的革兰氏阳性芽孢杆菌，具有高耐盐、耐紫外线和伽马射线等性质，能产脂肪酶、菊粉酶、β-葡萄糖苷酶等。
HCX-01菌株的分离方法为：取南阳师范学院棉花试验田中的抗性棉根系土壤5g，加入到含有100mL无菌水的三角瓶中与37℃、220rpm摇床中培养12h，于超净工作台中取1mL上清液稀释涂布到LB固体培养基中，与37℃恒温箱培养12 h，然后用接种环挑出不同的单菌落转接于LB固体平板进行纯化用于后续的生物活性测试，由此筛选得到菌株HCX-01。
本发明提供了HCX-01菌株的培养方法：
（1）试管种培养
LB液体培养基配方为：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，余下为水。
将HCX-01菌芽孢菌菌体接种到上述培养基上，37℃下培养12h，获得试管种。
（2）液体扩大培养
LB液体培养基配方为：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，余下为水。
将上述试管种培养所得试管种接种到500ml三角瓶LB液体培养基中，每瓶装200ml，于37℃下摇床培养12h，转速为220 rpm。
（3）平皿接种培养
LB固体培养基配方为：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，1.5-2%琼脂。
将上述液体扩大培养所得HCX-01菌芽孢菌菌体接种到LB固体培养基上，37℃下培养12h，获得平皿菌种。
本发明提供了大丽轮枝菌菌饼和孢子悬液的培养方法：
（1）大丽轮枝菌菌饼的培养
PDA液体培养基配方为：20%的马铃薯、2%的葡萄糖、1.5-2%琼脂、余下为水。
将大丽轮枝菌菌种用直径为1cm的打孔器转接到上述PDA液体培养基上，25℃下培养72h，获得大丽轮枝菌菌饼。
（2）大丽轮枝菌孢子悬液的培养
察氏液体培养基配方为：0.3%硝酸钠、0.1%磷酸氢二钠、0.05%硫酸镁、0.05%氯化钾、0.001%硫酸亚铁、3%蔗糖、PH7.1-7.5、余下为水。
将大丽轮枝菌菌种按1:100的比例转接到上述察氏液体培养基，25℃、180r/min摇床培养72h，获得大丽轮枝菌孢子悬液。
本发明提供了上述菌株HCX-01在棉花黄萎病防治中的应用。
本发明提供了上述菌株 HCX-01用于抑制大丽轮枝菌的应用。
本发明提供了上述菌株 HCX-01的培养方法：在LB培养基中，37℃，过夜培养。
本发明的有益效果是：
HCX-01菌株能够在人工培养基上培养，容易获得和培养，用于病害防治的菌株必须能够在人工培养基上培养，以利于工厂化和推广应用。HCX-01菌的发酵液对大丽轮枝菌孢子悬液处理12h之后的孢子萌发率仅有9.7%，相对于空白的39.6%有较好的抑制效果。
本发明利用生物技术有效的降低了棉花大丽轮枝菌对棉花的危害，同时同化学药剂相比避免了环境污染等方面的问题。
附图说明
图1为 HCX-01菌菌饼对大丽轮枝菌菌丝生长的影响；
图2为 HCX-01菌发酵液对大丽轮枝菌孢子萌发的影响；
图3为 盆栽试验(A:未接种大丽轮枝菌和HCX-01菌液的棉花；B:只接种大丽轮枝菌未接种HCX-01菌液的棉花；C:接种大丽轮枝菌和HCX-01菌液的棉花)。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明中使用的培养基配方，如下：
LB液体培养基配方为：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl ，余下为水。
LB固体培养基配方为：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨；1%NaCl；1.5-2%琼脂。
PDA液体培养基配方为：20%的马铃薯、2%的葡萄糖、1.5-2%琼脂、余下为水。
察氏液体培养基配方为：0.3%硝酸钠、0.1%磷酸氢二钠、0.05%硫酸镁、0.05%氯化钾、0.001%硫酸亚铁、3%蔗糖、PH7.1-7.5、余下为水。
实施例1
HCX-01菌株的分离：取南阳师范学院棉花试验田中的抗性棉根系土壤5g，加入到含有100mL无菌水的三角瓶中与37℃、220rpm摇床中培养12h，于超净工作台中取1mL上清液稀释涂布到LB固体培养基中，与37℃恒温箱培养12h，然后用接种环挑出不同的单菌落转接于LB固体平板进行纯化用于后续的生物活性测试，由此筛选得到本发明菌株HCX-01。
实施例2
将HCX-01菌体接种到LB液体培养基试管中（每管装5ml），于37℃、220rpm摇床培养12h，获得试管种。
将试管种转接于新鲜的LB液体培养基试管中（每管装5ml），于37℃、220rpm摇床培养12h，获得活性较强菌液。
取100uL上述菌液涂布于新鲜LB固体培养基上，37℃恒温箱培养12h，获得平皿菌。
实施例3
将实施例2中的试管种接种到250ml三角瓶LB液体培养基中（每瓶装100ml），于37℃、220rpm摇床培养24h，得发酵培养物。
将发酵培养物于8500rpm离心20min，取上清液，用0.22um滤器过滤得到无菌发酵液。
实施例4 HCX-01菌株抑制大丽轮枝菌试验
利用实施例2、实施例3所得菌液、平皿菌和发酵液，测定HCX-01菌对大丽轮枝菌菌丝生长的抑制性试验和对大丽轮枝菌孢子萌发的试验。
1、准备对照组
对照组：对照组均采用相应量的LB培养基为空白对照，其余相同。
2、制备试验用大丽轮枝菌平板及大丽轮枝菌孢子
（1）制备大丽轮枝菌菌饼
将生长状态良好的大丽轮枝菌从原平皿上用直径为1cm的打孔器取下，在超净工作台中接种到新的PDA固体培养基中，于25℃恒温培养至菌落直径为3cm，备用。
（2）制备大丽轮枝菌孢子悬液
在100ml 三角瓶中按1:100的比例在察氏液体培养基中接入大丽轮枝菌孢子菌液，在25℃、180rpm培养至孢子浓度为1×106~1×107cfu/ml备用。
3、试验方法：
（1）抑制菌丝生长试验
取实施例2中HCX-01菌的菌饼在距离真菌菌丝边缘1.5cm处放置，在平皿的对应另一侧放置空白的LB固体培养基饼作为对照，与25℃恒温条件培养并观测抑菌圈的大小。
（2）发酵液抑制孢子萌发的试验
取实施例3中HCX-01菌的发酵液按1:100的比例接种到真菌孢子悬液中，于25℃、180rpm培养12h，镜检观察孢子的萌发情况。
（3）菌液对真菌孢子杀伤实验
取实施例2培养12h后的HCX-01菌的菌液，按1:50的比例接种到真菌孢子浓度为106cfu/mL的100ml的察氏液体培养基中，于25℃、180rpm培养12h，观察孢子数目并统计。
4、试验结果
（1）HCX-01菌菌饼抑制真菌菌丝生长试验
由图1可知，HCX-01菌饼与大丽轮枝菌共培养14天后明显看到HCX-0 1菌饼对大丽轮枝菌菌丝的生长有较强的抑制作用，抑菌圈大小相对于空白对照来说达到1.7cm。
（2）HCX-01菌发酵液抑制真菌孢子萌发的试验
由图2可知，HCX-01菌发酵液抑制真菌孢子的萌发有较好的抑制作用，在HCX-01菌发酵液与大丽轮枝菌共培养14天后抑菌圈大小达到1.8cm。
（3）HCX-01菌发酵液对真菌孢子萌发的抑制实验
表1 HCX-01菌发酵液对大丽轮枝菌孢子萌发的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE002
由表1的8组平行试验结果可知，HCX-01菌的发酵液对大丽轮枝菌孢子悬液处理12h之后的孢子萌发率仅有9.7%，相对于空白的39.6%有较好的抑制效果（萌发率=萌发孢子数/孢子总数）。
实施例5 盆栽试验
取易感病棉种消毒后播种，与25℃条件下恒温培养，待其两片子叶完全展开后采用浇灌法浇灌由实施例2得到的HCX-01菌液，每株棉花浇灌15mL菌液，并每隔一周浇灌一次，连续浇灌3次后接种大丽轮枝菌使其感病，并设置对照。
结果如图3所示，浇灌HCX-01菌液的棉花对大丽轮枝菌有较好的抗性。

Claims (4)

1.沙芬西芽孢杆菌(Bacillus safensis)HCX-01菌株，其特征在于，其保藏编号：CCTCCNO.M2018153。
2.权利要求1所述沙芬西芽孢杆菌(Bacillus safensis)HCX-01菌株在棉花黄萎病防治中的应用。
3.权利要求1所述沙芬西芽孢杆菌(Bacillus safensis)HCX-01菌株用于抑制大丽轮枝菌的应用。
4.权利要求1所述沙芬西芽孢杆菌(Bacillus safensis)HCX-01菌株的培养方法，其特征在于，在LB培养基中，37℃，培养12h。
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