CN113151112B - 一株花生内生细菌洋葱伯克氏菌r-11及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及花生内生细菌洋葱伯克氏菌R‑11及其应用，可有效解决白绢病的防治问题，其解决的技术方案是，所述花生内生细菌洋葱伯克氏菌R‑11，其分类命名为洋葱伯克氏菌（Burkholderia contaminans），已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.21139，保藏日期为2020年11月9日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，本发明的洋葱伯克氏菌R‑11是一株花生内生细菌，其无菌发酵滤液和挥发性气体对花生白绢病菌的生长均具有较强的抑制作用，抑菌率分别达到90.56%和85.07%。室内条件下，该菌对花生白绢病的防治效果为64.78%，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是一株花生内生细菌洋葱伯克氏菌R-11及其应用。
背景技术
花生(Arachis hypogaea)是我国四大油料作物之一，种植历史达数百年，其产量居世界首位，是我国为数不多具有国际市场竞争力的出口创汇型大宗农作物品种之一，但其产量一直受到病虫害的严重影响。其中白绢病对花生的危害呈现逐年加重的趋势。我国的广大花生产区都有白绢病菌的分布，辽宁等北部地区深受其害，长江以南等地也都受到不同程度的危害。该病病原菌的无性世代是半知菌亚门齐整小核菌(Sclerotium rolfsiiSacc.)，有性世代为罗氏阿太菌(Athelia rolfsii)。该病菌寄主范围广泛，能侵染花生、辣椒、油茶、白术等植物，是一种危害严重的土传真菌。目前对花生白绢病的防治方法主要包括轮作、培育抗性品种以及使用化学药剂等，但防治效果都不理想。同时化学药物的大量使用不仅污染环境、破坏生态平衡，而且使病原菌逐渐产生了抗药性，所以寻求安全高效的生物防治办法迫在眉睫。
目前已报道的对花生白绢病菌具有拮抗效果的微生物主要包括真菌、细菌和放线菌等。在人工培养条件下，上述菌株对花生白绢病菌菌丝生长、菌核萌发和白绢病发生有抑制作用，但在生产上大面积成功应用的报道却很少。究其原因是以前绝大多数植物病害生防菌是从植物表面或植物根际土壤微生物中分离筛选得到的，由于这些微生物易受外界条件的影响，并难于在与植物根际、植株体内或叶围习居微生物的竞争中长期占优势，因而极大地影响了其实用价值。而植物内生细菌作为生防因子可以克服以上缺点，它们分布于植物的不同组织中，有充足的营养物质，同时受到植物组织的保护，不受外部恶劣环境如强烈日光、紫外线风雨等的影响，具有稳定的生态环境。因此，内生细菌相对于其它细菌更易发挥生防作用。目前关于花生白绢病菌的生防细菌资源还十分有限，亟待进一步研究，此外这些生防细菌主要分离自植物表面或根际土壤中，还未见有花生内生细菌应用于白绢病生防研究的报道。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一株花生内生细菌洋葱伯克氏菌R-11及其应用，可有效解决白绢病的防治问题。
本发明解决的技术方案是，本发明所述花生内生细菌洋葱伯克氏菌R-11，其分类命名为洋葱伯克氏菌(Burkholderia contaminans)，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.21139，保藏日期为2020年11月9日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
所述的洋葱伯克氏菌R-11在制备拮抗花生白绢病菌的无菌发酵滤液中的应用，所述的无菌发酵滤液是将活化的洋葱伯克氏菌R-11接入含100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中于30℃、200r/min条件下摇培，将摇培3d后的细菌发酵液于10000r/min、4℃条件下离心20min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，所得滤液即为洋葱伯克氏菌R-11无菌发酵滤液。
所述的洋葱伯克氏菌R-11，其挥发性气体对花生白绢病菌生长具有抑制应用。
所述的洋葱伯克氏菌R-11可以有效防治花生白绢病。
本发明的洋葱伯克氏菌R-11是一株花生内生细菌，其无菌发酵滤液和挥发性气体对花生白绢病菌的生长均具有较强的抑制作用，抑菌率分别达到90.56％和85.07％。室内条件下，该菌对花生白绢病的防治效果为64.78％，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明洋葱伯克氏菌R-11对花生白绢病菌的平板拮抗作用示意图。
图2为本发明洋葱伯克氏菌R-11挥发性气体对花生白绢病菌菌丝生长的影响示意图。
图3为本发明洋葱伯克氏菌R-11挥发性气体对花生白绢病菌菌丝形态的影响示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体情况对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
本发明花生内生细菌是从河南省汝南县花生产区的健康花生植株体内共分离到植物内生细菌45株，从中筛选出一株对花生白绢病菌具有高效拮抗活性的内生细菌R-11，该菌在牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养48h，菌落呈淡黄色，隆起，边缘整齐。菌体形态特征为杆状，革兰氏染色阴性，有鞭毛。菌株R-11的生理生化特征为：接触酶反应阴性，淀粉水解阴性，卵磷脂酶反应阴性，吲哚试验阴性，甲基红试验阴性，V-P反应阳性，柠檬酸盐利用试验阳性。将R-11的16S rDNA序列(SEQ ID No.1所示)与Gen Bank中的序列进行BLAST比对，与R-11菌株相似性最高的是Burkholderia contaminans，同源性达到99％。将比对获得的同源序列和测定序列运用Clustal X软件进行多重序列的同源性分析，然后利用MEGA6.05软件构建系统进化树。由构建的系统进化树可以看出，R-11与Burkholderia contaminans同属一个遗传分枝。结合细菌的形态特征和生理生化试验最终确定菌株R-11为洋葱伯克氏菌(Burkholderia contaminans)，该菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21139，保藏日期为2020年11月9日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明洋葱伯克氏菌R-11对花生白绢病菌的生长均具有较强的抑制作用，可以有效防治花生白绢病，相关试验资料如下：
一、洋葱伯克氏菌R-11对白绢病菌的平板拮抗作用
将活化的洋葱伯克氏菌R-11菌株划线接种于PDA平板两侧，再将直径5mm的花生白绢病菌PDA平板培养物点接于平板中央，以只接病原菌的PDA平板为对照，每个处理3个重复。置于25℃恒温培养箱中培养，待对照平板菌丝长满整个平板时，观察白绢病菌生长状态及抑菌带的有无，并记录抑菌带宽度。结果表明洋葱伯克氏菌R-11对花生白绢病菌生长具有明显的抑制作用，抑菌带宽度达到了15mm(图1)。
二、洋葱伯克氏菌R-11无菌发酵滤液对白绢病菌生长的影响
将活化的洋葱伯克氏菌R-11接入含100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中于30℃、200r/min条件下摇培，将摇培3d后的细菌发酵液于10000r/min、4℃条件下离心20min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，所得的滤液即为无菌发酵滤液。将发酵滤液分别稀释2倍、4倍后，按照滤液:PDA为1:4的比例混合，制成带毒平板，然后将直径5mm病原真菌菌饼点接于平板中央。以不接菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基代替无菌发酵滤液为对照。每个处理设置3个重复，25℃恒温培养箱中培养。待对照长满整个平板时，十字交叉法测量菌落直径，并计算细菌发酵滤液原液2倍和4倍稀释液对花生白绢病菌的抑菌率，抑菌率计算公式如下：抑菌率(％)＝[(对照平板菌落直径-带毒平板菌落直径)/(对照平板菌落直径-菌饼直径)]×100％结果表明(表1)，洋葱伯克氏菌R-11无菌发酵滤液对花生白绢病菌的生长具有明显的抑制作用，其无菌发酵液原液对病菌的抑制率达到90.56％，2倍和4倍稀释滤液对病菌仍有73.86％和42.34％的抑制率。
表1洋葱伯克氏菌R-11无菌发酵滤液对白绢病菌的抑制作用
三、洋葱伯克氏菌R-11挥发性气体对花生白绢病菌菌丝生长及形态的影响
将活化的洋葱伯克氏菌R-11接入含100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中于30℃、200r/min条件下摇培1d后，用无菌蒸馏水将菌液的浓度调节为1.0×109cfu/mL，然后以1:20的比例与加热冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨固体培养基混合均匀并倒平板，对照组为不添加洋葱伯克氏菌R-11菌液的固体培养基平板。制备PDA平板，将新鲜的直径5mm花生白绢病菌接种到PDA平板中央，然后将PDA平板倒扣到不同处理的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，用双层封口膜将两个培养皿封住，于25℃恒温培养箱中培养。待对照组PDA平板长满菌丝时，十字交叉法测定不同处理病原菌菌落直径，并计算抑菌率，抑菌率计算方法同上。挑取被洋葱伯克氏菌R-11挥发性气体作用后的花生白绢病菌菌落边缘菌丝，于光学显微镜下观察生长菌丝的形态变化。
结果表明洋葱伯克氏菌R-11挥发性气体能明显抑制花生白绢病菌的生长，抑制率达到85.07％(图2)。在洋葱伯克氏菌R-11挥发性气体作用下，显微镜下可以观察到花生白绢病菌产生了大量丛枝状且弯曲、分叉的畸形菌丝(图3)，挑取畸形的菌丝于PDA培养基上培养，菌丝完全不能生长。
四、洋葱伯克氏菌R-11对花生白绢病的防效作用
将灭菌后的自然土装在塑料盆中，把提前催芽的花生种子播种于盆中，播种30d后选取长势一致的花生苗进行盆栽实验。首先接种病原菌，即直接把花生白绢病菌接种到盆栽土壤中。设置3个处理：处理A将洋葱伯克氏菌R-11发酵液灌入花生根部，每盆50mL；处理B采用50％多菌灵可湿性粉剂1000倍稀释液浇灌处理，每盆50mL；处理C每盆接入50mL无菌水，作为发病对照。每个处理10株花生，且设3次重复。28d后，采取病情指数法进行防治效果测定，花生白绢病病情分级标准见表2。
病情指数＝∑(各级病株数×该病级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)×100防治效果(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100％
表2花生白绢病病情分级标准
| 病级 | 代表值 | 分级标准 |
| 1 | 0 | 花生健康，无症状 |
| 2 | 1 | 花生叶片出现黄化、萎蔫等症状面积不超过总面积25％ |
| 3 | 2 | 花生叶片出现黄化、萎蔫等症状面积占总面积25％～50％ |
| 4 | 3 | 花生叶片出现黄化、萎蔫等症状面积占总面积50％～75％ |
| 5 | 4 | 花生叶片出现黄化、萎蔫等症状面积超过总面积75％，植株枯死 |
结果表明(表3)，单独接种白绢病原菌的花生植株发病严重，花生感病率达到96.67％，病情指数为73.33。而接种多菌灵药剂和洋葱伯克氏菌R-11发酵液可以明显降低花生的感病率和病情指数。28d后，接种R-11发酵液对花生白绢病的相对防效达到64.78％，接种多菌灵药剂的相对防效为35.22％。可以看出接种洋葱伯克氏菌R-11发酵液对花生白绢病的防效优于接种多菌灵药剂。
表3洋葱伯克氏菌R-11对花生白绢病的防治效果
| 处理 | 感病率/％ | 病情指数 | 防治效果/％ |
| A(R-11) | 40.00 | 25.83 | 64.78 |
| B(多菌灵) | 66.67 | 47.50 | 35.22 |
| C(无菌水) | 96.67 | 73.33 | -- |
本发明的洋葱伯克氏菌R-11是一株花生内生细菌，可以在花生体内长期定殖，该菌对花生白绢病菌的拮抗作用明显，其无菌发酵滤液和挥发性气体对白绢病菌菌丝生长均具有较强的抑制效果，对花生白绢病具有很好的生防作用，并且菌株R-11培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
序列表
<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司
河南省科学院
<120> 一株花生内生细菌洋葱伯克氏菌R-11及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1330
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
cgggtgcttg cacctggtgg cgagtggcga acgggtgagt aatacatcgg aacatgtcct 60
gtagtggggg atagcccggc gaaagccgga ttaataccgc atacgatcta cggatgaaag 120
cgggggacct tcgggcctcg cgctataggg ttggccgatg gctgattagc tagttggtgg 180
ggtaaaggcc taccaaggcg acgatcagta gctggtctga gaggacgacc agccacactg 240
ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatttt ggacaatggg 300
cgaaagcctg atccagcaat gccgcgtgtg tgaagaaggc cttcgggttg taaagcactt 360
ttgtccggaa agaaatcctt ggctctaata cagtcggggg atgacggtac cggaagaata 420
agcaccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggtgcaag cgttaatcgg 480
aattactggg cgtaaagcgt gcgcaggcgg tttgctaaga ccgatgtgaa atccccgggc 540
tcaacctggg aactgcattg gtgactggca ggctagagta tggcagaggg gggtagaatt 600
ccacgtgtag cagtgaaatg cgtagagatg tggaggaata ccgatggcga aggcagcccc 660
ctgggccaat actgacgctc atgcacgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct 720
ggtagtccac gccctaaacg atgtcaacta gttgttgggg attcatttcc ttagtaacgt 780
agctaacgcg tgaagttgac cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaaggaa 840
ttgacgggga cccgcacaag cggtggatga tgtggattaa ttcgatgcaa cgcgaaaaac 900
cttacctacc cttgacatgg tcggaatcct gctgagaggt gggagtgctc gaaagagaac 960
cggcgcacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 1020
cgcaacgagc gcaacccttg tccttagttg ctacgcaaga gcactctaag gagactgccg 1080
gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcctc atggccctta tgggtagggc 1140
ttcacacgtc atacaatggt cggaacagag ggttgccaac ccgcgagggg gagctaatcc 1200
cagaaaaccg atcgtagtcc ggattgcact ctgcaactcg agtgcatgaa gctggaatcg 1260
ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggtcttgt acacaccgcc 1320
cgtcacacca 1330
Claims (5)
1.一株花生内生细菌洋葱伯克氏菌R-11，其特征在于，其分类命名为洋葱伯克氏菌（Burkholderia contaminans），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 21139，该菌株的16S rDNA序列基因序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述的洋葱伯克氏菌R-11的无菌发酵滤液在拮抗花生白绢病菌中的应用。
3.根据权利要求2所述的洋葱伯克氏菌R-11的无菌发酵滤液在拮抗花生白绢病菌中的应用，其特征在于，所述的无菌发酵滤液是将活化的洋葱伯克氏菌R-11接入含100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中于30℃、200r/min条件下摇培，将摇培3d后的细菌发酵液于10000r/min、4℃条件下离心20min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，所得滤液即为洋葱伯克氏菌R-11无菌发酵滤液。
4.权利要求1所述的洋葱伯克氏菌R-11在防治花生白绢病中的应用。
5.权利要求1所述的洋葱伯克氏菌R-11的挥发性气体在抑制花生白绢病菌生长中的应用。
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