CN113755393A - 一株贝莱斯芽孢杆菌hp-24及其在制备防治瓜类细菌性果斑病菌液中的应用 - Google Patents

一株贝莱斯芽孢杆菌hp-24及其在制备防治瓜类细菌性果斑病菌液中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株贝莱斯芽孢杆菌HP‑24及其在制备防治瓜类细菌性果斑病菌液中的应用，可有效解决瓜类病原菌西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli）引起的果斑病的防治用菌液，实现对果斑病的生物防治问题。一株贝莱斯芽孢杆菌HP‑24，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22973，保藏日期为2021年7月28日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该贝莱斯芽孢杆菌HP‑24具有凋亡瓜类病原菌西瓜嗜酸菌之功能，有效用于制备防治瓜类细菌性果斑病菌液，实现对果斑病的防治。本发明可有效防治西瓜嗜酸菌引起的瓜类细菌性果斑病，开拓了果斑病的生物防治新途径，有显著的经济和社会效益。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌HP-24及其在制备防治瓜类细菌性果斑 病菌液中的应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别是一株贝莱斯芽孢杆菌HP-24及其在制备防治瓜类细菌性果斑病菌液中的应用。
背景技术
瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch,BFB)是由西瓜嗜酸菌(Acidovoraxcitrulli)引起的，可侵染叶部和果实，是瓜类生产上的主要病害。瓜类细菌性果斑病的发病特点为发病速度快、危害严重、频繁发生、防治困难。瓜类细菌性果斑病已经对中国、美国、澳大利亚、日本、韩国等许多国家的瓜类产业造成巨大的经济损失，引起了国内外学者的高度重视。
目前瓜类细菌性果斑病的防治主要以化学药物为主，喷施农用硫酸链霉素、铜制剂以及抗生素等。长期大量使用化学农药不仅污染生态环境，危害人类健康，还会造成病原菌的耐药性以及病害的再次发生等问题。因此，寻求具有生防功能的微生物防治瓜类细菌性果斑病具有重要意义。目前，国内外对果斑病生物防治报道的有Pseudomonasfluorescens(A506)、非致病性A.avenae subsp.avenae(AAA-99-2)、荧光假单胞菌工程菌株、酵母菌以及部分芽孢杆菌等。但是采用贝莱斯芽孢杆菌HP-24对瓜类细菌性果斑病进行生物防治至今未见有公开报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一株贝莱斯芽孢杆菌 HP-24及其在制备防治瓜类细菌性果斑病菌液中的应用，可有效解决瓜类病原菌西瓜嗜酸菌 (Acidovorax citrulli)引起的果斑病的防治用菌液，实现对果斑病的生物防治问题。
本发明解决的技术方案是，一株贝莱斯芽孢杆菌HP-24，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22973，保藏日期为 2021年7月28日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
该贝莱斯芽孢杆菌HP-24具有凋亡瓜类病原菌西瓜嗜酸菌(Acidovoraxcitrulli)之功能，有效用于制备防治瓜类细菌性果斑病菌液，实现对果斑病的防治。
所述防治瓜类细菌性果斑病菌液的制备方法是，将贝莱斯芽孢杆菌HP-24接种于菌株培养基中，所述的菌株培养基为牛肉膏0.8-1.0％、麸皮1.2-1.4％、氯化钾0.7-0.9％加蒸馏水至100％制成，在30℃，180r/min条件下，培养24h，成菌落数为105.3×107CFU/mL～105.3 ×108CFU/mL的发酵菌液，即防治瓜类细菌性果斑病的菌液。
本发明提供了一株新的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HP-24，该菌株具有对果斑病病原菌的拮抗和抑制作用，可有效防治西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)引起的瓜类细菌性果斑病，开拓了果斑病的生物防治新途径，有显著的经济和社会效益。
附图说明
图1为本发明菌株HP-24菌落形态图。
图2为本发明菌株HP-24对果斑病病原菌的抑制作用显示图。
图3为本发明菌株HP-24制备的菌液(发酵液)与无菌株HP-24菌液(无菌株发酵液)对果斑病病原菌西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)抑制作用对比图。
图4为本发明培养基不同碳源对菌株生长的影响关系图。
图5为本发明菌株培养基牛肉膏浓度对菌株生长的影响曲线图。
图6为本发明培养基不同氮源对菌株生长的影响关系图。
图7为本发明菌株培养基麸皮浓度对菌株生长的影响曲线图。
图8为本发明培养基不同无机盐对菌株生长的影响关系图。
图9为本发明菌株培养基氯化钾浓度对菌株生长的影响曲线图。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施时，一株贝莱斯芽孢杆菌HP-24，从河南省周口市太康县种植西瓜的土壤中筛选分离，得到的一株对瓜类细菌性果斑病具有良好拮抗和抑制西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli）作用的菌株，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22973，保藏日期为 2021年7月28日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
该菌株具有良好的拮抗和抑制西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)的功能，可有效用于制备防治瓜类细菌性果斑病的菌液，实现有效防治类细菌性果斑病，所述的防治瓜类细菌性果斑病的菌液的制备方法是，将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HP-24接种于菌株培养基中，所述的菌株培养基为牛肉膏1％、麸皮1.3％、氯化钾0.7％加蒸馏水至100％制成，在30℃，180r/min条件下，培养24h，成菌落数为105.3×107CFU/mL的发酵菌液，即防治瓜类细菌性果斑病的菌液。
本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HP-24具有良好拮抗和抑制西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)作用，所制成的菌液可有效用于防治瓜类细菌性果斑病，并经实验取得了非常好的有益技术效果，有关资料如下：
一、菌株的筛选与鉴定
本发明贝莱斯芽孢杆菌HP-24从河南省周口市太康县种植西瓜的土壤中分离，是一株对瓜类细菌性果斑病具有良好拮抗作用的菌株。该菌株在NA培养基上培养，所述的NA培养基是由：蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、NaCl 5.0g、琼脂18.0g加蒸馏水1000mL制成，pH7.3， 30℃，培养24h，菌落白色，近圆形，表面突起有褶皱，不透明(如图1)，在显微镜下观察呈杆状，产芽孢，芽孢卵圆形，革兰氏染色阳性；生理生化特性为接触酶阳性，明胶水解阳性，淀粉水解阳性，卵磷脂酶反应阴性，甲基红试验阴性，VP试验反应阳性，柠檬酸盐利用阳性。将菌株HP-24的16S rRNA基因序列通过BLAST软件进行同源性比较，筛选出同源性较高的参考菌株16S rRNA序列，菌株HP-24的测序结果如下：
Figure BDA0003294381060000031
通过MEGA6.0软件构建系统进化树：
Figure BDA0003294381060000041
由系统进化树可以看出，HP-24与Bacillus velezensis同属一个遗传分枝。结合形态特征及生理生化试验，确定菌株HP-24为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22973，保藏日期为2021年7月28日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所
二、菌株的活性试验
1、贝莱斯芽孢杆菌HP-24对果斑病病原菌的拮抗作用试验。
将菌株HP-24和病原菌在NB培养基中，所述的NB培养基是由：蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、NaCl 5.0g和蒸馏水1000mL制成，pH7.3，30℃，180r/min，培养24h后制成菌悬液，吸取2mL病原菌液于KB平板上，轻轻晃动平板，将菌液布满整个平板，然后将多余的菌液吸出，无菌环境中晾干培养基平板表面，在涂好病原菌液的NA平板上用无菌打孔器打孔，分别吸取菌株HP-24菌悬液50μL，30℃，培养48h，观察抑菌效果。从抑菌效果来看，菌株HP-24 的抑菌圈直径可以达到24.0mm(见图2)。
2、有菌株HP-24与无菌株HP-24发酵液对病原菌的抑制作用对比试验。
将菌株HP-24接种到100mL NB培养基中，30℃，180r/min，培养24h，发酵液于10000r/min， 4℃，离心20min，再用滤膜孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤上清，得无菌发酵液。在涂好病原菌液的NA平板上用无菌打孔器打孔，分别吸取带菌发酵液和无菌发酵液各50μL及离心得到的菌体，30℃，48h，观察抑菌效果。结果如图3所示，有菌发酵液及菌体对病原菌有抑制作用，而无菌发酵液对病原菌无抑制作用。抑菌机制可能是由于生防菌占据生态位点，与病原菌竞争营养物质或生存空间，或对病原菌产生直接寄生作用，也可以诱导宿主自身抗病性。
3、不同浓度菌株HP-24菌液的抑菌实验
将菌株HP-24接种到100mL NB培养基中，30℃，180r/min，培养24h，用无菌的NB培养基分别稀释2、4、8倍。在涂好病原菌液的NA平板上用无菌打孔器打孔，分别吸取不同稀释倍数的菌液各50μL，30℃，培养48h，观察抑菌效果。不同浓度的菌液对病原菌的抑制作用如表1所示：
表1不同浓度菌液抑菌圈的大小
Figure BDA0003294381060000051
结果表明高浓度的菌液抑菌效果最好，随着稀释倍数的增加，抑菌效果逐渐降低，说明发酵液菌体浓度越高，抑菌效果越好。
4、本发明菌株培养基的优化试验。
所述菌株培养基为牛肉膏1％、麸皮1.3％、氯化钾0.7％加蒸馏水至100％制成，其中牛肉膏，麸皮、氯化钾是经过优化得到的，是创造性劳动结晶，有关优化试验资料如下：
(1)、碳源的优化：250mL三角瓶中各装100mL培养基，培养基为：蛋白胨1.0g、氯化钠0.5g和碳源加蒸馏水至100mL制成，分别选取牛肉膏、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉作为碳源，碳源的添加量为0.3g，均调节pH为7.3，设置3个重复，接入种子液 2mL，30℃，180r/min，培养24h，根据活菌数，确定最佳碳源。
250mL三角瓶中装100mL培养基，其中蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，碳源为经优化确定的最佳碳源，设置碳源的含量为0.3、0.5、0.7、0.9、1.1％，调节pH为7.3，设置3个重复，接种量为2％，30℃，180r/min，培养24h，测活菌数。
碳源优化结果如图4、5所示，最佳碳源为牛肉膏，浓度为0.9％，确定菌株培养基加入质量浓度为0.8-1.0％。
(2)、氮源的优化：250mL三角瓶中各装100mL培养基，培养基为：牛肉膏0.3g、氯化钠0.5g和氮源加蒸馏水至100mL制成，分别选取蛋白胨、酵母粉、蛋白胨+酵母粉、尿素、麸皮、硫酸铵作为氮源，氮源的添加量为1.0g,均调节pH为7.3，设置3个重复，接入种子液2mL，30℃，180r/min，培养24h，根据活菌数，确定最佳氮源。
250mL三角瓶中装100mL培养基，其中牛肉膏0.3g，氯化钠0.5g，氮源为经优化确定的最佳氮源，设置氮源的含量为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4％，调节pH为7.3，设置3个重复，接种量为2％，30℃，180r/min，培养24h，测活菌数。
氮源优化的结果如图6、7所示，最佳氮源为麸皮，质量浓度为1.2％，确定本发明菌株培养基的加入质量浓度为1.2-1.4％。
(3)、无机盐的优化：250mL三角瓶中各装100mL培养基，所述培养为：牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g和无机盐加蒸馏水至100mL制成，分别选取氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾作为无机盐，无机盐的添加量为0.5g,均调节pH为7.3，设置3个重复，接入种子液2mL，30℃，180r/min，培养24h，根据活菌数，确定最佳无机盐。
250mL三角瓶中装100mL培养基，其中牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，无机盐为经优化确定的最佳无机盐，设置无机盐的含量为0.3、0.5、0.7、0.9、1.1％，调节pH为7.3，设置3 个重复，接种量为2％，30℃，180r/min，培养24h，测活菌数。
无机盐优化结果如图8、9所示，最佳无机盐为氯化钾，质量浓度为0.7％，确定本发明菌株培养基的加入质量浓度为0.7-0.9％，
5、不同质量浓度正交试验：根据单因素试验结果选择最佳碳源、氮源以及无机盐，对影响发酵液菌落数的最适碳源、氮源及无机盐各因素按不同质量浓度进行正交试验，用3因素 3水平的正交试验优化培养基的主要成分，取平均值，得到最佳培养基组成。
表2 L9(3×3)正交试验因素水平表
Figure BDA0003294381060000061
表3正交试验结果
Figure BDA0003294381060000062
根据正交试验结果比较三种因素的R值可知B>A>C，因此影响发酵液菌落数多少的主次因素依次为麸皮>牛肉膏>氯化钾浓度，根据正交试验结果得出的最优培养基组成为A3B3C2，即牛肉膏1.0％，麸皮1.3％，氯化钾0.7％。
正交试验结果验证：当培养基组成为牛肉膏1.0％，麸皮1.3％，氯化钾0.7％，在30℃， 180r/min条件下，培养24h后测菌落数为105.3×107CFU/mL。
6、室内盆栽试验
采用盆栽西瓜幼苗喷雾法测定菌株HP-24的防治效果。将灭菌的土壤装到塑料花盆中，西瓜种子催芽后种于盆中。当西瓜苗长至2-3片真叶时，将活化好的菌液浓度为108CFU/mL 的菌株HP-24菌悬液喷施到真叶上，晾干后喷雾法接种病原菌西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)于叶片正、背面，30℃连续保湿24h后常规管理，观察发病情况，调查病情指数，计算防治效果，以喷KB液体培养基的处理为对照。每个处理重复3盆，每盆5棵苗。7天后，观察西瓜幼苗的发病情况，计算病叶率、病情指数及防治效果。
发病率(％)＝病叶数/调查总叶数×100
病情指数＝∑(各级病叶数×代表数值)/(调查总叶数×最高病级值)×100
病指防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100
其中病指防效即可代表该菌株的防治效果。
西瓜叶部果斑病的分级标准：
0级：叶片上无斑点(即发育正常)；
1级：叶缘有1-2个病斑，叶面中无病斑；
2级：叶缘病斑增至4-5个，并沿叶脉向叶面发展；
3级：叶缘病斑融合成大病斑，叶面中部病斑出现，但数量不多于2-3个；
4级：整个叶面病斑较多，相互融合成大病斑，并有穿孔和脱落现象；
5级：叶面布满病斑，叶脉也被侵染，穿孔和脱落现象严重。
结果表明喷KB培养基(KB培养基：蛋白胨20.0g，甘油10mL，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2)的对照组植株发病严重，其中病级为3-5级的叶片发病率达 69％，总叶片的发病率达90％，而接种贝莱斯芽孢杆菌HP-24的发酵菌液能明显降低西瓜苗的发病率和病情指数，经检查计算，发病率25％，病情指数15％，根据计算公式：(68-15)÷68 ×100％＝78％，防治效果达到78％，具体见下表：
表4贝莱斯芽孢杆菌HP-24对果斑病的防治效果
Figure BDA0003294381060000071
由以上可以清楚看出，本发明筛选的一株菌株HP-24，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，具有拮抗和抑制引起瓜类细菌性果斑病的西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)的作用，诱导和促使西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)凋亡，将菌株接种于菌株培养基中，制成菌落数为105.3×107CFU/mL的菌液(发酵菌液)，喷施西瓜叶叶片正、背面，有效实现对瓜类细菌性果斑病的防治，防治效果达78％，是防治瓜类细菌性果斑病上的一大创新，有显著的经济和社会效益。
序列表
<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司
<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌HP-24及其在制备防治瓜类细菌性果斑病菌液中的应用
<130> 2021
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1384
<212> DNA
<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)
<400> 1
aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg tgtgacgggc ggtgtgtaca 60
aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga ttccagcttc 120
acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa ctgagaacag atttgtggga ttggcttaac 180
ctcgcggttt cgctgccctt tgttctgtcc attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa 240
ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg cagtcacctt 300
agagtgccca actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa 360
cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc acctgtcact ctgcccccga 420
aggggacgtc ctatctctag gattgtcaga ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg 480
ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag 540
tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg gagtgcttaa tgcgttagct gcagcactaa 600
ggggcggaaa ccccctaaca cttagcactc atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc 660
taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc ctcagcgtca gttacagacc agagagtcgc 720
cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta cgcatttcac cgctacacgt ggaattccac 780
tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt tccaatgacc ctccccggtt gagccggggg 840
ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc gagcccttta cgcccaataa ttccggacaa 900
cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag ttagccgtgg ctttctggtt 960
aggtaccgtc aaggtgccgc cctatttgaa cggcacttgt tcttccctaa caacagagct 1020
ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc cgtcagactt tcgtccattg 1080
cggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg 1140
gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat cgtcgccttg gtgagccgtt acctcaccaa 1200
ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa gtggtagccg aagccacctt ttatgtctga 1260
accatgcggt tcaaacaacc atccggtatt agccccggtt tcccggagtt atcccagtct 1320
tacaggcagg ttacccacgt gttactcacc cgtccgccgc taacatcagg gagcaagctc 1380
ccat 1384

Claims (4)

1.一株贝莱斯芽孢杆菌HP-24，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.22973，保藏日期为 2021年7月28日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌HP-24在制备防治瓜类细菌性果斑病喷施液中的应用。
3.权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌HP-24在制备防治瓜类细菌性果斑病喷施液中的应用，其特征在于，所述的防治瓜类细菌性果斑病喷施液的制备方法是，将贝莱斯芽孢杆菌HP-24接种于菌株培养基中，所述的菌株培养基为牛肉膏0.8-1.0%、麸皮1.2-1.4%、氯化钾0.7-0.9%加蒸馏水至100%制成，在30℃，180r/min条件下，培养24h，成菌落数为105.3×107CFU/mL～105.3×108CFU/mL的发酵菌液。
4.根据权利要求3所述的贝莱斯芽孢杆菌HP-24在制备防治瓜类细菌性果斑病喷施液中的应用，其特征在于，所述的防治瓜类细菌性果斑病喷施液的制备方法是，将贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HP-24接种于菌株培养基中，所述的菌株培养基为牛肉膏1%、麸皮1.3%、氯化钾0.7%加蒸馏水至100%制成，在30℃，180r/min条件下，培养24h，成菌落数为105.3×107CFU/mL的发酵菌液。
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