CN116004468A - 一株耐盐芽孢杆菌b13及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)B13及其应用；该菌株已于2022年12月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，生物保藏号为：CGMCC NO.26273。本发明提供的菌株对甘薯黑斑病病原菌有抑制作用，还能促进甘薯生长、提高甘薯叶片中防御类酶的酶活、提高甘薯根际土壤酶的酶活。同时，以该菌株为活性成分的生物防治菌剂成本低、无污染、防治效果好，是甘薯黑斑病防治中经常使用的化肥、农药的最佳替代品；对于提高甘薯产量具有指导意义，所以本发明的耐盐芽孢杆菌B13具有良好的应用潜力。

Description

一株耐盐芽孢杆菌B13及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一株耐盐芽孢杆菌B13及其应用。

背景技术

甘薯是我国四大经济作物之一，其在我国产量居世界之首。甘薯作为我国粮食品种中的一种常见作物,具有较强的耐旱特点和耐寒特点，在气候较为温暖的地区能够大量生长,甘薯富含淀粉、维生素、膳食纤维、矿物质等营养物质，还有丰富的营养成分，如胡萝卜素、维生素B1、B2、C和铁、钙等矿物质的含量都高于大米和小麦粉，且具有特殊的保健作用，营养价值高，能够滋养心神、补脾益气，对日常疾病进行有效防治，还能作为我国工业生产的主要原料，为我国工业发展整体水平的提高贡献力量。

甘薯黑斑病又称黑疤病，俗称灯头疤子、干烂、黑脚、黑膏药等，是由子囊菌亚门核菌纲球壳菌目甘薯长喙壳菌侵染引起的一种真菌病害。病菌主要以厚垣孢子和子囊孢子在病薯和大田或苗床土壤中以及粪肥、贮藏窖中越冬，成为主要初侵染源。该病能造成产量的巨大损失，一般发病田减产20％～30％，重病田达70％～80％，个别严重田块甚至绝收，病薯中还含有毒素，人畜食用后会引起中毒。

耐盐芽孢杆菌是芽孢杆菌属中的一个种，已有报道指出耐盐芽孢杆菌可以抑制多种植物病原真菌，专利CN111979149A公开了一株耐盐芽孢杆菌SY1836，其对辣椒疫病具有较好的防治效果，还可以显著提高辣椒生长过程中的株高和鲜重，但目前为止，有关耐盐芽孢杆菌防治甘薯黑斑病的报道很少，如《解淀粉芽孢杆菌菌株XZ-1对甘薯黑斑病的生物防治效果研究》(杨冬静等，西南农业学报，2018年31卷4期)，虽然采用甘薯根际土壤筛选出的解淀粉芽孢杆菌菌株XZ-1对甘薯黑斑病进行防治，但通过菌丝形态显微观察尚未发现该菌株对黑斑病菌菌丝有明显抑制作用，该菌株对黑斑病菌产孢类型有较大的影响。而使用传统化学农药产品对环境污染大，残留药品对人体也有一定的危害，寻找新型生物防治产品显得尤为重要，而植物根际优良的微生物资源能够为制造生防产品提供良好的物质基础。因此，筛选能够对甘薯黑斑病具有防治作用的生防菌株具有十分重要的应用价值。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一株耐盐芽孢杆菌B13及其应用。本发明筛选出的耐盐芽孢杆菌B13对甘薯黑斑病的病原菌具有良好的抑制效果，而且可以促进甘薯的生长发育，为甘薯的生产提供了有力保障。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一方面，提供一株耐盐芽孢杆菌B13，其生物保藏号为：CGMCCNO.26273，于2022年12月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

所述耐盐芽孢杆菌B13是从甘薯根际土壤中分离得到，该菌株的菌落及菌体特征为：在LB平板上培养24h后菌落近似圆形，米黄色不透明，边缘不规则，表面干燥且粗糙，菌落直径为4.12mm。菌体呈长杆状，产芽孢，革兰氏阳性。

所述耐盐芽孢杆菌B13的生理生化特征为：V-P实验阴性，淀粉水解实验阳性，山梨醇发酵实验阳性，葡萄糖发酵实验阳性，棉子糖发酵实验阴性，阿拉伯糖发酵实验阴性，木糖发酵实验阴性，甘露醇发酵实验阳性。

所述耐盐芽孢杆菌B13的分子生物学特征为：

该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二方面，提供一种生物防治菌剂，以耐盐芽孢杆菌(Bacillushalotolerans)B13为活性成分。

优选的，所述生物防治菌剂为液体菌剂，其耐盐芽孢杆菌(Bacillushalotolerans)B13的含量大于或等于1×10⁸cfu/mL。

本发明的第三方面，提供生物防治菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将耐盐芽孢杆菌B13接种至液体LB培养基中，培养得到活化菌液；

(2)将活化菌液接种液体LB培养基中进行发酵，得到发酵液，用无菌水将发酵液稀释至耐盐芽孢杆菌B13的含量大于或等于1×10⁸cfu/mL，得到生物防治菌剂。

优选的，步骤(1)中，所述培养为：37℃下，在恒温摇床中培养12h，转速为180rpm。

优选的，步骤(2)中，所述活化菌液的接种量为1vt％；所述发酵为：37℃下，在摇床中培养24h，转速为180rpm。

优选的，所述液体LB培养基的组成为：酵母浸膏，5g；蛋白胨，10g；氯化钠，10g；蒸馏水，1000ml；琼脂，15-20g；121℃灭菌20min；pH7.0。

本发明的第四方面，提供耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)B13或生物防治菌剂在如下1)～5)至少一项中的应用：

(1)抑制甘薯黑斑病病原菌；

(2)制备用于防治甘薯黑斑病病原菌的产品；

(3)促进甘薯生长；

(4)提高甘薯叶片中防御类酶的酶活；

(5)提高甘薯根际土壤酶的酶活。

优选的，所述甘薯黑斑病病原菌为甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata)。

优选的，所述防御类酶包括过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶。

优选的，所述甘薯根际土壤酶包括蔗糖酶、过氧化氢酶、磷酸酶、脲酶。

本发明的有益效果为：

1.本发明从甘薯根际土壤中分离得到一株耐盐芽孢杆菌(Bacillushalotolerans)B13，该菌株具有防治甘薯黑斑病，促进甘薯生长、增强植株防御酶活性，提高土壤酶活的作用。因此，该菌株具备制备微生物菌剂的良好基础，具有良好的应用价值。

2.本发明的菌剂制备方法简单，周期短、成本低、无污染，用于替代防治甘薯黑斑病所用传统化学农药产品，对甘薯生产具有重要的指导意义。

附图说明

图1：菌株B13的平板菌落形态图；

图2：菌株B13的镜检图；

图3：菌株B13的系统进化树图；

图4：菌株B13对甘薯黑斑病菌拮抗效果图；

图5：施加菌剂60d后甘薯主蔓长增长值；

图6：施加菌剂60d后甘薯茎粗增长值；

图7：施加菌剂60d后甘薯叶片过氧化物酶活性；

图8：施加菌剂60d后甘薯叶片过氧化氢酶活性；

图9：施加菌剂60d后甘薯叶片超氧化物歧化酶活性；

图10：施加菌剂120d后甘薯地上鲜重；

图11：施加菌剂120d后甘薯地上干重；

图12：施加菌剂120d后甘薯块根鲜重；

图13：施加菌剂120d后甘薯块根干重；

图14：施加菌剂120d后甘薯产量；

图15：施加菌剂120d后甘薯根际土壤蔗糖酶活性；

图16：施加菌剂120d后甘薯根际土壤过氧化氢酶活性；

图17：施加菌剂120d后甘薯根际土壤磷酸酶活性；

图18：施加菌剂120d后甘薯根际土壤脲酶活性。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1：菌株的分离与鉴定

1.菌株分离与筛选

1.1菌株分离

土壤样品采自山东省济宁市泗水县甘薯种植基地。将采集到的甘薯根际土壤立即进行处理：按每10g土加90mL无菌水的比例放入事先准备好的装有玻璃珠的三角瓶中，置于37℃恒温摇床上180r/min震荡20-30min得到土壤悬液。将土壤悬液梯度稀释成10^-2g/mL、10^-3g/mL、10^-4g/mL、10^-5g/mL、10^-6g/mL等不同浓度梯度。吸取10^-4、10^-5、10^-6三个浓度梯度的土壤悬液100μL置于LB平板培养基中，涂布均匀。37℃恒温培养箱培养24h，挑取单菌落。将获取的菌株用三区划线的方法进行纯化，直至获得单一菌落，并对菌株进行编号，保存于4℃冰箱备用。

1.2拮抗菌的筛选

利用平板对峙法对拮抗菌进行筛选：将保存在斜面上的甘薯黑斑病原菌采用划线方法活化于PDA平板，28℃培养至长满平板。用灭菌的打孔器将甘薯黑斑病的病原菌甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata)做成圆形菌饼，用镊子转接到PDA平板的中间部位，置于28℃培养箱培养3d。用牙签挑取活化好的拮抗菌接种到距病原菌边缘2cm处，置于28℃培养箱继续培养5天，观察是否有抑菌带出现，测量抑菌带的宽度。同时测量抑菌直径，计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(菌落直径D-抑菌直径d)/菌落直径D×100％

选择一株抑菌效果最好的菌株B13，其平板对峙试验的结果见表1与图4。

表1：平板对峙试验结果

由表1可以看出：菌株B13对甘薯黑斑病的病原菌具有较好的抑菌作用。

2菌株B13的形态及生理生化特征测定

2.1菌落特征及菌体形态

在LB培养基上37℃培养24h，菌落表面干燥，不透明，米黄色，边缘不规则或近圆形。显微镜观察菌体形态特征为杆状，单细胞，革兰氏染色为阳性，有芽孢。

2.2生理生化特征

菌株B13 V-P实验阴性，淀粉水解实验阳性，山梨醇发酵实验阳性，葡萄糖发酵实验阳性，棉子糖发酵实验阴性，阿拉伯糖发酵实验阴性，木糖发酵实验阴性，甘露醇发酵实验阳性。

2.3菌株B13的分子生物学鉴定

菌株B13的16S rDNA基因序列，如核苷酸序列表中SEQ ID NO.1所示。将其16SrDNA序列进行BLAST比对，结合菌株的形态、培养特征及生理生化分析结果，初步鉴定菌株B13为耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)。

该菌株B13，分类命名为耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)B13，已于2022年12月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为CGMCCNO.26273。

实施例2：菌株B13菌剂的制备

将平板保存的耐盐芽孢杆菌B13转接到装有10mL液体LB培养基的试管中，放在恒温摇床中培养12h(温度：37℃；转速：180rpm)。将活化好的菌液按1％(体积百分数)接种量接入200mL液体LB培养基中，放入摇床培养24h(温度：37℃；转速：180rpm)即得B13菌株的发酵液；作为生防制剂使用时将发酵液加适量无菌水稀释至1×10⁸cfu/mL即可。

实施例3：

1.盆栽试验设计

试验采用盆栽种植方式，于自然土与基质1：1中进行，选取健康、长势均一的甘薯苗备用，灌根的方式处理甘薯苗，方法如下：移苗后待幼苗长势稳定，将以液体培养方式的黑斑病菌菌丝2g埋入甘薯根部附近，10天后用实施例2制备的B13菌剂处理3株幼苗(1株/盆)，每株施加100mL菌发酵液的稀释液，浓度约为10⁸cfu/mL，浇灌于根系周围，正常管理；化学农药对照为多菌灵1600倍稀释液100mL，空白对照为100mL清水。

2.对盆栽实验甘薯和盆栽土壤进行测定分析：

2.1.防治效果

施加菌剂120天甘薯收获后计算甘薯黑斑病的发病率以及防治效果，评估方法：

0级，薯块表面光滑，无病斑；

1级，薯块有1～2个病斑，病斑直径<0.5cm，病斑不凹陷；

2级，有3～5个病斑，占薯皮表面积1/4～1/3，病斑直径0.5～1.0cm，病斑凹陷，不侵染薯肉；

3级，有病斑5个以上或病斑直径<1.0cm，占薯皮表面积的1/3～1/2，病斑凹陷，侵染薯肉；

4级，严重感病，侵染薯肉，病斑超过薯皮表面积的1/2。

计算公式如下：

发病率(％)＝(发病薯数量/调查总薯数量)×100％

病情指数(％)＝(病级薯数量×发病级别/调查总薯数量×最高发病级别)×100％

防治效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％

2.2甘薯农艺性状及甘薯产量

甘薯农艺性状：对甘薯进行主蔓长、茎粗、鲜重、干重的测定；

甘薯单株结薯产量：对每组处理的结薯重量进行称量。

2.3甘薯叶片防御酶

甘薯叶片酶活：超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)参照李合生主编的《植物生理生化实验原理与技术》，过氧化氢酶(CAT)活性测定参照张志良主编的《植物生理学实验指导》。

2.4甘薯根际土壤酶活

甘薯土壤酶活：蔗糖酶活性采用比3，5-二硝基比色法，脲酶活性采用靛酚比色法，磷酸酶活性磷酸苯二钠比色法，过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法。

2.5数据分析

利用软件GraphPad Prism 9、Excel 2021进行数据的整理、分析和绘图。

3.结果及分析

3.1B13菌剂对甘薯黑斑病的防治效果

菌株B13对甘薯黑斑病的防治结果如表2所示

表2甘薯黑斑病发病率及防治效果

处理	发病率	防治效果
			清水	80％	—
多菌灵1600倍稀释液	70％	52.35％
			B13	50％	84.38％

由表2可知，施加B13菌剂的处理组能够降低甘薯黑斑病的发病率，有良好的防治效果，具有较高的应用潜力。

3.2农艺性状

3.2.1主蔓长增长值

施加菌剂60d后甘薯主蔓长增长值情况如图5所示，B13处理组与对照组相比增加了70.43％，与多菌灵处理组相比增加了48.54％，均达到了显著性差异水平(P<0.05)。

3.2.2茎粗增长值

施加菌剂60d后甘薯茎粗增长值情况如图6所示，B13处理组与对照组相比增加了128.85％，与多菌灵处理组相比增加了85.41％，均达到了显著性差异水平(P<0.05)。

3.2.3地上鲜重

施加菌剂120d后甘薯地上鲜重情况如图10所示，B13处理组与对照组相比增加了15.44％，达到了显著性差异水平(P<0.05)。

3.2.4地上干重

施加菌剂120d后甘薯地上干重情况如图11所示，B13处理组与对照组相比增加了20.79％，达到了显著性差异水平(P<0.05)。

3.2.5块根鲜重

施加菌剂120d后甘薯块根鲜重情况如图12所示，B13处理组与对照组相比增加了69％，达到了显著性差异水平(P<0.05)。

3.2.6块根干重

施加菌剂120d后甘薯块根干重情况如图13所示，B13处理组与对照组相比增加了33.44％，达到了显著性差异水平(P<0.05)。

3.2.7甘薯产量

施加菌剂120d后甘薯产量情况如图14所示，B13处理组与对照组相比增加了53.50％，达到了显著性差异水平(P<0.05)。

综上所述，施加B13菌剂后，可以明显提高甘薯的农艺性状指标和甘薯产量。

3.3甘薯叶片防御酶活

由于多菌灵无提高酶活作用，所以3.3～3.4的酶活试验只以等量清水处理作为对照。

3.3.1过氧化物酶

施加菌剂60d后甘薯叶片过氧化物酶活性情况如图7所示，B13处理组与对照组相比增加了70.45％，达到了显著性差异水平(P<0.05)。

3.3.2过氧化氢酶

施加菌剂60d后甘薯叶片过氧化氢酶活性情况如图8所示，B13处理组与对照组相比增加了18.52％，达到了显著性差异水平(P<0.05)。

3.3.3超氧化物歧化酶

施加菌剂60d后甘薯叶片超氧化物歧化酶活性情况如图9所示，B13处理组与对照组相比增加了8.21％，达到了显著性差异水平(P<0.05)。

综上所述，施加B13菌剂60d时，能够诱导甘薯防御酶活性的增强，进而提高甘薯的抗逆能力。

3.4甘薯根际土壤酶活

3.4.1蔗糖酶

施加菌剂120d后甘薯根际土壤蔗糖酶活性情况如图15所示，B13处理组与对照组相比增加了24.02％，达到了显著性差异水平(P<0.05)。

3.4.2过氧化氢酶

施加菌剂120d后甘薯根际土壤过氧化氢酶活性情况如图16所示，B13处理组与对照组相比增加了6.03％，未达到显著性差异水平(P<0.05)。

3.4.3磷酸酶

施加菌剂120d后甘薯根际土壤磷酸酶活性情况如图17所示，B13处理组与对照组相比增加了25.20％，达到了显著性差异水平(P<0.05)。

3.4.4脲酶

施加菌剂120d后甘薯根际土壤脲酶活性情况如图18所示，B13处理组与对照组相比增加了9.49％，达到了显著性差异水平(P<0.05)。

综上所述，施加B13菌剂后，能够显著提升土壤酶活，进而提高土壤中的养分，对甘薯的生长具有积极作用。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)B13，其特征在于，其生物保藏号为：CGMCC NO.26273。

2.一种生物防治菌剂，其特征在于，以权利要求1所述的耐盐芽孢杆菌(Bacillushalotolerans)B13为活性成分。

3.根据权利要求2所述的生物防治菌剂，其特征在于，所述生物防治菌剂为液体菌剂，其耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)B13的含量大于或等于1×10⁸cfu/mL。

4.根据权利要求2或3所述的生物防治菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将耐盐芽孢杆菌B13接种至液体LB培养基中，培养得到活化菌液；

(2)将活化菌液接种液体LB培养基中进行发酵，得到发酵液，用无菌水将发酵液稀释至耐盐芽孢杆菌B13的含量大于或等于1×10⁸cfu/mL，得到生物防治菌剂。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养为：37℃下，在恒温摇床中培养12h，转速为180rpm。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述活化菌液的接种量为1vt％；所述发酵为：37℃下，在摇床中培养24h，转速为180rpm。

7.权利要求1所述的耐盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)B13或权利要求2或3所述的生物防治菌剂在如下1)～5)至少一项中的应用：

(1)抑制甘薯黑斑病病原菌；

(2)制备用于防治甘薯黑斑病病原菌的产品；

(3)促进甘薯生长；

(4)提高甘薯叶片中防御类酶的酶活；

(5)提高甘薯根际土壤酶的酶活。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述甘薯黑斑病病原菌为甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata)。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述防御类酶包括过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述甘薯根际土壤酶包括蔗糖酶、过氧化氢酶、磷酸酶、脲酶。

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