CN116064284B - 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。该解淀粉芽孢杆菌的名称为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GDNXJ‑5，保藏编号为GDMCC No：62051，于2021年11月11日保藏于广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。本发明中的GDNXJ‑5菌株可抑制多种作物的致病性镰刀菌，尤其对烟草镰刀根腐病防效突出，为植物镰刀菌枯萎(根腐)病的生物防治提供了一种有效途径。
Description
技术领域
本发明属于作物病害生物防治领域，特别涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。
背景技术
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)广泛存在于各种不同生态环境，在其生长过程中产生多种抑菌物质，如脂肽类、多肽类、抑菌蛋白类等，具有抑制真菌、细菌、病毒、菌原体等作用，是植物病害生防功能的重要组成部分。解淀粉芽孢杆菌产生内生芽孢，耐热、抗逆性较强，生长速度快，营养需求简单，在土壤中容易定殖和繁殖，对人和动物无害，对环境友好，其制剂工艺简单，制剂稳定、施用方便，储存期长，是理想的生防微生物。
植物枯萎(根腐)病是由致病性镰刀菌侵染引起的一种土传病害，病原菌从根部危害植物，引起维管束坏死，造成植株枯萎，危害严重，且极难防治。烟草镰刀根腐病在世界烟区普遍发生，镰刀菌既可单独侵染，又可与黑胫病菌、青枯病菌、根结线虫等混合侵染，造成烟叶大幅减产，甚至绝收，成为严重危害烟草的根茎病害之一。该病为土传病害，化学药剂防治不理想。
目前，生物农药的研究与应用已成为热点，在生防细菌方面，樊炳君等筛选出特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)，该菌对烟草镰刀根腐病的4个病原菌(腐皮镰刀菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌和拟枝孢镰孢菌)均有不同程度的抑制效果，但其盆栽和田间试验尚不明确。陈长卿等研究现有生物菌剂对烟草镰刀根腐病的田间防治效果，4种芽孢杆菌的田间防效达42.97～70.19％，防治效果不突出。因此，有必要筛选防治效果更好的生防细菌。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株解淀粉芽孢杆菌。
本发明的另一目的在于提供所述解淀粉芽孢杆菌的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一株解淀粉芽孢杆菌，名称为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GDNXJ-5，保藏编号为GDMCC No：62051，于2021年11月11日保藏于广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。
一种培养所述解淀粉芽孢杆菌的方法，包括如下步骤：将解淀粉芽孢杆菌接种到种子培养基中，于30℃～37℃条件下进行培养。
所述的种子培养基含有如下按质量百分数计的组分：牛肉膏0.3％、酵母膏0.1％、蛋白胨0.5％、葡萄糖1％，pH＝7.0～7.2。
所述的培养的转速为150～200转/min；优选为180～190转/min。
所述的培养的温度优选为33℃～35℃。
所述的培养的时间为12～16h；优选为15h。
所述的解淀粉芽孢杆菌的接种量为体积百分比3～8％；优选为体积百分比5％。
一种解淀粉芽孢杆菌的发酵方法，包括以下步骤：将上述解淀粉芽孢杆菌接种于发酵培养基中，于30℃～37℃条件下发酵培养24～48h。
所述的解淀粉芽孢杆菌的接种量为体积百分比4～8％；优选为体积百分比5％。
所述的发酵培养基选自如下任一种：
(1)含有如下按质量百分数计的组分：玉米淀粉0.3％、大豆蛋白粉1.5％、玉米浆2.5％、K2HPO4 0.3％、KH2PO4 0.15％、30.8mg/L的MnSO4 0.1％、MgSO4 0.05％、FeSO40.01％、CaCO3 0.01％，pH＝7.0～7.2；
(2)含有如下按质量百分数计的组分：玉米淀粉0.2％、大豆蛋白粉1.5％、酵母膏0.5％、牛肉膏0.15％、K2HPO4 0.3％、KH2PO4 0.15％、30.8mg/L的MnSO4 0.1％、MgSO40.05％、FeSO4 0.01％、CaCO3 0.01％，pH＝7.0～7.2。
所述的发酵培养的温度优选为33℃～35℃。
所述的发酵培养的时间为36～40h。
所述的发酵培养的通气量10～14L/min；优选为13L/min。
一种解淀粉芽孢杆菌生物菌剂，含有上述解淀粉芽孢杆菌。
所述的解淀粉芽孢杆菌占所述生物菌剂质量的4％～8％；优选为占生物菌剂质量的6％。
所述的解淀粉芽孢杆菌优选为通过如下方法获得：将上述发酵方法获得的发酵液在25℃～30℃、15000～20000rpm下离心，获得解淀粉芽孢杆菌菌体。
所述的解淀粉芽孢杆菌生物菌剂还含有载体和保护剂。
所述的载体为硅藻土、高岭土、轻质碳酸钙、膨润土、蛭石和草碳中的至少一种；优选为硅藻土和高岭土。
所述的载体占所述生物菌剂质量的86％～93.2％；优选为占生物菌剂质量的90％。
所述的保护剂为可溶性淀粉、糊精、玉米粉、蔗糖和谷氨酸钠中的至少一种；优选为玉米粉、糊精和蔗糖。
所述的保护剂占所述生物菌剂质量的2.8％～6％；优选为占生物菌剂质量的4％。
所述的解淀粉芽孢杆菌生物菌剂的水份含量低于10％，菌体含量高于2×1011cfu/g(优选为高于3.2×1011cfu/g)。
所述的解淀粉芽孢杆菌生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：将解淀粉芽孢杆菌、载体和保护剂混合均匀，然后在50℃～60℃条件下烘干至水份含量低于10％，粉碎，得到解淀粉芽孢杆菌生物菌剂。
所述的解淀粉芽孢杆菌生物菌剂的使用方法，为将解淀粉芽孢杆菌生物菌剂稀释400～500倍，在种子期拌种、苗期蘸根或淋施、或成株期淋施。
所述的解淀粉芽孢杆菌和/或所述的解淀粉芽孢杆菌生物菌剂在防治作物镰刀根腐病和/或作物枯萎病中的应用。
所述的作物镰刀根腐病包括烟草镰刀根腐病。
所述的作物枯萎病包括西瓜枯萎病、黄瓜枯萎病、苦瓜枯萎病、冬瓜枯萎病和香蕉枯萎病中的至少一种。
本发明中的解淀粉芽孢杆菌分离自广东省韶关市始兴县马市镇的烟草根际土壤，其形态和生化特征为：在LB培养基上，菌落乳白色，圆形到椭圆形，菌落边缘不平整，有锯齿状，菌落平，中间稍凹陷，表面粗燥。菌体为短直杆状，大小为0.7～0.9μm×1.8～3.0μm，革兰氏阳性，可产生芽孢。硝酸还原阳性，可水解淀粉，液化明胶和酪素。适宜生长温度30℃～37℃，适宜生长pH为5.7～7.8。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明以广东省烟草镰刀根腐病菌(Fusarium oxysporum)为靶标，筛选出对该病菌具有显箸生防效果的解淀粉芽孢杆菌GDNXJ-5，该GDNXJ-5菌株可明显抑制多种作物的致病性镰刀菌，可用于防治多种作物枯萎(根腐)病，尤其对烟草镰刀根腐病防效突出。
2、本发明提供的具有生防作用的解淀粉芽孢杆菌GDNXJ-5生物菌剂对环境友好，无农药残留、发酵成本低、生产工艺简单，为探索植物镰刀菌枯萎(根腐)病的生物防治提供了有效途径。
3、本发明中将解淀粉芽孢杆菌GDNXJ-5进行液体发酵并离心获得菌体，然后将菌体与载体、保护剂混合，烘干粉碎后可制成生物菌剂；该生物菌剂可在种子期、苗期和成株期使用，即可采用种子拌种、幼苗淋施或蘸根、以及大田淋施的方式防治作物镰刀枯萎(根腐)病，且该生物菌剂在土壤中能够有效增殖，可持续控制病害；另外，该生物菌剂对烟草镰刀根腐病防效突出，稀释400～500倍、施药21d后，对病害的防治效果达到80％以上，可为该病害的防治提供一种新的储备生物制剂。
附图说明
图1是解淀粉芽孢杆菌GDNXJ-5在LB培养基上的培养形态图。
图2是解淀粉芽孢杆菌GDNXJ-5对烟草镰刀根腐病菌的抑制作用图。
图3是解淀粉芽胞杆菌GDNXJ-5在不同发酵温度的菌量和芽孢率统计结果图。
图4是解淀粉芽胞杆菌GDNXJ-5在不同发酵时间的菌量和芽孢率统计结果图。
图5是解淀粉芽孢杆菌GDNXJ-5生物菌剂对烟草镰刀根腐病的防治效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明涉及的烟草镰刀根腐病菌(Fusarium oxysporum)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)、黄瓜枯萎病菌(F.oxysporoum f.sp.cucumerium)、苦瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.momdicae)、冬瓜枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.benincase)、香蕉枯萎病菌1号生理小种(F.oxysporum f.sp.cubense race 1)和香蕉枯萎病菌4号生理小种(F.oxysporum f.sp.cubense race 4)，均为本领域常见病原菌种类，实施例中所使用的病原菌均保存于广东省农业科学院植物保护研究所(已经过致病性测定和分类鉴定)。
实施例1：生防细菌的筛选及鉴定
(1)烟草根际细菌的分离
在广东韶关、梅州和清远烟区的根际采集土壤样品，分别称取1g样品，加50ml无菌水振荡10min，静置，取上清液，用无菌水稀释为103、104和105梯度浓度，取0.1ml稀释液，接入LB(胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、琼脂20g、水1L，pH＝7)平板，均匀涂布，每处理5个培养皿，32℃培养48h，挑取单个菌落，接入LB斜面，32℃培养48h后，4℃保存备用。
(2)生防细菌筛选
筛选采用对峙培养法进行，以烟草镰刀根腐病菌为靶标。把直径6mm的病菌菌丝块接入PDA平板(马铃薯200g去皮洗净切碎后，煮30min后过滤，取液体加入葡萄糖20g，琼脂20g，加水定溶至1L，灭菌后倒入培养皿)中央，26℃培养24h，将沾有步骤(1)中获得的菌的圆形滤纸片(直径6mm)接在距病菌菌丝块4cm处，每皿接4个滤纸片，每处理3个培养皿，28℃培养96h后观察病菌生长情况，选择产生明显抑菌带的细菌保存备用。共6个菌株的抑菌带(抑菌圈)宽度大于10mm，见表1，其中菌株编号为GDNXJ-5的抑制作用最强，抑菌带宽度平均为18.23mm，对烟草镰刀根腐病菌抑制作用见图2。该菌株GDNXJ-5分离自广东省韶关市始兴县马市镇的烟草根际土壤。
表1生防细菌对烟草镰刀根腐病菌的抑制作用
| 菌株编号 | 抑菌带宽度(mm) |
| GDF-4 | 13.42±0.32 |
| GDNXJ-5 | 18.23±0.52 |
| GDH-23 | 15.65±0.35 |
| GDH-45 | 15.20±0.44 |
| GDT-78 | 16.84±0.41 |
| GDG-95 | 12.76±0.25 |
(3)菌株GDNXJ-5对不同作物镰刀菌枯萎(根腐)病菌的抑制作物
研究方法与上述步骤(2)的生防细菌筛选相同，致病性镰刀菌分别为西瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌、烟草镰刀根腐病菌以及香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种。测试菌株GDNXJ-5对不同作物镰刀菌的抑菌效果，结果见表2。
菌株GDNXJ-5对7种作物镰刀菌枯萎(根腐)病菌均有明显抑制作用，对烟草镰刀根腐病菌的抑制作用最强，抑菌带为18.33mm，对香蕉枯萎病菌4号小种和1号小种抑制作用次之，抑菌带分别为18.25mm和17.58mm。
表2菌株GDNXJ-5对7种作物枯萎(根腐)病菌的抑制作用
| 病原菌 | 抑菌带宽度(mm) |
| 西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum) | 14.21±0.43 |
| 烟草镰刀根腐病菌(F.oxysporum) | 18.33±0.51 |
| 黄瓜枯萎病菌(F.oxysporoumf.sp.cucumerium) | 15.04±0.32 |
| 苦瓜枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.momdicae) | 13.42±0.34 |
| 冬瓜枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.benincase) | 16.04±0.52 |
| 香蕉枯萎病菌1号生理小种(F.oxysporumf.sp.cubense race 1) | 17.58±0.45 |
| 香蕉枯萎病菌4号生理小种(F.oxysporumf.sp.cubense race 4) | 18.25±0.52 |
(4)菌株GDNXJ-5形态特征和生理生化特征
将菌株GDNXJ-5划线接种于LB培养基上，32℃培养48h，观察其形态特征，参照方中达(北京:科学出版社,1996.[9]方中达.植病研究方法(第二版))方法进行革兰氏染色、芽孢染色，温度、pH、需氧试验、硝酸还原试验、大分子化合物的水解等生理生化特征试验。
结果如图1所示：结果显示，在LB培养基上，菌落为乳白色，圆形到椭圆形，菌落边缘不平整，有锯齿状，菌落平、表面干燥、有褶皱、中间稍凹陷，表面粗糙，无可溶性色素。菌体为短直杆状，可产生芽孢，大小为0.7～0.9μm×1.8～3.0μm。革兰氏阳性菌，适宜生长温度30℃～37℃，适宜生长的pH范围为5.7～7.8，硝酸还原阳性，可水解淀粉，液化明胶和酪素。
(5)菌株GDNXJ-5的16s rDNA序列分析
以菌株GDNXJ-5的基因组DNA为模板，选用16srDNA序列通过引物F27(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和R1492(5′-TACGGTTACCTTGTTACGA CTT-3′)为引物，PCR扩增16s rDNA基因片段。PCR产物用DNA凝胶回收，纯化试剂盒纯化后，委托上海生物工程有限公司测序，其序列如SEQ ID NO.1所示。将所得序列通过NCBI数据库进行Blast同源性分析，并采用MEGA5.0软件构建系统发育树，得出菌株GDNXJ-5的系统发育地位。
对菌株GDNXJ-5的16srDNA序列进行相似性分析以及构建菌株亲缘关系发育树，发现该菌株与已公布的B.amyloliquefacies(GenBank登录号为NR_041455.1)亲缘关系最近，同源率达99.65％。系统发育树与该菌聚为一支。
16s rDNA序列如下所示(SEQ ID NO.1)：
ctaatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtctgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgcccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagccgccgaa。
(6)菌株GDNXJ-5分类地位的确定
根据菌株GDNXJ-5的菌落表型、生理生化特征，结合16s rDNA序列分析结果，确定菌株GDNXJ-5为解淀粉芽胞杆菌，命名为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GDNXJ-5。该菌株于2021年11月11日保藏于广东微生物保藏中心，保藏号为GDMCC No：62051。
实施例2：解淀粉芽胞杆菌GDNXJ-5的发酵技术研究
(1)发酵培养基筛选
参考文献共配制6种解淀粉芽胞杆菌的发酵培养基，每1L三角瓶装有200ml发酵培养基，灭菌后接入10ml GDNXJ-5菌液(浓度：109cfu/mL)，每处理5次重复，放入摇床培养，培养温度为34℃，转速180转/min，培养40h后，用平板计数法测定菌量，用孔雀绿染色法测定芽孢率。其中，
6种发酵培养基如下：
①葡萄糖2％、可溶性淀粉1％、蛋白胨0.5％、牛肉膏1％、K2HPO4 0.3％、KH2PO40.15％、30.8mg/L的MnSO4 0.1％、MgSO4 0.05％、FeSO4 0.01％、CaCO3 0.01％，pH＝7.0；
②葡萄糖1.5％、可溶性淀粉1％、豆粕3％、K2HPO4 0.3％、KH2PO4 0.15％、30.8mg/L的MnSO4 0.1％、MgSO4 0.05％、FeSO4 0.01％、CaCO3 0.01％，pH＝7.0；
③葡萄糖1.5％、可溶性淀粉1％、玉米浆(固含量：50％)2.5％、K2HPO4 0.3％、KH2PO4 0.15％、30.8mg/L的MnSO4 0.1％、MgSO4 0.05％、FeSO4 0.01％、CaCO3 0.01％，pH＝7.0；
④可溶性淀粉3％、豆饼粉2％、K2HPO4 0.3％、KH2PO4 0.15％、30.8mg/L的MnSO40.1％、MgSO4 0.05％、FeSO4 0.01％、CaCO3 0.01％，pH＝7.0；
⑤玉米淀粉0.3％、大豆蛋白粉1.5％、玉米浆(固含量：50％)2.5％、K2HPO4 0.3％、KH2PO4 0.15％、30.8mg/L的MnSO4 0.1％、MgSO4 0.05％、FeSO4 0.01％、CaCO3 0.01％，pH＝7.0；
⑥玉米淀粉0.2％、大豆蛋白粉1.5％、酵母膏0.5％、牛肉膏0.15％、K2HPO4 0.3％、KH2PO4 0.15％、30.8mg/L的MnSO4 0.1％、MgSO4 0.05％、FeSO4 0.01％、CaCO3 0.01％，pH＝7.0。
注：上述百分数均为质量百分数。
发酵培养40h后，不同发酵培养基的菌量和芽孢率见表3，其中⑤号发酵培养基在培养40h后，菌量最高，达6.48×109cfu/mL，其次为⑥号培养基，菌量为6.20×109cfu/mL，两种培养基的芽孢率差异不显箸，均在93％以上。考虑⑤号培养基的生产成本相对较低，选择⑤号培养基为解淀粉芽胞杆菌GDNXJ-5的发酵培养基。
表3解淀粉芽胞杆菌GDNXJ-5在不同发酵培养基中的菌量和芽孢率
| 培养基代号 | 菌体量(×109cfu/mL) | 芽孢产生率(％) |
| ① | 4.46±0.22c | 84.60±4.39b |
| ② | 3.74±0.25d | 85.20±3.83b |
| ③ | 5.28±0.30b | 89.40±2.52ab |
| ④ | 2.80±0.10e | 94.60±2.19a |
| ⑤ | 6.48±0.34a | 94.20±3.03a |
| ⑥ | 6.20±0.26a | 93.60±3.00a |
注：同列数字后的不同数字表示p＝0.05水平上差异显著。
(2)发酵温度的确定
配制上述⑤号发酵培养基，每l L三角瓶装有200ml发酵培养基，灭菌后接入10mlGDNXJ-5菌液(浓度：109cfu/mL)。放入摇床培养，培养温度设为31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃共7个温度，转速180转/min，每处理5个重复，培养40h后取出，用平板计数法测定菌量，用孔雀绿染色法测定芽孢率。
培养40h后，菌量和芽孢率见图3：33℃、34℃和35℃时菌量较大，分别达到6.24×109cfu/mL、6.46×109cfu/mL和6.22×109cfu/mL，且菌量差异不显箸，3个温度的芽孢率也均在93％以上，因此33℃～35℃是适合的发酵温度。
(3)发酵周期的确定
配制⑤号发酵培养基，每1L三角瓶装有200ml培养基，灭菌后接入10ml GDNXJ-5菌液(浓度：109cfu/mL)，放入摇床培养，培养温度设为34℃，转速180转/min，培养24、28、32、36、40、44、48h后取出，每处理5个重复，用平板计数法测定菌量，用孔雀绿染色法测定芽孢率。
不同发酵时间的菌量和芽孢率见图4：24～36h解淀粉芽胞杆菌生长迅速，经过对数生长期以后，40h后就接近达到平衡期，菌体的增加量明显放缓。发酵时间为36h时，菌量达到5.84×109cfu/mL，40h菌量达到6.24×109cfu/mL，以后菌量增加不显著，从实用经济的角度考虑，发酵时间为36～40h较适合。且36～40h的芽孢率均在92％以上。
实施例3：解淀粉芽胞杆菌GDNXJ-5的发酵
(1)种子培养：将菌株GDNXJ-5菌液(浓度：109cfu/mL)10ml接入装有200ml种子培养基(牛肉膏0.3％、酵母膏0.1％、蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、pH＝7.0；其中百分数均为质量百分数)的1L三角瓶中，放入摇床培养，温度为34℃，转速190转/min，培养15h。
(2)发酵培养：100L发酵罐装有70L发酵培养基(玉米淀粉0.3％、大豆蛋白粉1.5％、玉米浆2.5％、K2HPO4 0.3％、KH2PO4 0.15％、30.8mg/L的MnSO40.1％、MgSO4 0.05％、FeSO4 0.01％、CaCO3 0.01％，泡敌(消泡剂)0.06％，pH＝7.0；其中百分数均为质量百分数)，灭菌后按8％将种子接种于发酵罐，温度34℃，通气量为13L/min，发酵培养。
(3)发酵结束：培养24h后，每隔4h取样，显微镜下观察菌体量和芽孢率，发酵时间38h芽孢形成率为93％，菌体量达到5.40×109cfu/mL，结束发酵。
实施例4：解淀粉芽胞杆菌GDNXJ-5的生物菌剂制备
对实施例3得到的解淀粉芽胞杆菌GDNXJ-5的发酵液在28℃、18000rpm进行离心获得菌体。将菌体与载体、保护剂进行混合，制成生物菌剂；其中，载体、保护剂占比如下：发酵干燥物(即菌体)占6％、硅藻土占20％、高岭土占70％、玉米粉占1.5％、糊精占1.5％、蔗糖占1％(均为质量分数)。混匀后55℃烘干后至水分相对湿度小于10％时，粉碎，得到解淀粉芽胞杆菌GDNXJ-5的生物菌剂，经检测生物菌剂中的菌量为3.2×1011cfu/g。
实施例5：解淀粉芽胞杆菌GDNXJ-5生物菌剂对几种作物镰刀枯萎(根腐)病的盆栽防治效果
(1)生物菌剂：按实施例4的方法制备的生物菌剂，菌量为3.2×1011cfu/g。
(2)配制镰刀菌孢子悬浮液：将烟草镰刀根腐病菌、西瓜枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌和香蕉枯萎病菌4号生理小种分别接种到PDA培养液(马铃薯200g去皮洗净切碎，煮30min后过滤，取液体加入葡萄糖20g，加水定溶至1L，灭菌)，放入摇床26℃，150转/min培养96h，过滤去除菌丝，获得孢子悬浮液，用含0.05％(w/v)蔗糖的无菌水分别稀释孢子浓度为108cfu/mL。
(3)防治试验：采用先伤根接种病菌再淋施生物菌剂的方法进行，以研究生物菌剂对枯萎(根腐)病的防治效果。选择生长期基本一致的烟草、西瓜、黄瓜、苦瓜、冬瓜和香蕉幼苗，每株幼苗4～5片叶。用剪刀剪去部分根部，造成根部创伤，将根部分别浸入上述镰刀菌孢子悬浮液，浸泡接种6h后，取出幼苗，移栽盆中，置于26℃～28℃的温室大棚内培养，每日喷壶淋水，使土壤湿润，利于病害发生。培养5d后，将生物菌剂用水稀释400倍和500倍，每株10ml淋施作物幼苗根部土壤，对照淋无菌水，继续置于大棚内培养，每处理30株幼苗。淋施生物菌剂7、14、21d后观察记录病害发生情况，计算病情指数及防治效果，三次重复取均值；其中，
病害分级标准及计算公式如下：
枯萎病分级调查标准：0级：植株无症状；1级：子叶轻微黄化或萎焉；2级：子叶黄化或萎焉；3级：幼苗植株轻微黄化或萎焉；4级：幼苗植株中度黄化或萎焉；5级：全株枯萎或黄化。
病情指数＝∑(病级数值×该病级植株数)/(最高级数×调查植株数)×100％；
防治效果＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100％。
(4)结果
盆栽防治效果见表4，解淀粉芽胞杆菌GDNXJ-5菌剂稀释500倍时，施药后21d，对烟草、西瓜、黄瓜、苦瓜、冬瓜和香蕉枯萎(根腐)病的盆栽防治效果分别为80.20％、63.71％、61.94％、57.29％、64.61％和52.77％；稀释400倍时，施药后21d，对烟草、西瓜、黄瓜、苦瓜、冬瓜和香蕉枯萎(根腐)病的盆栽防治效果分别为81.25％、71.78％、70.79％、66.67％、70.00％和56.93％。结果表明：该生物菌剂对烟草镰刀根腐病的防治效果尤为突出，施药后21天，防效均达80％，显箸高于对其它5种作物枯萎病的防效，因生防菌来自烟草根部土壤，为扩大生存空间，对烟草根茎病菌有明显的竞争和抑制作用。该生防菌虽然对香蕉枯萎病菌4号小种抑制作用较强，抑菌带为18.25mm，但盆栽试验表明，该生防菌对香蕉枯萎病的防效较差，稀释400倍时，施药后21d，对香蕉枯萎病的防治效果仅为56.93％。
解淀粉芽胞杆菌GDNXJ-5生物菌剂稀释500倍时，施药后7、14、21d的对烟草镰刀根腐病的盆栽防治效果分别为71.16％、78.21％和80.20％；稀释400倍时，施药后7、14、21d的盆栽防治效果分别为74.99％、80.77％和81.25％。可见，随着菌剂施用时间的延长，对烟草镰刀根腐病的防治效果不断提高，表明解淀粉芽胞杆菌GDNXJ-5在土壤中能较好定殖和增殖，从而持续控制病害的扩展。
表4解淀粉芽胞杆菌GDNXJ-5生物菌剂对6种作物枯萎(根腐)病的盆栽防治效果
实施例6：解淀粉芽胞杆菌GDNXJ-5生物菌剂对烟草的保护作用
(1)生物菌剂：按实施例4的方法制备的生物菌剂，菌量为3.2×1011cfu/g。
(2)配制病菌孢子悬浮液：按实施例5步骤(2)的方法制备的烟草镰刀菌孢子悬浮液，浓度为108cfu/mL。
(3)盆栽试验：采用先喷淋生物菌剂后再接种病原菌的方法进行，以研究生物菌剂对植株的保护作用。选择生长期基本一致的烟草幼苗，每株幼苗4～5片叶。生物菌剂用水稀释400倍和500倍，淋施烟草根部土壤，每株10ml，对照淋施无菌水，置于26℃～28℃的温室大棚内培养5d。用灭菌的细长竹签在烟草幼苗根部土壤内随机深插20次，造成烟草幼苗根部严重损伤，再向每株烟草根部土壤中倒入10ml浓度为108cfu/mL的病菌孢子悬浮液，继续置于大棚内保湿培养，每处理30株烟草幼苗。接种病菌后7、14、21d后，观察记录病害发生情况，计算病情指数及防治效果；病害分级和计算公式同实施例5。
(4)盆栽保护效果见图5(接菌后21d)和表5：生物菌剂稀释500倍时，施药后7、14、21d的盆栽防治效果分别为77.77％、82.42％和85.05％；稀释400倍时，施药后7、14、21d的盆栽防治效果分别为82.23％、86.48％和86.21％。可见生物菌剂可持续保护烟草植株，降低根腐菌的侵染为害，其对病害的防治效果要高于先接种病菌再施用生物菌剂的治疗作用。因此，建议在病害高发期，可提前施用生物菌剂预防病害的发生。
表5解淀粉芽胞杆菌GDNXJ-5生物菌剂对烟草的保护效果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一株解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：名称为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)GDNXJ-5，保藏编号为GDMCC No：62051，于2021年11月11日保藏于广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。
2.一种培养权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：将解淀粉芽孢杆菌接种到种子培养基中，于30℃～37℃条件下进行培养；
所述的种子培养基含有如下按质量百分数计的组分：牛肉膏0.3％、酵母膏0.1％、蛋白胨0.5％、葡萄糖1％，pH＝7.0～7.2；
所述的培养的时间为12～16h。
3.一种解淀粉芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌接种于发酵培养基中，于30℃～37℃条件下发酵培养24～48h；
所述的发酵培养基选自如下任一种：
(1)含有如下按质量百分数计的组分：玉米淀粉0.3％、大豆蛋白粉1.5％、玉米浆2.5％、K2HPO4 0.3％、KH2PO4 0.15％、30.8mg/L的MnSO4 0.1％、MgSO40.05％、FeSO40.01％、CaCO3 0.01％，pH＝7.0～7.2；
(2)含有如下按质量百分数计的组分：玉米淀粉0.2％、大豆蛋白粉1.5％、酵母膏0.5％、牛肉膏0.15％、K2HPO4 0.3％、KH2PO4 0.15％、30.8mg/L的MnSO40.1％、MgSO40.05％、FeSO4 0.01％、CaCO3 0.01％，pH＝7.0～7.2。
4.根据权利要求3所述的解淀粉芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于：
所述的解淀粉芽孢杆菌的接种量为体积百分比4～8％；
所述的发酵培养的时间为36～40h；
所述的发酵培养的通气量10～14L/min。
5.一种解淀粉芽孢杆菌生物菌剂，其特征在于：含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌。
6.根据权利要求5所述的解淀粉芽孢杆菌生物菌剂，其特征在于：
所述的解淀粉芽孢杆菌占所述生物菌剂质量的4％～8％；
所述的解淀粉芽孢杆菌生物菌剂的水份含量低于10％，菌体含量高于2×1011cfu/g；
所述的解淀粉芽孢杆菌生物菌剂还含有载体和保护剂；
所述的载体为硅藻土、高岭土、轻质碳酸钙、膨润土、蛭石和草碳中的至少一种；
所述的载体占所述生物菌剂质量的86％～93.2％；
所述的保护剂为可溶性淀粉、糊精、玉米粉、蔗糖和谷氨酸钠中的至少一种；
所述的保护剂占所述生物菌剂质量的2.8％～6％。
7.权利要求5或6所述的解淀粉芽孢杆菌生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将解淀粉芽孢杆菌、载体和保护剂混合均匀，然后在50℃～60℃条件下烘干至水份含量低于10％，粉碎，得到解淀粉芽孢杆菌生物菌剂。
8.权利要求5或6所述的解淀粉芽孢杆菌生物菌剂的使用方法，其特征在于：将解淀粉芽孢杆菌生物菌剂稀释400～500倍，在种子期拌种、苗期蘸根或淋施、或成株期淋施。
9.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌和/或权利要求5～6任一项所述的解淀粉芽孢杆菌生物菌剂在防治作物镰刀根腐病和/或作物枯萎病中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
所述的作物镰刀根腐病为烟草镰刀根腐病；
所述的作物枯萎病为西瓜枯萎病、黄瓜枯萎病、苦瓜枯萎病、冬瓜枯萎病和香蕉枯萎病中的至少一种。
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