CN114634889B - 一种副地衣芽孢杆菌nmxc2-1及其发酵产物、菌剂与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种副地衣芽孢杆菌nmxc2‑1及其发酵产物、菌剂与应用。本发明提供的副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)nmxc2‑1，其保藏编号为CGMCC No.24270。本发明的副地衣芽孢杆菌nmxc2‑1，对根结线虫兼具直接触杀及熏蒸触杀的双重效果，同时还可促进植物生长，对无公害蔬菜的生产有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种副地衣芽孢杆菌nmxc2-1及其发酵产物、菌剂与应用。
背景技术
根结线虫(Meloidogyne spp.)是当前农业生产中为害十分严重的专性内寄生线虫。据文献记载，根结线虫能够侵染5500多种植物，包括谷物，豆类，蔬菜和各种树木、水果、香料作物等，造成很大的经济损失。根结线虫二龄幼虫从卵内孵化后经由根尖侵染植物，并在侵染中后期通过在根内形成的固定性取食位点(巨大细胞)获取营养来维持自身的生长及繁殖。巨大细胞的形成破坏了根组织的正常生理功能，扰乱了水分及营养物质向植物地上部分的传导，从而造成植物地上部分营养不良、生长缓慢、抗逆能力和产量下降。目前生产上多采取施用化学农药的方法来防治根结线虫，虽然化学防治使用方便、见效快，但由于线虫体壁结构的特殊性，许多杀线剂往往是高毒的，不仅容易造成环境及水体污染且对人体健康存在安全隐患，因此许多剧毒高毒杀线虫剂因为环境安全问题陆续被禁用或限用。而生物防治作为一种对环境友好且有效的方法越来越受到重视。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有生产中应用化学防治存在的高污染，高成本的问题，提供一种副地衣芽孢杆菌及其应用。
为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)nmxc2-1，其保藏编号为CGMCC No.24270。
进一步地，本发明还提供副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)nmxc2-1的发酵产物。含有副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)nmxc2-1和/或其发酵产物的菌剂。
本发明所述的菌剂可以为液体菌剂或固体菌剂，可采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。
本发明还提供一种根结线虫杀虫剂、植物生长促进剂和根结线虫熏蒸剂，其含有副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)nmxc2-1和/或其发酵产物。
本发明另提供一种副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)nmxc2-1，或其发酵产物，或上述菌剂在促进植物生长或防治根结线虫中的应用。
优选，所述植物为黄瓜。
所述应用的方式为：将副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)nmxc2-1发酵液施用到土壤中或熏蒸到空气中。
本发明的有益效果在于：
本发明副地衣芽孢杆菌是从植物中分离得到的，来源于自然，并容易在土壤中迅速繁殖并定殖，对根结线虫兼具直接触杀及熏蒸触杀的双重效果，且防治效果稳定。同时，该菌株还有促进植物生长的效果，对无公害蔬菜的生产有重要的应用价值。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1菌株nmxc2-1的分离、纯化及鉴定
一、菌株nmxc2-1的分离、纯化
菌株nmxc2-1是从香料植物柠檬香草叶片中分离得到的，具体分离步骤为：称取1g柠檬香草植物叶片，经1％次氯酸钠消毒5min，无菌水漂洗五遍后置于无菌研钵中充分研磨后加入含有100ml无菌水中混匀，依次进行梯度稀释，取100μL稀释104的稀释液于LB培养基上用涂布棒均匀涂布，进行生防细菌的分离。每个稀释梯度设置3个重复。用封口膜封口后将平板倒置于30℃培养箱中培养。培养2-3d后观察细菌的生长情况，挑取单菌落于LB培养基上进行纯化。将挑取的单菌落命名为nmxc2-1。
二、菌株nmxc2-1的鉴定
采用平板划线法观察菌株nmxc2-1的形态特征，并对其进行革兰氏染色。参考《伯杰氏细菌鉴定手册》等对其进行初步鉴定。最后提取生防细菌的总DNA，利用16S rRNA鉴定引物27F/1492R及gyrA基因鉴定引物p-gyrA-f/p-gyrA-r进行基因片段扩增。纯化回收后送公司进行测序，序列返回后利用BLAST的方法进行序列一致性比较，确定细菌种类。
(1)形态观察：通过观察nmxc2-1菌落形状，边缘，培养基颜色变化等，记录其生长特征。
结果：nmxc2-1菌落颜色为白色，菌落形状不规则，边缘为锯齿状，培养基颜色未见明显变化。经革兰氏染色显示为紫色，为革兰氏阳性菌。
(2)生理生化鉴定：通过淀粉水解，明胶液化，柠檬酸盐，菌膜形成，伏普试验，甲基红试验，耐盐性试验等重要特征进行鉴定。结果见表1。
表1
注：“+”表示阳性。
(3)分子鉴定：利用康为世纪公司的细菌DNA提取试剂盒提取nmxc2-1菌株的总DNA。采用16SrDNA细菌通用引物27F/1492R(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,SEQ IDNo.1；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，SEQ ID No.2)及gyrA基因鉴定引物p-gyrA-f/p-gyrA-r(p-gyrA-f：CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT，SEQ ID No.3；p-gyrA-r：CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT，SEQ ID No.4)分别进行PCR扩增。PCR反应体系(25μL)：10XBuffer 2.5μL，dNTP 2μL，引物F/R各1μL，rTaq0.5μL，ddH2O 16μL，模板DNA 2μL；反应参数：94℃预变性3min；94℃变性30s；63℃退火30s；72℃延伸90s；共35个循环；72℃总延伸7min；4℃保存。PCR扩增完成后采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格后进行双向测序，并获得nmxc2-1菌株的16S rDNA序列及gyrA基因序列(SEQ ID No.5)。对菌株nmxc2-1的16S rDNA基因序列与Genbank Accession No.MT856257.1进行序列比对分析，结果表明：两者同源性>99％；对菌株nmxc2-1的gyrA基因序列与Genbank Accession No.CP033389.1进行序列比对分析，结果表明：两者同源性>99％。
(4)nmxc2-1菌株的保藏：结合菌株形态特征、生理生化及分子鉴定结果，可以鉴定菌株为副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)。该菌株于2022年1月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)，保藏编号为CGMCC No.24270。
实施例2nmxc2-1发酵液对南方根结线虫二龄幼虫的触杀试验
1、细菌发酵液的制备
将1ml 1×108CFU/mL的nmxc2-1接到装有250ml LB液体培养基的无菌三角瓶中，于30℃，以220rpm的转速培养2d获得nmxc2-1发酵液。将发酵液置于9000rmp离心5min后，收集上清液用于后续的二龄幼虫触杀试验。
2、南方根结线虫二龄幼虫的获得
南方根结线虫是从青岛市移风店蔬菜大棚黄瓜根际土壤中分离得到的，参考文献Adam M,Phillips M S,Blok V C.Molecular diagnostic key for identification ofsingle juveniles of seven common and economically important species of root-knot nematode(Meloidogyne spp.)[J].Plant Pathology,2010,56(1):190-197记载的方法鉴定其为南方根结线虫。经鉴定的线虫接种于实验室种植的空心菜根部进行线虫繁殖，32天后从空心菜根上挑取成熟的线虫卵块，用0.5％的次氯酸钠消毒1min，无菌水冲洗干净。将卵块收集到含有少量无菌水的培养皿中，并放于28℃培养箱中进行孵化，48h后收集孵化的二龄线虫悬浮液备用。
3、发酵液上清杀线虫效果测定
取24孔板，向其中加入1mL上清液，对照组加等量无菌水，挑入50条线虫，于28℃恒温培养，记录24h、36h及48h后线虫死亡数，计算线虫的死亡率和校正死亡率。试验设置三次重复。
死亡率(％)＝死亡线虫数×100/供试线虫数
校正死亡率(％)＝[(处理线虫死亡率-对照线虫死亡率)/(1-对照线虫死亡率)]×100％。
试验结果见表2，其表明，副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)nmxc2-1菌株对南方根结线虫24h的校正死亡率为96.67％，36h及48h时校正死亡率均高达100％。
表2副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)菌株发酵液对南方根结线虫二龄幼虫致死率测定
实施例3温室盆栽试验测定nmxc2-1对黄瓜南方根结线虫防治效果
供试材料和方法：
黄瓜：品种为中农6号
线虫：南方根结线虫
于育苗盘里进行黄瓜育苗直至黄瓜长出2片叶后，将其移栽到小花盆中并定植5天。将收集的南方根结线虫配成600条/ml的悬浮液，并在每个花盆中均匀接种1ml线虫悬浮液。同时浇灌菌体浓度最终调成1010CFU/mL的nmxc2-1细菌发酵液，处理组每个花盆浇灌10ml。阴性对照组(对照处理组)黄瓜根部仅浇灌10ml的清水，阳性对照组(阿维菌素处理组)浇灌5ml 1.8％阿维菌素(1:5000)。每个处理21株黄瓜。试验设置3次生物学重复。接种第15d，21d后分别检测处理组和对照组黄瓜根部的根结数，计算nmxc2-1对根结线虫的防治效果。
防效(％)＝(阴性对照每克根根结数-处理组每克根根结数)×100/阴性对照每克根根结数。
结果见表3，其表明，经副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)nmxc2-1菌株发酵液处理后，黄瓜根部的根结数量明显减少，在接种第15d,21d时副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)nmxc2-1菌株发酵液对黄瓜根结线虫的防效分别为82.4％和80.44％，与阿维菌素处理的结果无显著差异，说明副地衣芽孢杆菌(Bacillusparalicheniformis)nmxc2-1在黄瓜定植的早中期能够有效的防治黄瓜根结线虫，对根结线虫有良好的触杀效果，能够作为阿维菌素的替代物使用。由于nmxc2-1来源于自然，并且在施于土里后能够迅速繁殖并定殖，在农业生产防治根结线虫病中具有高效，环保，节约成本的优点。
表3南方根结线虫盆栽试验
注：表中同列数据字母不同表示差异显著(SPSS 16.0t检验，P≤0.05)。
实施例4温室盆栽试验测定菌株nmxc2-1对黄瓜生长的影响
在上述实施例3黄瓜接种副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)nmxc2-1菌株发酵液后，在接种的第21天分别对黄瓜地上部分株高、地上部鲜重及地下根部长度、地下部鲜重进行测量。结果见表4。调查时发现经过nmxc2-1发酵液处理过的黄瓜无论是株高、地上部鲜重、还是地下根部长度、地下部鲜重与对照相比都有较显著的增加，经nmxc2-1发酵液处理过的黄瓜平均株高比对照增加了29.54％，地上部鲜重增加了45.29％，根长增加37.08％，地下部鲜重增加67.92％。这说明副地衣芽孢杆菌(Bacillusparalicheniformis)nmxc2-1菌株具有壮根及增加地上部生物量积累的作用，在促进植物生长方面有重要的开发价值。
表4菌株nmxc2-1对黄瓜生长的影响
注：表中同列数据字母不同表示差异显著(SPSS 16.0t检验，P≤0.05)。
实施例5菌株nmxc2-1挥发性物质(VOCs)离体杀线虫活性测定
采用无菌两格培养皿进行菌株nmxc2-1 VOCs的杀线活性测定。首先两格培养皿中第一格中加入5ml密度为1.0×1010CFU/mL的nmxc2-1发酵液，第二格中加入1ml含有100条二龄幼虫的线虫悬浮液。对照组第一格中加入5ml无菌水。培养皿用封口膜密封防止VOCs逸出，并在26℃培养箱中放置48h。每个处理5个培养皿并重复3次。24h，36h及48h记录线虫死亡数，计算线虫的死亡率和校正死亡率。
试验结果见表5，其表明，副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)nmxc2-1 VOCs对南方根结线虫24h的校正死亡率为95.1％，36h及48h时校正死亡率分别为98.47％和100％。
表5副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)菌株VOCs离体杀线虫活性测定
实施例6温室盆栽试验测定nmxc2-1 VOCs对黄瓜南方根结线虫防治效果
盆栽试验采用双层盆栽装置，下层花盆盆底密封，无排水孔，上层花盆底部及周围各扎20个左右小眼，便于VOCs透过小眼进入上层花盆中。将长出两片真叶的黄瓜移栽到上层花盆，下层花盆中加入20ml nmxc2-1的新鲜发酵液，发酵液与上层盆底及土壤无接触。对照在下层花盆中加入20ml清水。上下盆间隙用封口膜封紧。定植5天后，将收集的南方根结线虫配成600条/ml的悬浮液，并在每个花盆中均匀接种1ml线虫悬浮液。每个处理21株黄瓜。试验设置3次生物学重复。接种第35d后清洗黄瓜根部进行调查，统计根结数，计算防治效果。
结果表明，经nmxc2-1 VOCs处理后，黄瓜根部的根结数量显著降低，在接种第35d时，对照组每克根根结数为34.28±4.58个，nmxc2-1 VOCs处理组每克根根结数为3.77±1.14个。nmxc2-1 VOCs对黄瓜根结线虫的防效为89％，这说明菌株nmxc2-1除了能够直接接触触杀根结线虫外，还可作为一种优良的熏蒸剂在生产上防治根结线虫。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种副地衣芽孢杆菌nmxc2-1及其发酵产物、菌剂与应用
<130> KHP221111770.2
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagtcaggaa atgcgtacgt cctt 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caaggtaatg ctccaggcat tgct 24
<210> 5
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgagtcagct caaactttcg gctgtccgtc aacaagcgcc aaaagattaa tgccgaatga 60
tgtttgaaga gcggtctgct tgtacaagtt atttaacagt acattagcgt ttgcgtccct 120
tctcagttca atgacgatgc gcattccgtt tcggtctgat tcatcgcgga gatccgtaat 180
gccgtcgatt ttcttgtcgc gcactagatc cgcgattttt tcgatcagcc tagctttatt 240
cacctggtac ggtatttccg taataatgat taccggtttg ccggaagatg tttcttcgat 300
ttgagctttg gctcgaagcg taatggatcc ccggcctgtt tcataggctt tccggatgcc 360
gcttcttccc aaaatcagcc ctgctgtagg gaaatcaggt ccaggaatga tttccatcaa 420
ttccggcagc gtaatatcag ggttcttgct gaccgccaag actccgtcaa tgacttcacc 480
aagctgatgc ggcggaatgt tcgtggccat acctacagca ataccggccg ctccgttgac 540
aagcaggttc ggaaatctcg cgggcatgac aacaggctct ttttccgatc cgtcatagtt 600
gtcctggtaa tcgattgtgt ctttattgat gtcgcgcaga atttccattg atattttaga 660
cattctcgct tctgtgtaac gcatggccgc agccgagtcg ccgtcgacag aaccgaagtt 720
tccgtggcct tgaacgagca tgtaccgata gttaaaatcc tgcgccattc tgaccatagc 780
ttcgtaaaca gcagaatcac catgcgggtg gtacttaccg ataacttcgc cgacaatacg 840
cgcggatttt ttatacggct tatcacttgt catcccaagg tcgttcatcg catacaatat 900
tcttctgtgc accggcttca gaccgtctct tacgtccgga agagcgcggg aaacaataac 960
actcattgcg taatctaaaa gagacgtttt 990
Claims (10)
1.副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)nmxc2-1，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.24270。
2.权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)nmxc2-1的发酵液。
3.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌(Bacillusparalicheniformis)nmxc2-1和/或权利要求2所述的发酵液。
4.一种根结线虫杀虫剂，其特征在于，含有权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)nmxc2-1和/或权利要求2所述的发酵液。
5.一种植物生长促进剂，其特征在于，含有权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)nmxc2-1和/或权利要求2所述的发酵液。
6.根据权利要求5所述的植物生长促进剂，其特征在于，所述植物为黄瓜。
7.一种根结线虫熏蒸剂，其特征在于，含有权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)nmxc2-1和/或权利要求2所述的发酵液。
8.权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)nmxc2-1，或权利要求2所述的发酵液，或权利要求3所述的菌剂在促进植物生长中的应用。
9.权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)nmxc2-1，或权利要求2所述的发酵液，或权利要求3所述的菌剂在防治根结线虫中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用的方式为：将副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)nmxc2-1发酵液施用到土壤中或熏蒸到空气中。
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