CN113528395A - 一株捕食番茄青枯菌的黄色黏球菌及其在番茄青枯病生物防控中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株捕食番茄青枯菌的黄色黏球菌及其在番茄青枯病生物防控中的应用。黄色黏球菌(Myxococcus xanthus)R31，保藏号为：GDMCC No：61842。本发明创新性的采用植物病原菌青枯菌作为被捕食菌，成功利用被捕食菌诱导法从所采集的土样中分离筛选到了一株黏细菌菌株R31，经鉴定为黄色黏球菌(Myxococcus xanthus)，该菌株在生长过程中能够对多株不同致病力的青枯菌进行捕食，裂解病原细菌为自身的生长提供养分。该黏细菌对青枯病菌的捕食不区分菌株的生理生化特征和生理分化，显示其对青枯菌的广谱抗性。基于捕食实验及“中蔬四号”番茄的盆栽试验，表明本发明涉及的黏细菌Myxococcus xanthus R31在番茄青枯病生物防治方面具有巨大的应用潜力。

Description

一株捕食番茄青枯菌的黄色黏球菌及其在番茄青枯病生物防 控中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株捕食番茄青枯菌的黄色黏球菌及其在番茄青枯病生物防控中的应用。

背景技术

青枯病(Bacteria wilt)是番茄生产上的一种重要病害，在世界范围内广泛分布，在高温高湿环境下(例如我国南方各省市)经常爆发。青枯病发病急，蔓延快，严重时会造成植株成片死亡，严重减产，甚至绝收。番茄青枯病号称番茄的“癌症”，已经成为限制世界范围内番茄优质高产的重要制约因素之一，据报道，青枯病每年造成的产量损失约在15％-95％之间。番茄青枯病的病原为茄科劳尔氏菌，亦称青枯菌(Ralstonia solanacearum)，青枯菌分类复杂，呈现出明显的菌系差异和多态性，不同菌株在致病性、生理生化特征、菌体形态等各方面都存在较大差异。病原青枯菌主要从土壤中侵染作物根系，其在土壤中存活力强，防控极为困难，是农业生产中亟待解决的难题。

为了减轻植物病害所造成的损失，目前化学农药和种植抗病品种已经成生产上重要的防治病害的手段，然而受限于化学农药带来的环境污染和抗病品种的抗病性状与经济性状的矛盾等，使得符合我国“两减一增”战略要求的生物防治逐渐成为研究的热点和焦点。利用生物制剂防控青枯病由来已久，目前最常用的微生物制剂主要是链霉菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属及无致病力青枯菌等。但由于田间环境复杂，环境条件对其定殖和次级代谢产物的活性影响较大，在农业生产中实际使用时，往往出现防效不稳定、后期防效差等问题。种植抗病品种是目前生产上主要的防治措施，但现有抗病品种的经济性状往往较差，因此，发展更高效的番茄青枯病防控方法是一个重要的研究方向。

黏细菌(Myxobacteria)是属于δ变形菌纲的一类在土壤中广泛分布的、既能产生丰富次级代谢产物又具有捕食特性的细菌类群，位于土壤微生物食物链顶端，在维持土壤微生态平衡及植物健康中发挥着重要作用。近年来，已有多项研究表明，黏细菌对稻瘟病、马蹄莲软腐病等具有较高的生防效率。黏细菌在土壤中的分布丰度高、抗逆性强、产活性物质潜能大、捕食范围广，这些特性赋予了黏细菌独特的生防优势。因此，黏细菌在植物病害生物防控领域具有巨大的潜在应用前景。细菌的捕食作用是指捕食细菌(捕食者)积极捕猎并杀死他们的猎物细菌(被捕食者)，并利用猎物的生物大分子作为营养物质进行生长繁殖的生物学过程。黏细菌防治植物病害被认为与其捕食特性密切相关，利用黏细菌作为新型生防菌对植物病害进行高效防控，有望解决农业生产中的实际难题。以往对于黏细菌的研究多数集中在基础的发育特征，包括滑行运动、子实体形态发生、细胞的亲缘识别机制及捕食行为等方面。对利用黏细菌的捕食特性实现对包括植物病原真菌和细菌等在内的有害微生物的防治方面的研究近两年才得到发展。此外，目前作为专利保护的可用于植物病害防控的黏细菌资源依然较少，基于当前生防菌的专利保护现状，对具有优良生防效果的生防菌资源进行分离鉴定及专利保护对于植物病害的绿色防控具有重要的意义。

发明内容

本发明提供一株能够捕食植物病原菌青枯菌的黄色黏球菌(Myxococcusxanthus)R31，其于2021年7月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为中国广州市越秀区先烈中路100号59号楼5楼，邮编：510070，保藏号为：GDMCC No：61842。

本发明的第二个目的是提供黄色黏球菌R31在制备生物菌剂和/或生物肥料中的应用。

本发明的第三个目的是提供黄色黏球菌R31在防治植物病原菌青枯菌中的应用。

优选，所述的青枯菌为番茄青枯菌。

优选，所述的青枯菌为番茄青枯菌模式菌株Ralstonia solanacearum GMI1000、番茄青枯病高致病力菌株Ralstonia solanacearum RsH、Ralstonia solanacearum RS04、番茄青枯菌弱致病力菌株Ralstonia solanacearum GIM1.335或番茄青枯菌致病力丧失菌株Ralstonia solanacearum 1.70。

本发明的第四个目的是提供一种防治植物病原菌青枯菌的方法，其是将黄色黏球菌R31菌体接种到番茄植株根部，防治植物病原菌青枯菌。

优选，是将黄色黏球菌R31进行扩大培养，获得黄色黏球菌R31的菌体。

本发明创新性的采用植物病原菌青枯菌作为被捕食菌，成功利用被捕食菌诱导法从所采集的土样中分离筛选到了一株黏细菌菌株R31，经鉴定为黄色黏球菌(Myxococcusxanthus)，该菌株在生长过程中能够对多株不同致病力的青枯菌进行捕食，裂解病原细菌为自身的生长提供养分。该黏细菌对青枯病菌的捕食不区分菌株的生理生化特征和生理分化，显示其对青枯菌的广谱抗性。基于捕食实验及“中蔬四号”番茄的盆栽试验，表明本发明涉及的黏细菌Myxococcus xanthus R31在番茄青枯病生物防治方面具有巨大的应用潜力。

Myxococcus xanthus R31，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为中国广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年7月26日，保藏编号为GDMCC No：61842。

附图说明：

图1为菌株纯化和保藏流程图；

图2为菌株R31的形态特征；

A图为菌株R31形成的子实体形态图，标尺为0.5mm；B图为菌株R31在VY/2平板上的菌落形态图,标尺为1cm；C图为光学显微镜下结晶紫染色后的菌株R31菌体形态图，标尺为15μm；D图为透射电镜下菌株R31的形态图，标尺为5μm。

图3为菌株R31的进化树分析结果

图4为Myxococcus xanthus R31对多株青枯菌表现出良好的捕食能力

A图为黏细菌R31对青枯菌Ralstonia solanacearum 1.70的平板捕食；B图为菌株R31对青枯菌RS04的平板捕食；C图为菌株R31对青枯菌Ralstonia solanacearum RsH的平板捕食；D图为菌株R31对青枯菌Ralstonia solanacearum GMI1000的平板捕食；E图为菌株R31对青枯菌Ralstonia solanacearum GIM1.335的平板捕食。

图5为盆栽试验中菌株R31对番茄青枯病的生防效果

A图为盆栽实验中不同接种处理后“中蔬四号”番茄的生长情况，其中CK表示灭菌水对照接种处理，R31+RsH表示同时接种黏细菌和青枯菌的处理，RsH为只接种青枯菌的处理；B图为R31对番茄青枯病的防治效果统计；C图为不同处理番茄植株根际土壤中青枯菌的数量统计；D图为番茄根和茎组织中青枯菌的定量结果；不同小写字母列的数据经邓肯检验差异有统计学意义(P<0.05)。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：菌株的分离纯化(图1)

1.1样品采集后带回实验室在室温下自然风干。

从华南农业大学农场番茄青枯病发病田中采集土壤样品在室温条件下自然风干。

1.2黏细菌子实体的诱导

1.2.1青枯菌(被捕食菌)平板诱导：以水琼脂平板(CaCl₂·2H₂O 1g/L，3-吗啉丙磺酸2.093g/L，琼脂15g/L，pH 7.2)为基础分离培养基，准备无菌的水琼脂固体平板(倒平板前加入终浓度为25mg/mL的放线菌酮以抑制酶菌的生长)，在培养基表面用事先培养好的青枯菌划田子格，在田子格的四个方框中放入少量土样，28℃培养箱培养3d后，在体式显微镜下观察分离平板上的子实体的形成。

1.2.2黏细菌的分离纯化：在体式显微镜下用无菌针头挑取子实体转接到VY/2纯化培养基，置于28℃恒温培养箱中培养3～7d，再反复转接子实体于纯化培养基中，直至培养基上无杂菌生长，获得黏细菌R31。

1.3LB培养基验证黏细菌的纯度

将纯化后的黏细菌R31接种于LB液体培养基中，30℃200rpm培养过夜，第二天通过观察培养基澄清即表明分离的黏细菌为纯菌株，若培养基变浑浊，则继续重复以上操作，直至澄清为止。

1.4菌株的保藏：将纯化后的黏细菌R31接种到VY/2固体平板培养基(酵母粉5g/L，CaCl₂·2H₂O 1g/L，琼脂15g/L，pH 7.2)上，28℃培养5-7d后用灭菌的竹签刮取R31菌体重悬于1mL CTT液体培养基(酪蛋白胨10g/L，MgSO₄·7H₂O 1.97g/L，1M Tris-HCl pH 7.6 10mL/L，1M K₂HPO₄ 1mL/L，pH 7.2)中，加入1mL 50％的甘油后分成两份，一份-80℃保藏，一份液氮保藏。

实施例2.菌株的鉴定

2.1形态学鉴定

从青枯病病区土壤中分离筛选获得的黏细菌R31革兰氏染色为阴性，通过结晶紫染色在光学显微镜油镜下观察发现单细胞的形态呈杆状，两端呈透明状，无鞭毛；通过透射电镜观察发现R31菌体周围有一层黏液层；通过体式镜1观察发现R31菌株在生长过程具有群体行为，生长后期菌落聚集在一起形成肉眼可见的子实体结构(图2)。

2.2分子生物学鉴定

通过提取菌株R31的DNA，利用细菌的16S rDNA特异性引物27F和1492R和Taq酶对R31的16S rDNA基因序列进行扩增，扩增产物经电泳分析产生约1500b左右的条带，切胶回收该条带后送苏州金唯智生物科技有限公司进行sanger测序，测序得到的序列经DNAMAN软件拼接后获得16S rDNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，提交至EzBioClode网站(https://www.ezbiocloud.net/)进行鉴定，进一步菌株的16S rDNA提交至NCBI网站进行balst比对，获得与R31菌株相似菌株的16S rDNA序列，通过mega软件构建进化树(图3，图中的strain e-3-1)。最终通过序列比对及生理生化分析，将该菌株鉴定为Myxococcusxanthus，命名为黄色黏球菌(Myxococcus xanthus)R31，于2021年7月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为中国广州市越秀区先烈中路100号59号楼5楼，邮编：510070，保藏号为：GDMCC No：61842。

实施例3.黄色黏球菌R31菌株对青枯菌的捕食能力及功能评价

3.1黄色黏球菌R31对多株不同致病力的青枯菌的捕食作用研究

将VY/2平板上活化的黄色黏球菌R31菌株刮取适量的菌体接种于CTT液体培养基中，置于28℃、180rpm摇床中培养2d，然后8000rpm离心5min收集菌体，菌体用TPM缓冲液(不含酪蛋白胨的CTT液体培养基)重悬，制备成黄色黏球菌R31悬液。将活化的青枯菌挑取单菌落于TM液体培养基(细菌学蛋白胨10g/L，酸水解蛋白胨1g/L，葡萄糖5g/L，pH 7.0)中，置于30℃、180rpm摇床中培养，培养36-48h待细胞生长至对数生长期时，8000rpm离心5min收集菌体，用TPM缓冲液重悬，制备青枯菌菌悬液。

分别取20μL青枯菌悬液滴到TPM固体培养基(MgSO₄·7H₂O 1.97g/L，1M Tris-HClpH 7.6 10mL/L，1M K₂HPO₄ 1mL/L，琼脂15g/L，pH 7.2)上，使其自然淌开形成一个圆形菌圈。待菌液干燥后，在其边缘1～2mm处滴加4μL黄色黏球菌R31悬液。待干燥后将平板置于28℃恒温培养箱中，每隔1d观察捕食情况并使用体视显微镜拍照，结果发现黄色黏球菌R31在平板试验中能够高效捕食和裂解不同致病力的青枯菌(图4)。

3.2菌株R31对番茄青枯病的生防效果评价

分别将黄色黏球菌R31及青枯菌制成菌悬液(1×10⁶cfu/mL)，然后等量混合，选取长势一致、高约15cm的番茄苗进行接种，接种方法采用伤根浸菌液加菌悬液灌根的方法，即清洗干净番茄根部的泥土，将根在混合好的菌悬液中浸泡30min，然后栽回花盆中，每盆再灌入20mL混合的菌液(R31+RsH)。以无菌水(CK)和只接种青枯菌悬液(RsH)作为对照。每个处理5个重复，移栽后放置于玻璃温室中14d。如Kempe发表的论文所述，每天观察并记录番茄幼苗的病害严重程度，计算各处理的发病率与病情指数。栽培试验重复3次。利用平板梯度稀释的方法及实时荧光定量PCR技术测定生防过程中黏细菌和青枯菌在番茄根际土壤中的定殖情况，同时利用实时荧光定量PCR技术测定不同处理组番茄根系和茎部组织中的青枯菌的丰度。结果表明黄色黏球菌R31对番茄青枯病的生防效率高达81.9％，并且还发现在土壤中添加黄色黏球菌R31后，番茄根部青枯菌的丰度要显著低于单独接种青枯菌的处理(图5)。

序列表

<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120> 一株捕食番茄青枯菌的黄色黏球菌及其在番茄青枯病生物防控中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1402

<212> DNA

<213> 黄色黏球菌R31(Myxococcus xanthus)

<400> 1

cctcttggtg agatgatttc tggagcaatc gactcccatg gtgtgacggg cggtgtgtac 60

aaggcccggg aacgtattca ccgcagcgtg ctgatctgcg attactagcg attccgcctt 120

catggagtcg agttgcagac tccaatctga actgagaccg gttttatgcg attagctccc 180

cctcgcgggt tggcaacgct ctgtaccggc cattgtagca cgtgtgtagc cctggtcata 240

aaggccatga ggacttgacg tcatccccac cttcctccgg tttaacaccg gcagtccctc 300

tagagatcca cttgcgtggc aactaaaggc gagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc 360

aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcagcacc tgtctctcag ttcccttgcg 420

ggcactccct catctctgaa ggattctgag gatgtcaaga ccaggtaagg ttctgcgcgt 480

tgcgtcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt 540

tttagtcttg cgaccgtact tcccaggcgg agaacttaat gcgttagctt cggcaccgcg 600

ggggtcaact cccacgacac ctagttctca tcgtttacgg cgtggactac cagggtatct 660

aatcctgttt gctccccacg ctttcgcgtc tcagcgtcag ttaccgtcca ggtggccgcc 720

ttcgccaccg gtgttcctcc ccatatctac gaatttcacc tctacttggg gaattccgcc 780

accctctccg gcactcaagc acaacagttt cgggcgcact tcctcagttg agctgagggc 840

tttcacaccc gacttgtcac gccgcctaca cgcgctttac gcccaataat tccgaacaac 900

gcttgcaccc tctgtattac cgcggctgct ggcacagagt tagccggtgc ttcttctccc 960

ggtaccgtca agccgttgga tgttagccaa cgggttttct tcccggtcga aagtgcttta 1020

caatccaaag accttcatca cacacgcggc gttgctgcgt caggctttcg cccattgcgc 1080

aaaattcccc actgctgcct cccgtaggag tctggaccgt gtctcagttc cagtgtggct 1140

gatcgtcctc tcagaccagc tacccgtcgt tgccttggtg ggccattacc ccgccaacta 1200

gctgatgggc cgcggactca tctgaatgtg atagcttgta tacagaggcc accttttccc 1260

tcagtctccg aagaaaccgt gggcttatcc ggtattagcc aatctttcga ctggttatcc 1320

cgagcactca ggcagattat ccacgtgtta cgcacccgtg cgccgctcta ctaagggttg 1380

cccctattcg cgctcgactg ca 1402

Claims (7)

1.黄色黏球菌(Myxococcus xanthus)R31，保藏号为：GDMCC No：61842。

2.权利要求1所述的黄色黏球菌R31在制备生物菌剂和/或生物肥料中的应用。

3.权利要求1所述的黄色黏球菌R31在防治植物病原菌青枯菌中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的青枯菌为番茄青枯菌。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的青枯菌为番茄青枯菌模式菌株Ralstonia solanacearum GMI1000、番茄青枯病高致病力菌株Ralstonia solanacearumRsH、Ralstonia solanacearum RS04、番茄青枯菌弱致病力菌株Ralstonia solanacearumGIM1.335或番茄青枯菌致病力丧失菌株Ralstonia solanacearum 1.70。

6.一种防治植物病原菌青枯菌的方法，其特征在于，是将权利要求1所述的黄色黏球菌R31菌体接种到番茄植株根部，防治植物病原菌青枯菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，是将黄色黏球菌R31进行扩大培养，获得黄色黏球菌R31的菌体。

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