CN113789274B

CN113789274B - 一株葡萄根际拮抗促生链霉菌f2及其应用

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Publication number: CN113789274B
Application number: CN202110952119.9A
Authority: CN
Inventors: 胡珊; 梁卫驱; 黄皓; 徐匆; 罗华建; 胡楚维; 莫坚强; 黄晓彦; 陈仕丽
Original assignee: DONGGUAN RESEARCH CENTER OF AGRICULTURAL SCIENCE
Current assignee: DONGGUAN RESEARCH CENTER OF AGRICULTURAL SCIENCE
Priority date: 2021-08-19
Filing date: 2021-08-19
Publication date: 2023-02-17
Anticipated expiration: 2041-08-19
Also published as: CN113789274A

Abstract

本发明公开了一株葡萄根际拮抗促生链霉菌F2及其应用，其为卡伍尔链霉菌,保藏号为GDMCC No:61143，于2020年8月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，分类命名为Streptomyces sp.菌株F2的发酵液和无菌滤液对辣椒疫霉病菌等10植物病原菌有拮抗作用，抑菌率最高达80%以上，其中两者对辣椒疫霉病菌的抑制作用优良，抑制率分别为80.58%、87.71%。菌株F2发酵液对辣椒疫霉菌丝块的防治效果为61.09％。菌株F2发酵液对辣椒疫霉病具有明显的防治效果，最高防效达83.31%。F2具有解有机磷、固氮作用，能分泌胞外蛋白酶和产IAA。菌株F2发酵液灌根处理对辣椒生长具有显著的促进作用。链霉菌F2既具有广谱的拮抗植物病原菌作用，又具有促生作用。

Description

一株葡萄根际拮抗促生链霉菌F2及其应用

技术领域

本发明涉及植物根际促生菌，具体地说，涉及一种促生链霉菌及其应用。

背景技术

由土壤病原菌从作物根部或茎部侵害作物而引起的土传病害是农业植物病原菌的重要种类，土传病害的防治是农业可持续发展的重要限制因子。土传病害的危害程度跟土壤中病原菌的分泌物成分和浓度相关。因此，抑制根围系统病原物的活动成为进行土传病害防治的基础。植物、土壤微生物和土壤病原物三者之间相互关系的制约作用。有学者将根际生态系统抵御土壤病原菌入侵的现象和能力定义为根际免疫。因此，具有溶磷、嗜铁、分泌植物激素、固氮、拮抗病原菌等作用的根际拮抗促生菌为高效防控土传病害的有益菌群构建提供基本的材料和方法。

链霉菌是最高等的革兰氏阳性放线菌，广泛存在于土壤、海洋等不同的自然生态环境中，具有种类繁多、代谢功能各异等特点。链霉菌既可产生春雷霉素、井冈霉素和武夷霉素等多种抗生素，几丁质酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚糖酶等其他具有防病作用的次生代谢物质，又具有分泌IAA、嗜铁素、溶磷、协助微生物进行固氮作用等促进植物生长的作用。因此，链霉菌是根际生防促生菌的明星菌种。依据链霉菌的生存环境不同，可以将链霉菌初步分为土壤链霉菌、海洋链霉菌与植物内生链霉菌。近年来，从各种植物根际土壤，包括红豆杉、香蕉、甘蔗、辣椒筛选到有拮抗促生作用的链霉菌。葡萄根际土壤拮抗促生链霉菌的筛选还未有研究。此外，有研究表明，发病较为严重地块的健康植株根际土壤是优良生防菌株的储备库。本研究从发病严重葡萄园试验基地选取健康植株的根际土壤分离筛选一株链霉菌，对其进行分离鉴定和拮抗促生作用研究，为开发高效微生物菌肥储备菌株和提供理论依据，助力生态农业的可持续发展。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种葡萄根际拮抗促生链霉菌F2及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明为获得拮抗作用优的植物根际促生菌，从葡萄根际土壤样品中分离获得菌株F2。经形态特征、生理生化特征观察和16S rRNA序列分析，确定菌株F2为为卡伍尔链霉菌(Streptomyces cavourensis)。菌株F2的发酵液和无菌滤液对辣椒疫霉病菌等10植物病原菌有拮抗作用，抑菌率最高达80％以上，其中两者对辣椒疫霉病菌的抑制作用优良，抑制率分别为80.58％、87.71％。辣椒疫霉病的叶片防效结果表明，菌株F2发酵液对辣椒疫霉菌丝块的防治效果为61.09％。室内盆栽试验结果表明，菌株F2发酵液对辣椒疫霉病具有明显的防治效果，最高防效达83.31％。促生拮抗因子的测定结果表明，F2具有一定解有机磷、固氮作用，能分泌胞外蛋白酶和产IAA。菌株F2发酵液灌根处理对辣椒生长具有显著的促进作用。链霉菌F2既具有广谱的拮抗植物病原菌作用，又具有促生作用，在农药化肥减量化使用方面具备良好的应用前景。

一株葡萄根际拮抗促生链霉菌F2，其为卡伍尔链霉菌(Streptomycescavourensis),于2020年8月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:61143。地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，分类命名为Streptomyces sp.

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明从葡萄根际土壤样品中分离获得菌株卡伍尔链霉菌F2，其发酵液和无菌滤液对辣椒疫霉病菌等10植物病原菌有拮抗作用，抑菌率最高达80％以上。辣椒疫霉病的叶片防效结果表明，菌株F2发酵液对辣椒疫霉菌丝块的防治效果为61.09％。室内盆栽试验结果表明，菌株F2发酵液对辣椒疫霉病具有明显的防治效果，最高防效达83.31％。首次报道卡伍尔链霉菌具有促生作用。通过对卡伍尔链霉菌F2促生因子的测定结果表明，F2具有一定的解有机磷作用；在阿须贝培养基生长良好，固氮酶活性为173.4U/L；在酪蛋白培养基上，菌落周围产生22-24mm的透明圈；通过Salkowski法测定菌株F2产9.62mg/mLIAA。室内盆栽辣椒促生作用测定结果菌株F2发酵液灌根处理对辣椒生长具有显著的促进作用。菌株发酵液处理后，辣椒植株的根长、株高、鲜重分别为23.14cm、34.79cm、18.11g/株，比对照增加46.74％、61.33％、59.76％。

附图说明

图1为菌株F2在高氏一号培养基上的形态学特征图；

其中A：菌落形态；B：显微形态(10×100)；

图2为基于16S rDNA序列的F2系统发育进化树图；

图3为菌株F2的拮抗作用图；

A.花生褐斑病菌，B.甘蔗赤腐病菌，C.辣椒疫霉病菌，D.玉米小斑病菌，E.香蕉枯萎病菌，F.水稻纹枯病菌，G.西瓜炭疽病菌，H.苹果轮纹病菌，I.冬瓜枯萎病菌，J.水稻稻瘟病菌。每幅图培养皿1为空白平板对照，培养皿2为添加发酵液平板，培养皿3为添加无菌滤液平板。

图4为链霉菌F2促生试验结果；

其中有机磷(A)、固氮(B)、分泌蛋白酶(C)；

图5为菌株F2发酵液对辣椒疫霉病的叶片防治效果图；

A：P.capsfci菌丝块，B：F2+P.capsici菌丝块；

图6为F2菌株发酵液对盆栽辣椒苗生长的影响。

具体实施方式

试验材料和方法

1.1试验材料

1.1.1土样

土壤样品采集，于2020年3月份东莞市农业科学研究中心葡萄白粉病发病果园的发病果园中健康植株根际土壤，采用五点法取样后混合为1份，用无菌袋密封带回实验室。

1.1.2培养基

高氏一号培养基、放线菌液体培养基、有机磷细菌培养基(含琼脂)、硅酸盐培养基、酪蛋白琼脂培养基、阿须贝无氮培养基、CAS检测培养基：青岛高科技公园海博生物技术有限公司；营养肉汤：北京陆桥技术股份有限公司；马铃薯琼脂培养基：广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.3供试病原菌

由华南农业大学植物病理系提供。由华南农业大学植物病理系提供。1、花生褐斑病菌(Cercospora arachidicola Hori)；2、辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)；3、冬瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum(schl.)f.sp.benincasae)；4、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)；5、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)；6、西瓜炭疽病菌(Colleterichum orbicalare)；7、甘蔗赤腐病菌(Colletotrichum falcatum Went)；8、香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense)；9、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)；10、苹果轮纹病菌(Physalospora piricola)。

1.1.4供试辣椒品种大果青椒9918F1：广州亚蔬园艺种苗有限公司。

1.1.5供试药剂68.75％氟菌·霜霉威悬浮剂(银法利)：德国拜耳作物科学公司研制。

1.1.6主要仪器设备

立式蒸汽灭菌锅(YXQ-LS-SⅡ，上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、台式冷冻离心机(3K15，德国SIGMA公司)、生化培养箱(LRH-250，上海一恒科学仪器有限公司)、紫外可见分光光度计(UV-2450，日本岛津公司)。

实施例1：菌株的分离纯化和保藏

在无菌条件下，称取10g葡萄根际土样溶于90mL的装有无菌玻璃珠和无菌水的锥形瓶中溶解，在180r/min的振动筛上摇动混合物3h，并梯度稀释成10^－3、10^－4、10^－5倍的葡萄土样悬液，然后每个稀释度各取100μL均匀涂布于高氏一号培养基平板上，28℃，培养7d，并随时进行形态观察。将挑取最大的单菌落在培养基上，进行四区划线纯化，反复进行3次，同时用显微镜观察菌落纯度，直至获得纯培养。最后将所获得的纯培养菌株转入终浓度为30％的甘油中并密封保存于-20℃冰箱。

实施例2：菌株鉴定

形态学观察：观察链霉菌在高氏一号培养基表面生长菌落的形态、颜色等；挑取幼龄培养物，涂片、革兰氏染色，显微镜下观察菌体形态、大小、革兰氏染色反应等。利用高氏1号培养基从葡萄根际土壤样品中筛选纯化到一株长势良好的菌株F2。F2在高氏1号培养基上培养7d，如图1-A菌落颜色由白色逐渐变到灰色，白色单菌落凸起，表面绒状，边缘圆形，有同心环状花纹，具菌丝；镜检结果如图1-B，F2为革兰氏阳性菌，孢子丝螺旋形，孢子卵圆形。

16S rDNA基因序列的测定和系统发育学分析：提取细菌的基因组DNA后，采用细菌16S rDNA的通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。扩增完成后用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物。将结果为阳性的PCR反应产物后送至上海美吉生物医药科技有限公司测序。将测序结果提交GenBank进行BLAST比对，并选取同属内近缘种的16S rDNA基因序列进行同源性分析，利用MEGA7.0构建系统发育进化树。

菌株F2生理生化试验结果如表1所示，菌株能利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-果糖、D-甘露醇；不能利用蔗糖、鼠李糖、棉子糖、肌醇。明胶液化。牛奶凝固。淀粉水解强。硝酸盐不还原。酪氨酸酶阴性。

将测序结果提交GenBank进行BLAST比对分析发现，菌株F2与Streptomycescavourensis TJ430、。Streptomyces cavourensis1AS2a同源性达100％。为明确菌株之间的亲缘关系及系统地位，利用MEGA7.0构建系统发育进化树(图2)，同时结合菌株F2的形态特征及生理生化试验结果，鉴定F2为卡伍尔链霉菌(Streptomyces cavourensis)。

表1为菌株F2的生理生化鉴定结果

实施例3：链霉菌对植物真菌病害的拮抗作用

链霉菌的发酵液和无菌滤液制备：链霉菌接种在放线菌液体培养基中，28℃、130r/min振荡培养24h作为种子液，将种子液按1.5％(体积比)的接种量转接至放线菌液体培养基中，28℃、130r/min振荡培养5d后即得菌株的发酵液。随后将发酵液于4℃，9000r/min离心20min，取上清液用0.22μm无菌滤膜过滤，获得菌株的无菌滤液。

发酵液抑菌谱测定：按荣良燕等的方法，采用平板对峙法测定链霉菌与病原真菌的拮抗作用。将真菌与链霉菌同时接种在PDA平板上，平板中心接种真菌，菌饼直径为6mm，距中心2cm处等距离三点接种链霉菌发酵液(用加液枪将20μL菌液垂直滴在培养基上)，以不接种链霉菌的真菌平板为对照，每种处理3个重复。28℃培养，观察生长情况，在对照菌落长满平板时，真菌距链霉菌远端和近端的半径，按式(1)计算链霉菌对病原真菌的抑制率。抑制率越高,链霉菌F2对真菌的抑制作用越高。

菌丝生长抑制率(％)＝[(对照组平均菌落直径(mm)-处理组平均菌落直径(mm))/对照平均菌落直径(mm)]×100％(1)

带毒培养基法测定无菌滤液抑菌率：将链霉菌的无菌滤液按体积浓度5％与50℃左右的PDA培养基混合倒平板，不加无菌滤液的PDA作为对照(CK)。在混合培养基中央放置直径6mm的真菌菌饼，每个处理4个重复。28℃培养，观察生长情况，在对照菌落长满平板时，按式(1)计算测量菌落直径并计算抑制率。

发酵液抑菌谱：

采用平板对峙法测定链霉菌F2发酵液对植物病原真菌的拮抗作用，结果如表2、图3所示，菌株F2对花生褐斑病菌、甘蔗赤腐病菌、辣椒疫霉病菌、玉米小斑病菌、香蕉枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌、西瓜炭疽病菌、苹果轮纹病菌、水稻纹枯病菌10种植物病原菌均有不同程度的抑制作用。从表2可见，链霉菌F2对不同病原菌的抑菌率在81.59％-16.34％之间，对甘蔗赤腐病菌、辣椒疫霉病菌抑制活性达80％以上，抑菌率分别为81.59％、80.89％，对冬瓜枯萎病抑制活性最弱，为16.34％。继而深入研究链霉菌F2无菌滤液对植物病原菌的抑制作用。

无菌滤液的抑菌作用：

用含体积浓度5％链霉菌F2无菌滤液的培养基测定对辣椒疫霉病菌等10种植物病原菌的抑制作用。5％F2无菌滤液对9种植物病原菌均有不同程度的抑制作用，结果如表2、图3所示，抑制率在87.71％-23.53％之间，对辣椒疫霉病菌、甘蔗赤腐病菌抑制活性达80％以上，抑菌率分别为87.71％、80.58％，对冬瓜枯萎病抑制活性最弱，为23.53％。

表2为F2发酵液和无菌滤液的拮抗作用试验结果

实施例4：促生拮抗因子检测：

(1)解磷指标的测定：将链霉菌点接种到解有机磷和解无机磷培养基中，28℃培养7d，观察是否有透明圈；(2)解钾指标的测定：将链霉菌三区划线到硅酸盐培养基中，28℃培养7d，，观察是否有光滑透明油滴状菌落；(3)固氮能力测定：将链霉菌接种于阿须贝无氮平板，以无菌水为对照，3次重复，平板置于28℃培养箱培养7d，平板上有菌落者为阳性；利用固氮酶(NITS)ELISA试剂盒测定链霉菌固氮酶活性；(4)产生嗜铁素能力的检测：将链霉菌点接种到CAS培养基平板上，置于28℃培养7d，观察菌落周围是否会出现明显的橙色铁载体晕圈，若产生晕圈，则表明链霉菌能分泌铁载体的；(5)将链霉菌接种于含100mg/L色氨酸的LB液体培养基培养3d后，取2mL发酵液4℃，9 000r/min，离心15min后取上清液，每1mL上清液加2mL Salkowski试剂，室温条件下暗处显色1h，测定OD₅₃₀值。以空白培养基作对照，并以IAA标准品对应的OD₅₃₀值绘制标准曲线，计算发酵液中的IAA含量；(6)蛋白酶检测：将链霉菌点接种到酪蛋白培养基平板上，28℃培养2-5d，观察是否产生透明圈，若产生透明圈，则表明有蛋白酶产生。

链霉菌F2促生试验结果如图4所示。图4-A中，链霉菌F2在解有机磷培养基上，菌落周围产生较小的透明圈；图4-B中，链霉菌F2在阿须贝培养基生长良好，固氮酶活性为173.4U/L；图4-C中，链霉菌F2在酪蛋白培养基上，菌落周围产生22-24mm的透明圈；链霉菌F2产9.62mg/mLIAA。说明该链霉菌F2具有一定解有机磷、固氮作用，能分泌胞外蛋白酶和产IAA。

实施例5：链霉菌发酵液对辣椒疫霉的叶片防效测定

将链霉菌接种到150mL放线菌液体培养基中，在28℃、130r/min下振荡培养5d，浓度调节至l×10⁸cfu/mL，得到链霉菌发酵液备用。从辣椒植株上选取大小合适，正常生长的叶片，用蒸馏水洗净，再用70％酒精消毒30s，然后用无菌水冲洗2min，无菌操作晾干。将消毒过的辣椒叶片在链霉菌发酵液中浸泡lmin，取出在超净工作台中晾干。在叶片上分别接种直径6mm的辣椒疫霉菌丝块，每组10片叶片。以清洁在无菌水中浸泡lmin、接种6mm辣椒疫霉菌丝块的辣椒叶片作为对照，置于相对湿度90％的滤纸上，28℃黑暗培养，注意保湿，4d后测量病斑直径，按式(2)计算防效。

防效(％)＝(对照组病斑直径-处理组病斑直径)/对照组病斑直径×100％(2)

如图5所示，无菌水浸泡的辣椒叶片在接种辣椒疫霉菌丝块4d后，叶片上产生大片黑色病斑，叶片变软、腐烂。而浸泡过F2发酵液的辣椒叶片受到侵染后，发病情况显著降低，叶片新鲜度较好。无菌水和F2发酵液处理后的叶片病斑直径分别为2.75±0.26cm和0.97±0.14cm，对辣椒疫霉菌丝块的防治效果为61.09％。

实施例6：辣椒疫霉病菌温室盆栽试验

辣椒疫霉病菌经PDA平板培养7d后，于菌落边缘打孔直径为6mm的菌饼并挑取10块菌饼于灭菌的培养皿中，加水淹过表面，每隔30min换水1次，第4次换水后将10mL洗液注于灭菌的PDB液体培养基并于28℃、180r·min^-1振荡培养5d，双层灭菌纱布过滤，显微镜下利用血球计数板对游动孢子计数，并用无菌水稀释成浓度为1×10⁶个·mL^-1孢子悬浮液，与灭菌土(灭菌基质与灭菌土壤按照1:3比例混合)按1:10比例混合制备成盆栽病土。挑选长势相同的5-6叶期辣椒苗，种植到病土盆栽中。随机分为3组，对照组CK为30mL无菌水；处理组2为30mL68.75％银法利悬浮剂(800倍液)，处理组3为30mL按1.2.5方法制备的发酵液，每组10株，进行灌根施药试验，7d后分别重复施药1次，于4d、8d和12d后记录发病情况，按式(3)、(4)计算病情指数和相对防治效果。疫霉病病害分级标准如下：0级：健康无症；1级：心叶变软至萎；2级：2～3片叶子萎蔫，叶片沿叶柄基部下垂；3级：4～5片叶子萎蔫，下垂，茎尖萎蔫，变褐；4级：6～7片叶子萎蔫,下垂,茎尖至茎中上部萎蔫,变褐；5级：整株枯死或植株变褐倒伏。

链霉菌对室内盆栽辣椒疫霉病的防治效果：

室内盆栽辣椒疫霉病防治测定结果如表3所示，链霉菌F2发酵液对辣椒疫病具有明显的防治效果。与对照无菌水处理相比，菌株发酵液灌根处理能明显降低辣椒苗疫病的病情指数，接种4、8和12d的防效分别为67.88％、83.31％和73.67％；与对照化学药剂68.75％银法利悬浮剂相比，银法利效果更快速，在施药4d后防效达90.55％，但其持效性不如菌株F2发酵液，在施药后12d防效为66.02％。

表3为F2发酵液对盆栽辣椒苗疫病的防治效果

注：-：没有抑菌效果.

实施例7：链霉菌对室内盆栽辣椒促生作用的测定

在装有灭菌土(配制方法同实施例6)的花盆中移植培育的辣椒苗，待辣椒苗长至5-6叶期，取20mL按实施例3方法制备的链霉菌发酵液均匀浇灌各盆根围土壤，对照浇灌20mL无菌水，每处理5个重复，7d后重复浇灌1次。处理后15d取样测定每株辣椒的根长、株高、鲜重，计算促生增幅。

1.2.8数据分析采用统计软件SPSS17.0及Microsoft Excel 2007对数据进行分析，图表中数据为平均值±标准差。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，以最小显著性差异法(LSD)多重比较检验不同处理之间的差异显著性(α＝0.05)。

室内盆栽辣椒促生作用测定结果表明(图6)，菌株F2发酵液灌根处理对辣椒生长具有显著的促进作用。菌株发酵液处理后，辣椒植株的根长、株高、鲜重分别为23.14cm、34.79cm、18.11g/株，比对照增加46.74％、61.33％、59.76％。

Claims

1.一株葡萄根际拮抗促生链霉菌F2，其为卡伍尔链霉菌（Streptomyces cavourensis）, 保藏号为GDMCC No:61143。

2.权利要求1所述葡萄根际拮抗促生链霉菌F2在抑制花生褐斑病菌、辣椒疫霉病菌、水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、甘蔗赤腐病菌、玉米小斑病菌或苹果轮纹病菌中的应用。