CN114164136B - 一种抗香蕉枯萎病的链霉菌新种及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了提供一种链霉菌，其为链霉菌属的一个新种，命名为Streptomyces Yongxingensis sp.nov.，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021303。本发明的链霉菌具有稳定广谱抑菌活性，其进行发酵培养后，对香香蕉枯萎病菌4号生理小种、香蕉枯萎病菌1号生理小种、辣椒炭疽病菌、香蕉长形斑病菌、黄瓜枯萎病菌、芒果炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、胶孢炭疽病菌、小麦赤霉病菌、苹果轮纹病菌、草莓炭疽病菌、灰葡萄孢霉病菌等具有良好的拮抗作用，为枯萎病等多种植物病害的防治拓展新领域，而且还能促进植物生长，具有广阔的发展空间和良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种抗香蕉枯萎病的链霉菌新种及其应用。
背景技术
病原真菌引起的植物病害是目前科学界最关注的农业问题之一，给农业带来了巨大损失，对全球粮食安全构成严重威胁(Chaiharn et al.,2009)。香蕉枯萎病(Foc TR4)是由尖孢镰刀菌引起的一种常见植物病害，是一种对香蕉造成重大经济损失的毁灭性病害，利用土壤中的拮抗微生物可以有效地控制病原菌的生长和繁殖(Deng et al.,2013)。植物病害的生物防治以其高效、广谱、环境友好、不会引起植物病原菌产生抗性等优点成为研究的热点，然而，寻找拮抗微生物和活性代谢物是生物防治的关键因素(Chaves et al.,2011)
放线菌是生物活性天然产物研究最热门、最有效的一类微生物，已被广泛用来保护植物免受多种植物病原真菌的侵害，它们产生的活性化合物被用作抗真菌抗生素、抗肿瘤剂、抗氧化剂、抗炎剂、抗菌剂、酶抑制剂、杀虫剂、植物生长促进剂等(Qin et al.,2011；Ashokvardhan et al.,2014；Wang et al.,2013；Kumaret al.,2014b；Shivlata et al.,2015；Tan et al.,2016)。
在放线菌生物活性化合物的研究中，链霉菌属占主要部分，已从该属中分离获得阿维菌素、四环素、链霉素、制霉菌素、红霉素等化合物(Ser et al.,2016)。链霉菌是革兰氏阳性细菌，丝状可产孢放线菌，细胞壁主要由肽聚糖组成，其基因组中的(G+C)％含量很高(Lyu et al., 2017)，它们对一系列植物病原真菌均表现出较强的生物活性(WangX.N.et al.,2013)。链霉菌长期以来被简单地认为是自由生活的土壤土著放线菌，因其具有生物活性的次级代谢产物而被视为重要的生物资源，这些抗菌化合物在保护植物抵御病原菌方面发挥着重要作用，它们常被用作高效的土传性病害的生物防治剂(Ueno et al.,2016)。Getha et al.(2002)发现 Streptomyces violaceusniger对香蕉枯萎病有较强的抑制作用，在盆栽实验中防控效果为48％-52％。拮抗放线菌的分离与鉴定被认为是农业发展、生态安全和植物病害防治中不可或缺的重要环节(Lu et al.,2016)。因此，发现新的抗菌活性菌株尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种链霉菌，其为链霉菌新种，具有广谱抑菌活性，对多种病菌具有良好的拮抗作用，具有广阔的发展空间和应用前景。
本发明的第一个方面是提供一种链霉菌，其为链霉菌属的一个新种，命名为Streptomyces Yongxingensis sp.nov.，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021303。
本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的链霉菌的发酵液、或发酵液的过滤液、或发酵液的乙醇提取物。
其中，所述发酵液的乙醇提取物是经发酵液加入适量乙醇萃取后，过滤浓缩得到。
本发明的第三个方面是提供如本发明第一个方面所述的链霉菌、或者本发明第二个方面所述的发酵液或发酵液的过滤液或发酵液的乙醇提取物在拮抗香蕉枯萎病菌4号生理小种、和/ 或香蕉枯萎病菌1号生理小种、和/或辣椒炭疽病菌、和/或香蕉长形斑病菌、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或芒果炭疽病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或胶孢炭疽病菌、和/或小麦赤霉病菌、和/ 或苹果轮纹病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或灰葡萄孢霉病菌中的应用。
本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的链霉菌、或者本发明第二个方面所述的发酵液或发酵液的过滤液或发酵液的乙醇提取物在制备防治香蕉枯萎病菌4号生理小种、和/或香蕉枯萎病菌1号生理小种、和/或辣椒炭疽病菌、和/或香蕉长形斑病菌、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或芒果炭疽病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或胶孢炭疽病菌、和/或小麦赤霉病菌、和/或苹果轮纹病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或灰葡萄孢霉病菌所致病害的生防制剂中的应用。
本发明的第五个方面是如本发明第一个方面所述的链霉菌、或者本发明第二个方面所述的发酵液或发酵液的过滤液或发酵液的乙醇提取物在促进植物生长中的应用。
本发明的第六个方面是提供一种生防制剂，其含有本发明第一个方面所述的链霉菌，或者含有本发明第二个方面所述的链霉菌的发酵液、或发酵液的过滤液、或发酵液的乙醇提取物。
本发明的链霉菌为链霉菌属的一个新种，具有稳定广谱抑菌活性，其进行发酵培养后，对香蕉枯萎病菌4号生理小种、香蕉枯萎病菌1号生理小种、辣椒炭疽病菌、香蕉长形斑病菌、黄瓜枯萎病菌、芒果炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、胶孢炭疽病菌、小麦赤霉病菌、苹果轮纹病菌、草莓炭疽病菌、灰葡萄孢霉病菌等具有良好的拮抗作用，为枯萎病等多种植物病害的防治拓展新领域，而且还能促进植物生长，具有广阔的发展空间和良好的开发应用前景。
附图说明
图1为菌株2-11在高氏1号培养基上培养14天后扫描电镜观察结果，标尺为2μm。
图2为菌株2-11的生理生化特征鉴定结果，图中a和b为脲酶试验的对照和处理结果；c 和d为酯酶试验吐温20和吐温40结果；e和f为解淀粉酶试验的对照和处理结果；g为硝酸盐还原试验结果。
图3中图3a为提取的菌株2-11的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果，图3b为16S rRNAPCR扩增的琼脂糖凝胶电泳结果，其中，A、B、C为菌株2-11的平行样DNA和PCR电泳结果。
图4为基于16S rRNA邻接法构建系统发育树。
图5为链霉菌2-11发酵粗提物对尖孢镰刀菌4号小种的抑制作用鉴定结果。
图6为链霉菌2-11发酵活性成分对植物病原真菌的抑菌活性鉴定结果。
图7为用带荧光的Foc TR4检测香蕉早期感染过程的结果，图中a为对照组第1天观察结果；b为对照组第7天观察结果；c为处理组第1天观察结果；d为处理组第7天观察结果。
图8为不同土壤样品中Foc TR4病原菌数量。
图9为链霉菌2-11对香蕉叶绿素含量的影响结果。
图10为菌株2-11对香蕉鲜重和干重的影响结果。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。
本发明提供了一种链霉菌，其为链霉菌属的一个新种，命名为StreptomycesYongxingensis sp.nov.，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021303，地址在中国武汉的武汉大学。本发明的链霉菌从采自中国南海西沙群岛东部永兴岛(16°49′53″N，112°20′22"E)附近海域的小月柳珊瑚(Menellawoodin)样品中分离得到。
1试验材料
1.1供试样品
小月柳珊瑚(Menella woodin)样品，采自中国南海西沙群岛东部永兴岛(16°49′53″N， 112°20′22"E)附近海域。
1.2供试培养基
本章实验所用主要培养基包括分离培养基、培养特征观察培养基和生理生化特征观察培养基，见表1、表2和表3。
表1分离培养基的成分
表2培养特征观察培养基
表3生理生化特征观察培养基
1.3主要试剂
本章试验所用主要试剂见表4。
表4主要生化试剂及来源
1.4实验仪器与设备
本章试验所需主要仪器与设备见表5。
表5仪器和设备
1.5供试病原菌
香蕉枯萎病菌4号生理小种F.oxysporum f.sp.cubense Race 4(ATCC 76255)(Foc TR4)；香蕉枯萎病菌1号生理小种F.oxysporum f.sp.cubense Race 1(ACCC 76244)(Foc 1)；辣椒炭疽病菌Colletotrichum acutatum Simmonds(ATCC 56815)；香蕉长形斑病菌Curvulatia fallax(ATCC 38579)；黄瓜枯萎病菌F.oxysporum f.sp.cucumerinum(ATCC204378)；芒果炭疽病菌 Colletotrichum musae(ATCC 96167)；水稻稻瘟病菌Pyriculariaoryzae Cavara(ATCC 62355)；胶孢炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides(Penzig)Penzig et Saccardo(ATCC MYA-456)；小麦赤霉病菌Fusarium graminearum Schwabe(ATCC MYA-4620)；苹果轮纹病菌Botryosphaeria dothidea(ATCC 208828)；草莓炭疽病菌Colletotrichum fragariae Brooks(ATCC 58718)；灰葡萄孢霉病菌Botrytis cinereaPersoon(ATCC 11542)。
1.6分析软件
本章研究中使用的数据分析软件见表6。
表6分析软件及网址
2试验方法与结果
2.1软珊瑚共附生放线菌的分离
称取5g新鲜的珊瑚样品，无菌海水冲洗3次，以去除表层附着的细菌，充分研磨。研磨后的匀浆样品，溶于45mL的无菌水中，置于180r/min的摇床上振荡30min，充分混匀得到悬浮液。采用10倍连续稀释法进行稀释，配制成10-1、10-2、10-3的悬浮液，取每个梯度的悬浮液100μL涂布于6种特异性分离培养基(M1-M6)，28℃倒置培养2-4周，每个梯度设置 3个重复，待菌落长出后，挑取形态特征不同的单菌落在YE培养基进行划线纯化。筛选到1 株代谢产物活性最好的菌株2-11。
2.2活性菌株的表型特征分析
2.2.1形态特征扫描电镜观察
菌株采用插片法(Park et al.,2004)进行形态学观察。活性菌株被接种在高氏1号培养基上，将灭菌的玻片(5mm×5mm)以45°斜插在接有活性菌株的高氏一号培养基上，28℃培养 7-10天。将附着有孢子和菌丝的玻片经过固定、漂洗、脱水、置换、干燥和喷金后，用扫描电镜观察各菌株的菌丝和孢子链等形态特征。结果见图1，菌株2-11在Gause’s no.1培养基上产生浅黄色基内菌丝，随着年龄增长颜色加深；形成灰白色气生菌丝，气生菌丝分化为螺旋状孢子链；产生灰黑色气生孢子团，孢子具皱纹状纹饰。
2.2.2培养特征观察
参照《链霉菌鉴定手册》和《放线菌快速鉴定与系统分类》，采用国际公认及规定的七种培养基(Shirling et al.,1966；Williams et al.,1983)进行菌落及培养特征观察。采用平板划线法将菌株分别接种于ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6、ISP7、PDA和Gause’s no.1培养基上，28℃倒置培养7-15d，观察并记录菌株的培养特征，包括气生菌丝、基内菌丝、可溶性色素及生长状况。颜色与ISCC COLOR CHARTS色谱进行比对(Kelly,1964)。
链霉菌在不同培养基上的培养特征见表7。菌株2-11在8种培养基上也能正常生长，且不产生色素，在ISP2、ISP4、ISP7和Gause’s no.1培养基上生长良好，气生菌丝较发达，呈灰色和白色，基内菌丝丰富多样，颜色由白到淡黄，再到亮黄。
表7菌株2-11的培养特征
+++,生长良好；++,正常生长；+,生长不良。
2.2.3生理生化特征分析
参照Shirking与Gottlieb(Shirking et al.,1966)的方法对活性菌株进行生理生化特征鉴定。
(1)单一碳源利用实验
在放线菌的生理生化鉴定中，菌株对碳源的利用是一项重要的指标。不同放线菌对碳源的利用情况不同。单一碳源利用实验是将单一的碳源按照1％的浓度加入普戈二氏的基础培养基中，以不加碳源的基础培养基作为空白对照，然后接入待测菌株，于28℃下培养7～14d，观察菌株的生长情况，生长优于对照的记录为阳性，表明该菌株具有利用该碳源的能力；相反，生长不如对照或差别不明显则为阴性，表明没有利用该碳源的能力。结果见表8，试验中涉及的19种碳源均可被菌株2-11利用。
(2)单一氮源利用实验
跟碳源利用类似，不同放线菌对氮源的利用情况也不同。将单一氮源按照0.5％的浓度加入氮源基础培养基中，以不加任何氮源的基础培养基作为空白对照，然后接入待测菌株，于 28℃下培养7～14d，观察菌株的生长情况，生长优于对照的记录为阳性，表明该菌株具有利用该氮源的能力；相反，生长不如对照或差别不明显则为阴性，表明没有利用该氮源的能力。结果见表8，供试菌株可利用的氮源较广，18种氮源中，菌株2-11不能利用L-精氨酸、L-半胱氨酸、硫酸铵、草酸铵和醋酸铵。
(3)酶学特性实验
①淀粉水解实验：采用点接法将待测菌株接种到淀粉琼脂平板上，于28℃培养7～10d，在菌落的周围滴加少量的卢戈氏碘液，若菌株能够产生淀粉酶，会将淀粉水解成糊精或将淀粉利用掉，菌落周围会出现不变色的透明圈，而透明圈的大小表示淀粉酶活性的强弱；若不产生淀粉酶，则菌落周围遇到碘液呈蓝色。②明胶液化实验：将待测菌株接种于明胶培养基试管中，于28℃下培养，分别在7d、14d、21d、28d周观察菌株生长状况及培养基中明胶液化程度，如果有液化现象，则为阳性，表明该菌株具有液化明胶的能力，反之，则为阴性。③纤维素分解实验：配制纤维素分解培养基，然后将滤纸条的一段浸入液体培养基中，灭菌后，将菌株接种在培养基中，28℃静置培养，30d后观察滤纸条有无被分解，若分解，则为阳性，说明产生了纤维素分解酶，反之，则为阴性。④硝酸盐还原：将待测菌株接种到硝酸盐还原液体培养基中，28℃震荡培养7～14d，以不接菌的培养基作为空白对照。将少许的培养液加入试管中，分别加入格里斯氏试剂A和B，若溶液呈现粉红、玫瑰红、棕色或者橙色，表示有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。若无上述颜色出现，再滴加1或2滴二苯胺试剂，溶液呈蓝色，则还原作用为阴性，若不呈蓝色，则按阳性对待。⑤脲酶实验：配制脲酶培养基，将待测菌株接种到脲酶培养基上，28℃倒置培养4d，观察培养基颜色变化。若培养基变成桃红色，则为阳性，不变色，则为阴性。⑥脂酶(吐温-20、-40、-80)实验：配制脂酶培养基，将单独灭菌的吐温-20、-40、-80与培养基混合制板，将菌株接种于平板上，28℃倒置培养7～14d，若菌落周围产生晕圈，则为阳性，反之，则为阴性。
结果显示，菌株2-11具有多种酶学活性，可使明胶液化和硝酸盐还原，可产生过氧化氢酶、纤维素酶、淀粉酶、酯酶和脲酶。
(4)代谢产物实验
①硫化氢产生实验：将待测菌株接种到柴斯纳培养基上，28℃倒置培养7～14d，如产生黑色素，则说明有硫化氢产生，H2S与柠檬酸铁结合产生FeS，培养基呈现黑色。以未接种的培养基作为对照。②黑色素产生：将待测菌株接种到黑色素产生培养基上，28℃倒置培养7～28d，观察菌落边缘是否有黑色素生成。
结果显示，菌株2-11不能产生H2S，MR和VP试验均为阴性。
(5)生长特性测定
①盐耐受实验：配制含不同NaCl浓度(w/v)(1％、3％、5％、7％、9％、11％、13％、15％)的YE培养基，将待测菌株接种于培养基上，于28℃倒置培养14d，观察菌株在不同的NaCl浓度上的生长情况，得到菌株生长的NaCl浓度范围，以及最适生长NaCl浓度。②pH 耐受实验：配置YE液体培养基，调节pH值分别为3、4、5、6、7、8、9、10，将待测菌株分别接入不同pH值的培养基中，28℃振荡培养14d，观察菌株在不同pH值培养基中的生长情况，得到菌株生长的pH值范围，以及最适生长pH值。③温度耐受实验：配置YE培养基，将待测菌株接种于培养基平板上，于4℃、14℃、20℃、28℃、37℃、45℃倒置培养7～28d 天，观察菌株在不同温度时平板上的生长情况，得到菌株生长的温度范围，以及最适生长温度。
结果显示，菌株2-11耐受pH值范围为5-9，最适生长pH值为6；在NaCl中耐受范围为0-9％，最适生长盐浓度范围为5-8％；可耐受温度范围为15-40℃，最适生长温度为30℃。
(6)抗生素敏感性实验
采用药敏纸片法测定菌株对抗生素的敏感性。将菌液均匀地涂布在ISP2平板上，同时以无菌镊子取药敏试纸片贴到培养基表面，28℃培养7天后观察抑菌圈。本实验选用30种抗生素:克林霉素(2μg/片)、氯霉素(30μg/片)、呋喃唑酮(300μg/片)、复方新诺明(1.5μg/片)、多粘菌素B(300IU片)、万古霉素(30μg/片)、环丙沙星(悉复欢)(5μg/片)、氧氟沙星(泰利必妥)(50μg/片)、诺氟沙星(氟哌酸)(10μg/片)、青霉素(10U/片)、红霉素(15μg/片)、米诺环素(30μg/片)、多西环素(30μg/片)、四环素(30μg/片)、新霉素(30μg/片)、卡那霉素(30μg/ 片)、庆大霉素(10μg/片)、阿米卡星(丁胺卡那霉素)(30μg/片)、头孢哌酮(先锋必)(75μg/ 片)、头孢曲松(30μg/片)、头孢他啶(30μg/片)、头孢呋辛(30μg/片)、头孢拉定(30μg/片)、头孢唑啉(30μg/片)、头孢氨苄(30μg/片)、麦迪霉素(30μg/片)、羧苄西林(100μg/片)、氨苄西林利(10μg/片)、苯唑西林(1μg/片)、哌拉西林(氧哌嗪青霉素)(100μg/片)，纸片直径 6mm。结果以无抑菌圈为不敏；10mm以下为低敏；10-14mm为中敏；15mm以上为高敏。
结果表明，菌株2-11对万古霉素、青霉素、红霉素、诺氟沙星(氟哌酸)、卡那霉素、庆大霉素和头孢曲松表现为高敏，多粘菌素B和头孢呋辛表现为中敏。
表8菌株2-11的生理生化特征
+:结果为阳性；－:结果为阴性
表9试验菌株对部分抗生素的药敏试验结果
2.3分子生物学鉴定
(1)放线菌基因组DNA的提取
采用Bioteke的细菌基因组DNA快速提取试剂盒(DP1301，北京百泰克生物技术有限公司，中国)进行放线菌总DNA的提取。琼脂糖凝胶电泳结果见图3a，基因组DNA的目的条带较清晰，说明基因组DNA的纯度较高，可以用作PCR反应的模板。
(2)16S rRNA的测序和分析
以放线菌基因组DNA为模板，采用通用引物27F(5′-AGAG TTTG ATCC TGGC TCAG-3′) 和1492R(5′-TACG GCTA CCTT GTTA CGAC TT-3′)进行PCR的扩增。PCR的反应体系见表10，PCR扩增的反应条件见表11(Himaman et al.,2016；Sabdono et al.,2019)。
表10 16S rRNA序列PCR反应体系
表11 16S rRNA序列PCR扩增反应条件
②PCR产物的电泳检测：
PCR反应结束后，取5μL的PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上对菌株PCR产物进行电泳检测，根据目的片段的长度大小确定是否连接成功。结果见图3b，得到了一条约1500bp的条带。
③测序及序列比对分析：
将菌株PCR产物进行序列测定。将测得的16S rRNA基因序列与保存在公共数据库GenBank和EzBiocloud服务器(https://www.EzBiocloud.net/identify)(Kim et al.，2012)中已知的16S rRNA序列进行同源性比较，选取25株同源性较高的标准菌株，利用MEGAversion X 软件中的neighbor-joining方法构建系统发育树(Kumar,et al.,2019)。
结果见图4，菌株2-11确定为链霉菌属(Streptomyces)，与标准菌株Streptomycesrapamycinicus NRRL B-5491(T)(EF408733)和Streptomyces iranensis HM 35(T)(FJ472862) 显示最高的同源性，分别为99.15％和98.46％，且在系统发育树中形成一个独立、稳定的大分支，分支自展值为62％，亲缘关系最近，结合形态特征、培养特征和生理生化特征结果，可以初步判断菌株2-11为Streptomyces属新种。
2.4基因组测序及多相分类鉴定
由北京BioMarker生物科技有限公司在Hiseq X平台上，采用配对末端测序法，在覆盖深度为100x(Illumina，San Diego，CA，USA)处对菌株2-11进行全基因组测序。对每个基因组原始数据进行过滤，Reads过滤后，高质量的成对Reads被组装，基因组组装后，供试菌株Scaffold数据与标准菌株Scaffold数据使用ANI计算平台 (https://www.ezbiocloud.net/tools/ANI)计算平均核苷酸一致性(ANI)(Yoon et al.,2017)，标准菌株基因组数据从EzBioCloud公共基因组数据库 (https://www.ezbiocloud.net/search？tn＝Nocardioides)下载。
菌株2-11经过二代和三代测序及组装，共获得101969条基因序列，基因组由一条881804812bp完整的环状染色体组成，基因组N50长度为13335bp，序列大小与已提交的链霉菌属测序结果基本吻合。基因组组装后，由1个contigs和1个Scaffold组成，Contig N50 和Scaffold N50长度均为11310836bp，基因组G+C含量为71.26％，与同属菌株相近，属于高 G+C含量放线菌。基因组数据见表12。
从EzBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/search？tn＝Nocardioides)公共基因组数据库下载最高同源性标准菌株Streptomyces rapamycinicus NRRL B-5491(T)(EF408733)和Streptomyces iranensis HM 35(T)(FJ472862)的基因组数据，提交至ANI计算平台(https://www.ezbiocloud.net/tools/ANI)计算平均核苷酸一致性(ANI)，结果显示，菌株2-11 的(G+C)mol％含量为71.26％，Streptomyces rapamycinicus NRRL B-5491的(G+C)mol％含量为71.04％，Streptomyces iranensis HM 35的(G+C)mol％含量为70.93％(表13)。菌株2-11 与标准菌株Streptomyces rapamycinicus NRRL B-5491(T)(EF408733)比对的ANI值为94.29 (≤95％)；与标准菌株Streptomyces iranensis HM 35(T)(FJ472862)比对的ANI值为94.38 (≤95％)(表14)。基于上述鉴定分析，可以确定菌株2-11是一个Streptomyces属新种，命名为Streptomyces Yongxingensis sp.nov.(永兴链霉菌)。
表12链霉菌2-11基因组序列数据
表13菌株2-11的基因组和(G+C)mol％含量数据
表14ANI比对结果
2.5抗真菌活性研究
(1)菌株的抑菌活性
采用平板对峙培养法(Sadeghian et al.,2016；Sharma et al.,2016)进行拮抗菌的筛选。配制PDA培养基平板，用打孔器取下培养5d、长势良好的Foc TR4病原菌菌饼(Φ＝5mm)，置于PDA平板中央，以平板中央为中心画“十”，在“十”字4条边上距中心2.5cm处，接种供试菌株，以只接种Foc TR4病原菌作为对照，28℃倒置培养5-7d后，测量真菌菌丝体边缘与放线菌之间的距离，记为抑菌带，通过抑菌带的大小进行拮抗菌的筛选。结果显示，菌株2-11 对Foc TR4病原菌具有明显的抑菌活性，抑菌圈超过20mm，标记为4级活性菌株。
(2)菌株代谢产物活性研究
将初筛中抑菌活性较好的菌株，接入YE液体培养基中，于28℃、180r/min条件下，振荡培养4d，制成种子液备用。按5％的接种量，将种子液接入100mL FM2发酵培养基中(250mL三角瓶)，于28℃180r/min振荡培养8d，并按1:1(v/v)比例加入无水乙醇超声萃取1h，米拉布(Mira cloth)过滤，于45℃条件下减压浓缩，制成粗提物浸膏。
采用TLC-生物自显影法(TLC-bioautography)(Sun et al.,2018)测定放线菌粗提物对病原菌Foc TR4的抑菌活性。配置PDA培养基，接入Foc TR4，于24℃下培养7-10d，加入10mL 无菌水洗脱孢子，制备分生孢子悬浮液，加入适量PDB液体培养基，配成浓度为3.0×105孢子/mL的孢子悬浮混合液。粗提物溶解在甲醇中配制成20mg/mL的浓度，使用标定的毛细管在 TLC板上点4μL和8μL的样品，在TLC板上均匀喷洒(Foc TR4)孢子悬浮液(3.0×105孢子 /mL)三次，将TLC板置于湿润的盒子里，于25℃培养箱中12h光照，12h黑暗，昼夜交换培养4d，当TLC板上出现空白区，表明真菌生长受抑制，该粗提物中含有抗真菌成分，并记录抑菌圈直径。结果如图5所示，拮抗菌2-11的粗提物对Foc TR4病原菌有明显的抑菌活性，抑菌圈大小26.81mm。
2.6广谱抗真菌活性研究
(1)对12种植物病原真菌的抑制作用
为了评估链霉菌活性，采用琼脂孔扩散法(Ashokvardhan et al.,2016；Sharmaet al.,2016) 对12种植物病原菌进行广谱抗真菌活性测定。用打孔器取下新鲜的12种植物病原菌的菌饼 (Φ＝5mm)，接种于PDA平板中央，分别在距病原菌菌饼2.5cm处的四个点处打孔(Φ＝6mm)，将过滤除菌后的代谢产物(溶解在水中配制成20mg/mL的浓度)加入孔中，以加入等量的溶剂为空白对照，每个处理重复3次。于28℃培养5-7d后，采用十字交叉测量法测量供试病原菌的菌落生长直径及抑菌带大小，按照下面的公式计算抑菌率(Albuquerque et al.,2006)：
Inhibition rate(％)＝[(R1-R2)/R1]×100
式中：R1是对照组的病原菌菌落直径，R2是处理组的病原菌菌落直径。
活性物质对12种植物病原真菌的广谱抑菌活性，如图6和表15所示。抑菌率都在70％以上，对辣椒炭疽病菌(ATCC 56815)、芒果炭疽病菌(ATCC 96167)和灰葡萄孢霉病菌(ATCC 11542)的抑菌活性最好，三者无显著性差异，抑菌率分别为90.57％、90.49％和90.07％(P＜0.05)；对Foc TR4病菌的抑菌活性次之，抑菌率为86.17％，而对苹果轮纹病菌(ATCC 208828)的抑菌活性最小，抑菌率为70.29％。
表15活性成分对植物病原真菌的抑菌活性
表中数据为平均数±标准差。同列不同小字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P＜0.05 水平差异显著。
(2)对12种植物病原真菌孢子萌发的抑制作用
采用Tzortzakis et al(2007)的方法测定孢子萌发率。取12种病原真菌孢子悬浮液(106 CFU/mL)0.1mL，加入0.1mL活性成分，充分混匀，取20μL加在凹玻片上，将含有孢子的载玻片于28℃潮湿的培养室内孵育6～8h，无菌水和孢子的混合物作为对照，每个处理重复3 次。待对照孢子萌发率大于90％以上时，在电子显微镜(mag＝200×lens)下观察孢子萌发，孢子芽管长度大于孢子的短半径视为萌发。每个处理计数200个孢子，用血球计数器测定孢子萌发数，并计算孢子萌发率(PSG)(Sharma et al.,2017)：
式中：A为对照组孢子萌发率，B为处理组孢子萌发率。
结果见表16。结果表明，过滤除菌后的活性成分对12种植物病原菌分生孢子的萌发具有显著的抑制作用(P＜0.05)。其中对辣椒炭疽病菌(ATCC 56815)和芒果炭疽病菌(ATCC 96167) 分生孢子萌发抑制率最高，分别为83.11％和83.26％，两者无显著性差异，而对苹果轮纹病菌 (ATCC 208828)分生孢子萌发抑制率最小，为65.15％。
表16对植物病原真菌孢子萌发的影响
表中数据为平均数±标准差。同列不同小字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P＜0.05 水平差异显著。
2.7盆栽实验
盆栽实验于2019年8-10月在中国热带农业科学院热带生物科学与生物技术研究所进行。温室条件为28℃，湿度70％，自然光照。从海南省儋州市采集蕉园健康土壤，20目过筛。选取生长一致、3-4片叶子的香蕉幼苗，无菌水冲洗干净，切下第二条主根，种植于装有1400g 土的塑料盆中，每个处理30株。实验设4个处理组：B(未接种Foc TR4-GFP，施无菌水)； F(接种Foc TR4-GFP，施无菌水)；M(接种Foc TR4-GFP，施无菌FM1培养基)；S(接种Foc TR4-GFP，接种菌株2-11，1.0×107cfu/g土)。每个处理三次重复。
Foc TR4-GFP接种：挑取新鲜培养的Foc TR4-GFP菌丝接种于PDA固体培养基上，28℃培养5d。无菌水洗脱孢子，两层无菌Mira布过滤，收集病原菌孢子悬浮液，血球计数板计数后，无菌水稀释，取100毫升孢子悬浮液接入土壤中，使得土壤中Foc TR4-GFP孢子数量为1.0×105cfu/g土。
S处理组链霉菌接种：新鲜培养的链霉菌种子液按5％接种量，接入FM1液体培养基中， 28℃振荡(150rpm)培养7d，稀释平板涂布法计数后，无菌水稀释，取100毫升链霉菌发酵液接入土壤中，使得土壤中链霉菌数量为1.0×107cfu/g土。
(1)激光共聚焦显微镜观察Foc TR4-GFP侵染过程
参照Li et al.(2013)方法进行香蕉组织激光共聚焦显微镜观察。F处理中：在第1d时，菌丝和孢子粘附在香蕉根的表皮上(图7a)；在7d时，菌丝沿着根维管束向上延伸到香蕉的球茎(图7b)。S处理中，菌株2-11处理后，在第1d时，少许的孢子粘附在香蕉根的表皮上(图7c)；在第7d时，球茎中央柱状组织中无菌丝生长(图7d)，表明菌株2-11的加入， FocTR4收到了抑制，失去继续侵染的能力。
(2)土壤中Foc TR4-GFP定量检测
采用根冲洗获得的土壤溶液进行香蕉枯萎病原菌定量检测。在含有改良Komada选择性培养基平板上，采用根际土壤悬浮液系列稀释法，测定了香蕉根际香蕉枯萎病原菌(Foc TR4) 菌落形成单位数(cfu/g)。菌落形成单位数(cfu/g)＝每平皿菌落平均数×稀释倍数×5/土壤重量(肖马云，2012)。
结果表明，F处理样品中Foc TR4病原菌数量最多，为3.33×104cfu/g，而经过菌株2-11 处理，S样品中病原菌数量明显降低，为2.80×103cfu/g(图8)。说明菌株2-11抑制了土壤中 Foc TR4的生长和繁殖，对香蕉枯萎病有良好防效。
(3)香蕉苗生理指标测定
根据Chen et al.(2018)方法测定了香蕉幼苗移栽42天的生理指标，包括叶绿素含量、鲜重和干重。
①香蕉苗叶绿素含量的测定
通过SPAD-502便携式叶绿素测定仪进行测定，选取香蕉苗顶上第二展开叶，分别测量叶片两侧底部、中部、上部边缘的叶绿素含量。结果如图9所示，与清水处理(B)叶绿素含量相比较，病原菌+清水(F)和病原菌+培养基(M)处理的叶绿素含量明显降低，但两者无显著性差异，叶绿素分别为38.90mg/g和39.17mg/g，这是由于香蕉幼苗受到枯萎病菌的侵染，叶绿素遭到破坏，合成受阻，含量迅速下降。而接种病原菌后用菌株2-11处理的S组，叶绿素含量显著高于清水对照B，叶绿素为58.77mg/g，这是由于链霉菌产生的生物活性物质抑制了病原菌的蔓延，及对叶片叶绿素的伤害，且菌株2-11也具有明显的促生作用，可有效提高叶片叶绿素含量，增强植株的光合作用效率，促进植株的健康生长。
②香蕉苗的鲜重和干重
将香蕉苗用清水洗净，于报纸上晾干，测量香蕉苗的鲜重。将称完鲜重后的香蕉苗置于烘箱中，80℃烘干3d，取出进行称重。
盆栽实验中，用菌株2-11(S组)处理的香蕉植株平均鲜重和干重均显著高于其他组(图10)。S处理的鲜重为74.80g，比对照组B增加31.07％；干重为6.71g，比对照组B增加39.05％。而病原菌处理的F和M处理，鲜重和干重均显著低于对照组B。结果表明，菌株2-11处理后，香蕉幼苗干物质积累量显著增加，且高于正常值(p＜0.5)。因此，菌株2-11对香蕉植株具有促生长作用。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (6)
1.一种链霉菌，其特征在于，其为链霉菌属的一个新种，命名为StreptomycesYongxingensis sp. nov. ，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021303。
2.权利要求1所述的链霉菌的发酵液。
3.如权利要求1所述的链霉菌或者权利要求2所述的发酵液在拮抗香蕉枯萎病菌4号生理小种、和/或香蕉枯萎病菌1号生理小种、和/或辣椒炭疽病菌、和/或香蕉长形斑病菌、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或芒果炭疽病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或胶孢炭疽病菌、和/或小麦赤霉病菌、和/或苹果轮纹病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或灰葡萄孢霉病菌中的应用。
4.如权利要求1所述的链霉菌或者权利要求2所述的发酵液在制备防治香蕉枯萎病菌4号生理小种、和/或香蕉枯萎病菌1号生理小种、和/或辣椒炭疽病菌、和/或香蕉长形斑病菌、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或芒果炭疽病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或胶孢炭疽病菌、和/或小麦赤霉病菌、和/或苹果轮纹病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或灰葡萄孢霉病菌所致病害的生防制剂中的应用。
5.如权利要求1所述的链霉菌或者权利要求2所述的发酵液在促进香蕉生长中的应用。
6.一种生防制剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的链霉菌或者含有权利要求2所述的发酵液。
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