CN109370956A - 慢生型大豆根瘤菌菌株、组合物和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种慢生型大豆根瘤菌菌株、组合物和用途。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:16747；保藏时间为：2018年11月15日。其具有很强的耐干燥能力，且具有良好地与大豆结瘤固氮的能力。

Description

慢生型大豆根瘤菌菌株、组合物和用途

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种慢生型大豆根瘤菌菌株、组合物和用途。

背景技术

豆科植物-根瘤菌是经典的生物固氮模式，其形成的共生体系是自然界生物固氮效率最高的体系，在提高农作物产量、降低化肥使用量、减少水土污染、实现农业可持续发展具有重要的作用^[1]。而盐度、温度、酸碱度、干旱、重金属离子等环境因子是影响根瘤菌-豆科植物共生固氮的侵染过程、根瘤的发育和功能以及导致固氮量少作物产量低下的重要因素^[2]。尤其是干旱这一因素，因其会降低根瘤菌存活率从而制约干旱与半干旱地区的根瘤菌-豆科植物的生物固氮能力^[3-5]。其他众多研究也表明田间无效根瘤产生的主要原因之一是由于干燥引起根瘤菌的快速死亡^[6-7]。不仅如此，干燥亦是制约根瘤菌剂保质期长短和影响我国根瘤菌剂产业化发展的重要因素，产品保质期的长短主要取决于微生物的存活能力即生物活性，而菌剂中微生物活性的损失主要是由于种子包衣与储存过程中由干燥引起的环境压力所导致的菌体死亡^[8-9]。因此，在种子处理与储存过程中维持微生物的存活是关键问题，但目前鲜有能够附着于种子上的应用性能较强、保质期长以及稳定性好的商业化可利用的根瘤菌剂^[10]。并且由于大多数微生物产品储存的条件总是达不到最适的存储条件(比如，高温，光照，潮湿等)农田效果不佳。尤其是对于我国这样一个根瘤菌剂剂型、施肥方式等配套技术落后的国家而言。新一代抗干燥根瘤菌技术的发展显得尤为重要。

因此，筛选耐干燥的优良大豆根瘤菌研究，是解决我国大豆根瘤菌规模化应用的新途径。

发明内容

本发明通过提供新的微生物菌株、培养物、组合物，以及其在大豆种植中的应用以解决前述需求。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种分离的慢生型大豆根瘤菌菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:16747；保藏时间为：2018年11月15日。

该菌株分离自黑龙江哈尔滨市郊大豆根瘤，细胞为革兰氏阴性菌，好氧，不产芽孢，短杆状0.25-0.55×0.8-2.2μm(长×宽)。在YMA平板上于30℃倒置培养4-5d后形成的菌落大小为1-2mm(直径，d)，圆形，表面光滑，隆起形状似珍珠，边缘整齐，半透明且粘稠，淡乳白色，相较于其他慢生根瘤菌菌落易于挑起，可大量同时挑起，呈现果冻块状。且随培养时间的增加菌落大小能至4-5mm。同时在添加刚果红的YMA培养基上生长后菌落为淡粉色。该菌株易于与甘油吹打混匀，但经YMB液体培养基培养后进行菌体收集，即使离心速度在10000r/min，也不容易将菌体与多糖物质分离，通常会加入相应体积的生理盐水(0.85％(w/v))进行更好的离心，或者经TY液体培养基培养后便于离心收集大量菌体。相较于其他菌株，较难用无菌水进行离心收集菌体。

根据本发明的另一方面，本发明还涉及一种组合物，其含有如上所述的慢生型大豆根瘤菌菌株的培养物。

根据本发明的另一方面，本发明还涉及如上所述的组合物在大豆种植中的应用。

该菌株具有很强的耐干燥能力，且具有良好地与大豆结瘤固氮的能力。

本申请提供的慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)，菌株名为5038，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号CGMCC No:16747；经保藏中心于2018年11月15日检测为存活菌株并保藏。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中耐干燥能力强(左)与弱(右)的根瘤菌荧光显微镜(1000×)下细胞死活照片；

图2为本发明一个实施例中菌株5038干燥24h后的活细胞平板计数图，USDA110干燥24h后的活细胞平板计数图；

图3为本发明一个实施例中接菌与不接菌的大豆在蛭石盆栽中生长2周的情况；

图4为接菌(右)与不接菌(左)的大豆在蛭石盆栽中生长2周后的结瘤情况；

图5为本发明一个实施例中接菌与不接菌的大豆在蛭石盆栽中生长2周的情况；

图6为NJ法构建的基于16SrRNA基因序列的系统发育树。

具体实施方式

本发明涉及一种分离的慢生型大豆根瘤菌菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:16747；保藏时间为：2018年11月15日。

该菌株具有很强的耐干燥能力，其耐干燥能力的衡量指标如实施例中表1和表2所描述，在给定条件下，在经过玻璃珠真空干燥处理24h，仍然具有约40％的存活率。

本发明请求保护上述保藏编号的慢生型大豆根瘤菌菌株，以及在适度范围内发生突变，且仍然具有很强的解淀粉能力的突变菌株。

所谓“慢生型大豆根瘤菌菌株的突变菌株”，是指基因组高度类似5038菌株的基因组的慢生型大豆根瘤菌菌株。在本申请中，表述“本发明的慢生型大豆根瘤菌菌株”涵盖了所述突变株。突变菌株可通过与SEQ ID NO：1所示的5038菌株16S rRNA同源性≥99％(例如99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的同源性)的方式进行限定，也可以通过基因组方面高度类似涵盖：

一种慢生型大豆根瘤菌菌株的基因组同5038菌株的基因组相比，包含至多150个突变事件，优选包含至多140个、130个、120个、110个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、30个或20个突变事件。突变事件被限定为SNP(单核苷酸多态性)或INDEL(插入、缺失，及两者的组合)。按如下方式确定突变事件的数量：将5038菌株的基因组视为对照，鉴定存在于突变株基因组中的突变事件，每种突变事件(SNP或INDEL)代表一个突变事件(即，例如，插入含若干个核苷酸的序列只视作一个突变事件)。在该语境中，本发明的突变株的基因组序列由同5038菌株相比所含突变事件的数量限定，除这种限定方式外，还可额外由其与5038菌株的基因组序列的同一性百分比限定，其中同一性百分比在本文表示在一种菌株的基因组中发现存在于另一种菌株的基因组中的序列的百分比，具体地讲：a)在5038菌株的基因组中发现并存在于突变菌株的基因组中的序列的百分比，或b)在突变菌株的基因组序列中发现并存在于5038菌株的基因组中的序列的百分比。因此，与5038菌株的不同之处只有插入(一个或多个)或只有缺失(一个或多个)的突变菌株，具有的基因组与5038菌株的基因组的同一性百分比为100％，因为在一种菌株的基因组中完全发现了另一种菌株的整个基因组序列。在一个具体实施例中，由突变事件数量限定的本发明的突变株的基因组序列，与5038菌株的基因组序列的同一性百分比为至少90％、为至少91％、为至少92％、为至少93％、为至少94％、为至少95％、为至少96％、为至少97％、为至少98％、为至少99％、为至少99.1％、为至少99.2％、为至少99.3％、为至少99.4％、为至少99.5％、为至少99.6％、为至少99.7％、为至少99.8％、为至少99.9％、为至少99.92％、为至少99.94％、为至少99.96％、为至少99.98％或为至少99.99％，其中同一性百分比表示在一种菌株的基因组中发现并存在于另一种菌株的基因组中的序列的百分比；同一性是按照将两种基因组序列在它们的全长范围内相比较(全局比对)的方式作出描述的，并且可使用基于Needleman-Wunsch算法的任一种程序来计算。

5038菌株的基因组可通过本领域惯用的技术手段测得。

在实际应用的过程中，考虑到其可能需要运输等原因，有必要将慢生型大豆根瘤菌菌株扩大培养制成组合物(特别是微生物菌剂)的形式以扩大其应用范围。

本发明的组合物(优选地，在用作发酵剂培养物时)可为纯培养物或混合培养物。所以，本发明将纯培养物限定为这样一种培养物，其中全部或基本上全部培养物由本发明的同一种慢生型大豆根瘤菌菌株组成。在替代形式中，将混合培养物限定为这样一种培养物，其包含若干种微生物，具体地讲包含若干种细菌菌株，包括本发明的慢生型大豆根瘤菌菌株。

所述组合物用于农业，可制成液体、冷冻或干燥粉末形式；或以本行业常用的制剂形式来表述，如颗粒剂、悬浮剂、可湿性粉剂、乳液或液剂。

任何载体都可使用，不论它们是固体或液体，只要它们是农业上和园艺上的农药常用的和生物学上惰性的即可。不限于任何特定的载体。

在一些具体的实施方式中，当所述组合物为冷冻或干燥粉末形式时，其包括固态载体；

固体载体的例子包括矿石粉诸如陶土、滑石、膨润土、沸石、碳酸钙、硅藻土和白炭(White carbon)；植物面粉如玉米面和淀粉；和高分子化合物如聚乙烯醇的聚亚烷基二醇。另一方面，典型的液体载体包括各种有机溶剂如癸烷和十二烷，植物油，矿物油和水。

在一些实施方式中，所述固态载体包括泥炭、草皮、滑石、褐煤、叶蜡石、蒙脱土、藻酸盐、压滤泥浆、锯屑、珍珠岩、云母、硅石、石英粉、钙基膨润土、蛭石、高岭土、轻质碳酸钙、硅藻土、麦饭石、方解石、沸石、白炭黑、细沙以及粘土中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述组合物中包含助剂；

通常在农业和园艺用化学品中用作助剂的表面活性剂、粘合剂、稳定剂等等可以单独使用或需要时组合使用，作为稳定剂可以使用例如抗氧化剂和/或pH调节剂。在某些情况下中也可以使用光稳定剂。

这些助剂的总含量可以是0wt％至80wt％，载体的含量是从100wt％减去有效成分和助剂含量后的值。

在一些具体的实施方式中，所述助剂包括十二烷基苯磺酸钠、丁基萘磺酸钠、海藻糖、甘油、木质素磺酸钠、烷基萘磺酸钠缩聚物、烟酸、醇、缓冲盐、氯化钠、氨基酸、维生素类、蛋白质、多肽、多糖或单糖、酵母膏、白炭黑、茶皂素、脱脂奶中的一种或多种。

在一些具体的实施方式中，所述组合物还包含农业有效量的选自以下的化合物或组合物：营养素、肥料、杀螨剂、杀细菌剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀微生物剂、杀线虫剂以及杀虫剂。

上述成分可与本申请所提供的菌株配合以实现更佳的技术效果。

在一些实施方式中，在所述组合物中，所述的慢生型大豆根瘤菌菌株的活菌数量为10^7～12cfu·mL^-1或10^7～12cfu·g^-1。

也可以选择10⁸cfu·mL^-1、10⁹cfu·mL^-1、10¹⁰cfu·mL^-1、10¹¹cfu·mL^-1。或10⁸cfu·g^-1、10⁹cfu·g^-1、10¹⁰cfu·mL^-1、10¹¹cfu·mL^-1

根据本发明的另一方面，本发明还涉及如上所述的组合物在大豆种植中的应用。

在一些实施方式中，使用所述组合物对大豆种子进行慢生型大豆根瘤菌接种处理，接种处理方法选自包衣、拌种和浸种。

在一些实施方式中，所述大豆种植于干旱环境中进行。

根据本发明的另一方面，本发明还涉及一种植物种子，其具有包含如上所述组合物的包衣；或者被所述组合物拌种和/或浸种处理。

在本申请中，“干旱”或“干燥”定义为一段干燥的时期，特别是当其延长时，能损害农作物或妨碍它们顺利生长。此外，相同种的不同植物，以及那些相同种的不同品系，对干旱、干燥和/或缺水可具有不同的耐受性。在实验室中，干旱可通过较对照植物给予植物95％或更少的水分来模拟，并寻找在活力、生长、大小、根长和种种其他生理和物理量度上的差异。干旱也可通过在田地中给某些植物浇水，而不其他植物浇水来模拟，并比较它们的生长速率，特别是水分严重受限地方植物的生长。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1.耐干燥根瘤菌的初步筛选

本研究以分离自全国26省(市)不同地域的主栽品种共生固氮根瘤的2000株菌株为菌株资源库，依据菌株的耐旱能力与其生态环境间存在必然的联系，本研究最终选取其中分离自西北地区、华北地区、东北地区、华中地区、华东地区、西南地区、华南地区的260株根瘤菌为研究材料，对其抗干燥能力进行了初步评估。基于玻璃珠真空干燥法结合的细胞膜的荧光染色法(LIVE/DEAD Bacterial Viability Kit)进行细菌活性测定，初步筛选抗干燥菌株。

主要方法为在显微镜放大1000倍的情况下随机选择20个视野下荧光微孔滤膜上大小为100um×100um区域进行快速的30秒内的细菌数目的计数^[11]，否则时间过长，荧光淬灭会造成计数误差。

染料配制成工作浓度，-20℃存放备用。Live/Dead BacLight BacterialViability Kit荧光染料由SYTO 9染料与Propidium iodide(碘化丙啶)组成。SYTO 9染料能透过完整的细胞膜与结构受损的细胞膜，并把细胞膜染成绿色，而碘化丙啶只能渗透受损的死细菌细胞膜，当两染料结合在一起的时候将呈红色荧光^[12]，由此可对死活细菌分别计数。以下是细菌样本的荧光染色以及样本观察的方法和步骤。

将LIVE/DEAD Bacterial Viability Kit试剂盒中的试剂A(SYTO 9)与试剂B(Propidium iodide)两种染料等体积充分混匀。

移液枪吸取3uL混合染料于1mL菌液中并反复吹打充分混匀，室温避光染色15min。

吸取5uL荧光染色后的菌悬液于荧光微孔滤膜

吸取10uL染色完毕的菌液，滴在微孔滤膜圆心上，待菌液刚好被滤膜吸干时，在其上盖上盖玻片，并用手用力压片，除尽空气夹层。最后在盖玻片上滴一滴无自发荧光的油，用Leica,DM2000荧光显微镜于暗室中观察并计数。

结果：利用该方法可快速从260株大豆根瘤菌中筛选出耐干燥能力强与耐干燥能力弱的菌株(如图1)。最终本实验依据经干燥后存活率高的菌株作为目标菌株，筛选出9株优势菌株，编号分别为：5038,5841,5821,5136c,5119,5009,4788,4453,4253。

2.耐干燥能力强的优势根瘤菌的复筛

基于以上利用真空干燥法结合的细胞膜的荧光染色法(LIVE/DEAD BacterialViability Kit)从260株根瘤菌中初步筛选获得9株耐干燥能力较强的菌株，为了进一步确定初筛菌株耐干燥能力的特性，本实验进一步通过玻璃珠真空干燥法结合平板菌落计数法对初步筛选的9株优势根瘤菌与一株广泛应该用于根瘤菌剂的B.japonicum USDA110为参比菌株进行了耐干燥能力的比较。

以下是耐干燥能力强的优势根瘤菌的复筛方法：

1.挑取单菌落于装有100mL液体YMB培养基的250mL锥形瓶，置于摇床震荡150r/min，30℃培养4d。

2.取25mL菌液于50mL的离心管中，并加入5mL 0.85％NaCl，10000×g离心15min.

3.倒去上清，加入适量的无菌水将菌体浓度调制OD600＝0.5，取2mL菌液于装有15粒玻璃珠的10mL离心管中，并使玻璃珠充分浸入菌液。

4.将装在10mL离心管的玻璃珠连同菌液倒入无菌培养皿中置于无菌超净台下进行短时干燥，随后进行4h，8h，24h干燥。

5.向装有干燥后的玻璃珠的10mL离心管中加入3mL无菌水，于摇床150r/min,10min震荡。

6.取100ul菌液涂布，并进行平板计数与结果观察。

结果：经玻璃珠真空干燥后各菌株的存活细胞的数量差异明显(表1)。与B.japonicum USDA110比较的这几株大豆根瘤菌中，尤其是与菌株5038相比较(图2)，两者数目相差近乎10倍之多。数据结果表明菌株5038(SYH)的耐干燥能力最强，即使干燥24h后，每粒玻璃珠上细胞存活细胞数仍能达6.8×10⁶CFU/粒，且存活率仍能达40％(表2)。菌株4453与4253干燥能力次之。而参比菌株USDA110经24h干燥后，每粒玻璃珠上存活的细胞数量仅为5.6×10⁴CFU/粒，且存活率几乎为0％。该数据充分表明菌株5038是一株潜在具有商业化应用前景的可用于种子包衣的优良根瘤菌。

表1不同干燥时间处理后各菌株于玻璃珠上存活的活细胞数量

表2不同干燥时间处理后各菌株的存活率

3.优势根瘤菌5038与大豆回接验证试验

3.1回接菌株菌悬液的制备

挑取单菌落接种于装有100mL液体YMB培养基的250mL锥形瓶，180r/min，30℃，振荡培养4d至对数期生长后期。8000r/min，离心10min，倒去上清收集菌体，并用无菌水调制OD₆₀₀＝0.9左右，菌体浓度为10⁹cfu·m L^-1待用。

3.2种子催芽

挑选颗粒大小较为一致的大豆种子(中黄13)，首先用清水冲洗大豆表皮，放入95％的酒精中浸泡1min，再转至5％次氯酸纳溶液浸泡5min进行表面灭菌，然后用无菌水冲洗至少10次。表面消毒后的大豆种子至于1％水琼脂上，30℃培养2-3d。

3.3蛭石盆栽

将灭过菌的蛭石(121℃灭菌3h)装在灭过菌的塑料花盆中(15cm×10cm)，种芽前将每一盆蛭石浇透。然后将萌发的豆芽种到刨开一定深度(2-3cm)的蛭石里，每盆种植3株。用移液枪将根瘤菌菌悬液接种到大豆上，每棵1ml，最后用蛭石将种子盖上。每一个菌株处理设置3个重复，同时设置未接种根瘤菌的空白对照，并随机排列。然后置于温室中培养，保证每天光照8-13h，温度维持在20～30℃。种植2周左右后观察该菌株结瘤情况。

3.4菌株的分离纯化以及初步鉴定

将根瘤用水冲洗干净，再用剪刀将其从根部分离。根瘤消毒后，转至无菌平皿中划线分离，直至单菌落。利用细菌基因组提取试剂盒(BacterialDNA Kit)提取该菌株的基因组DNA，以细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)与1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增其16S rRNA基因。PCR反应体系(25μL)：基因组模板2.0μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5μL，ddH₂O 9.5μL。PCR扩增条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃40s，30个循环；72℃5min。将PCR产物送生工生物工程股份有限公司进行测序。将获得的16S rRNA基因序列于NCBI数据库中进行相似度比对，最终通过软件MEGA 6.0与ClustalW 1.8进行多重序列比对分析并利用Neighbor-Joining法进行系统发育树的构建。

结果：经2周左右大豆生长情况如图3，由于蛭石对植物只是起到一种支持物的作用，实验中也仅仅通过加入适量的无氮营养液，没有给植物提供氮素营养，全靠根瘤固氮提供。接种根瘤菌的植株与不接种根瘤菌的植株相比，植株较矮小，叶片稍偏黄，根系并无结瘤现象，由图4看出空白处理并没有结瘤，接种菌株5038的处理有大量的根瘤，说明菌株5038具有良好地与中黄13结瘤固氮的能力。

细菌通用引物27F/1492R扩增结果表明，菌株5038的16S rRNA基因片段的大小约为1500bp(图5)，经NCBI相似菌株比对结果表明，该菌株与各隶属于Bradyrhizobium.japonicum的菌株的相似度均在99％以上，且近缘关系稳定，表明该菌株也为Bradyrhizobium.japonicum(图6)。

实施例2

5038菌株与其他大豆根瘤菌株的田间实验数据情况

一、试验点1：长春市农业科学院，实验面积560m²。

用不同的大豆根瘤菌株(5038菌株和5841菌株)对豆种子进行拌种，拌种后的大豆种子按正常方式播种，收获期时，对不同处理的大豆进行株高、单株荚数、单株粒数、单株粒重和百粒重指标的测算，结果(见表3)表明，大豆根瘤菌株5038明显优于对照和大豆根瘤菌株5841。

表3大豆收获期接种根瘤菌的效果

二、试验点2：赤峰市农牧科学研究院梁上试验地，沙壤土

使用材料：B.japonicum 5038，4453，4253，5119

大豆根瘤菌株通过标准的大豆根瘤菌拌种方法接种大豆种子，收获后对大豆产量进行测产，测定结果(表4)表明，菌株5038明显优于其他的大豆根瘤菌株和没有接种的对照。

表4接种不同大豆根瘤菌株的大豆产量

接种根瘤菌株	大豆产量(公斤/亩)
		5038	174
4453	161
		4253	156
5119	149
		对照	141

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

参考文献

[1]张武,杨琳,王紫娟.生物固氮的研究进展及发展趋势[J].云南农业大学学报(自然科学),2015,(5):810-821.

[2]Lebrazi S,Benbrahim F K.Environmental stress conditions affectingthe N2fixing Rhizobiumlegume symbiosis and adaptation mechanisms[J].2014.

[3]Mary P,Ochin D,Tailliez R.Rates of Drying and Survival ofRhizobium meliloti Strains During Storage at Different Relative Humidities.[J].Applied&Environmental Microbiology,1985,50(2):207-11.

[4]E.J.Hartley,L.G.Gemell,R.Deaker.Some factors that contribute topoor survival of rhizobia on preinoculated legume seed[J].Crop&PastureScience,2012,63(8-9):858-865.

[5]Deaker R,Roughley R J,Kennedy I R.Legume seed inoculationtechnology—a review[J].Soil Biology&Biochemistry,2004,36(8):1275-1288.

[6]Vriezen J A,de Bruijn F J,Nüsslein K.Responses of Rhizobia toDesiccation in Relation to Osmotic Stress,Oxygen,and Temperature[J].Applied&Environmental Microbiology,25038,73(11):3451-3459.

[7]Gemell L G,Hartley E J,Herridge D F.Point-of-sale evaluation ofpreinoculated and custom-inoculated pasture legume seed[J].Australian Journalof Experimental Agriculture,2005,45(3):161-169.

[8]Juge C,Prévost D,Bertrand A,et al.Growth and biochemical responsesof soybean to double and triple microbial associations with Bradyrhizobium,Azospirillum and arbuscular mycorrhizae[J].Applied Soil Ecology,2012,61(5):147-157.

[9]Atieno,M.Proteomic Changes in Rhizobia after Growth in PeatExtract and Their Potential Role in Desiccation Tolerance[D].2017,Universityof Sydney.

[10]Jeon J M,Lee H I,Sadowsky M J,et al.Characterization of aFunctional Role of the Bradyrhizobium japonicum Isocitrate Lyase inDesiccation Tolerance[J].International Journal of Molecular Sciences,2015,16(7):16695-16709.

[11]Wei Hu,Kotaro Murata,Daizhou Zhang.Applicability of LIVE/DEADBacLight stain with glutaraldehyde fixation for the measurement of bacterialabundance and viability in rainwater[J].J Journal of environmental sciences,2017,202-213.

[12]John Wiley,Sons,Inc.LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability KitsProduct Information[EB/OL].[2004-07-15].http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp075038.pdf.

SEQUENCE LISTING

<110> 康生元（肇庆）生物科技有限公司

<120> 慢生型大豆根瘤菌菌株、组合物和用途

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1371

<212> DNA

<213> Bradyrhizobium.japonicum

<400> 1

acggtggccg gctgcctccc ttgcgggtta gcgcaccgtc ttcaggtaaa accaactccc 60

atggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgtggc gtgctgatcc 120

acgattacta gcgattccaa cttcatgggc tcgagttgca gagcccaatc cgaactgaga 180

cggctttttg agatttgcga agggtcgccc cttagcatcc cattgtcacc gccattgtag 240

cacgtgtgta gcccagcccg taagggccat gaggacttga cgtcatcccc accttcctcg 300

cggcttatca ccggcagtct ccttagagtg ctcaactaaa tggtagcaac taaggacggg 360

ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacagccatg 420

cagcacctgt gctccaggct ccgaagagaa ggtcacatct ctgcgaccgg tcctggacat 480

gtcaagggct ggtaaggttc tgcgcgttgc gtcgaattaa accacatgct ccaccgcttg 540

tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttt aatcttgcga ccgtactccc caggcggaat 600

gcttaaagcg ttagctgcgc cactagtgag taaacccact aacggctggc attcatcgtt 660

tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc gtgcctcagc 720

gtcagtatcg ggccagtgag ccgccttcgc cactggtgtt cttgcgaata tctacgaatt 780

tcacctctac actcgcagtt ccactcacct ctcccgaact caagatcctc agtatcaaag 840

gcagttctgg agttgagctc caggatttca cccctgactt aaagacccgc ctacgcaccc 900

tttacgccca gtgattccga gcaacgctag cccccttcgt attaccgcgg ctgctggcac 960

gaagttagcc ggggcttatt cttgcggtac cgtcattatc ttcccgcaca aaagagcttt 1020

acaaccctag ggccttcatc actcacgcgg catggctgga tcagggttgc ccccattgtc 1080

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gtattagcac aagtttccct gtgatgttcc gaaccaaaag ctgcgttgcc acgagtagcc 1320

agccgtgagg taatgctgaa caatgcgacc actcagaagc gcgacggata a 1371

Claims (10)

1.分离的慢生型大豆根瘤菌菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:16747；保藏时间为：2018年11月15日。

2.组合物，其含有权利要求1所述的慢生型大豆根瘤菌菌株。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物为液体、冷冻或干燥粉末形式。

4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物中包含助剂；

优选的，所述助剂包括十二烷基苯磺酸钠、丁基萘磺酸钠、海藻糖、甘油、木质素磺酸钠、烷基萘磺酸钠缩聚物、烟酸、醇、缓冲盐、氯化钠、氨基酸、维生素类、蛋白质、多肽、多糖或单糖、酵母膏、白炭黑、茶皂素、脱脂奶中的一种或多种。

5.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，当所述组合物为冷冻或干燥粉末形式时，其还包括固态载体；

优选的，所述固态载体包括泥炭、草皮、滑石、褐煤、叶蜡石、蒙脱土、藻酸盐、压滤泥浆、锯屑、珍珠岩、云母、硅石、石英粉、钙基膨润土、蛭石、高岭土、轻质碳酸钙、硅藻土、麦饭石、方解石、沸石、白炭黑、细沙以及粘土中的一种或多种。

6.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，其还包含农业有效量的选自以下的化合物或组合物：营养素、肥料、杀螨剂、杀细菌剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀微生物剂、杀线虫剂以及杀虫剂。

7.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，在所述组合物中，所述慢生型大豆根瘤菌菌株的活菌数量为10^7～12cfu·mL^-1或10^7～12cfu·g^-1。

8.权利要求3～7任一项所述的组合物在大豆种植中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，使用所述组合物对大豆种子进行慢生型大豆根瘤菌接种处理，接种处理方法选自包衣、拌种和浸种。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述大豆种植于干旱环境中进行。