CN111705016B - 一种生物菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及一种生物菌剂及其制备方法和应用。本发明提供了一种生物菌剂，包括韩国假单胞菌CLP‑23；所述韩国假单胞菌CLP‑23的生物保藏号为CGMCC No.13203。本发明提供的菌株能够抑制烟草青枯病菌，并能提高酸性土壤条件下烟草青枯病的防治效果，具有生物修复土壤的功效，还能够促进茄科作物生长。

Description

一种生物菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及一种生物菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

人口数量的逐渐增加和农业的急速发展，导致人均耕地面积更加紧张，我国农业生产普遍存在着作物栽培年限增加、连作栽培面积扩大的现象，造成各种再植障碍已成为生产上亟待解决的突出问题。缓解连作障碍通常是采取抗病品种选育和轮作栽培制度来实现，但这些方法存在着一些制约和不足，连作年限的增加仍然会导致抗病品种的大幅度减产；若下茬作物选择不合适，轮作栽培会带来二次损害、重茬甚至加重土传病害的发生。其中，青枯病和黑胫病是茄科作物重要的土传根茎病害，发生普遍且危害重，连作田病害的发生更加严重，严重影响茄科作物的产量和质量。目前我国都面临着由于连作导致的植烟土壤酸化问题，而土壤酸化导致茄科青枯病等土传病害发生重的问题，已影响到当地作物的可持续发展。

目前，已有许多防治青枯病和黑胫病的方法，其中包括：抗病品种利用、农业栽培措施、化学防治和生物防治等方法。培育抗病品种周期长，且目前生产上的主栽品种大多不抗病；农业栽培措施主要包括轮作和调整植烟土壤酸碱度，又因有限的耕地资源和操作不便而不易实施；过多或不合理使用化学药剂对环境、天敌和食品安全均带来负面影响，且诱导病原菌产生抗药性，不适于青枯病的绿色防控。基于拮抗微生物和病原物互作的生物防治被认为是减少化学农药使用和改善植物健康的可替代或补充的方式，其中利用有益微生物进行病害防治是较有前景的方法。目前，应用于生物修复酸性土壤且对烟草青枯病和黑胫病具有防治作用的耐酸性生防菌株少有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够修复酸性土壤且对茄科青枯病和黑胫病具有防治作用的耐酸性生物菌剂，本发明提供的生物菌剂能够修复酸性土壤，且对烟草青枯病和黑胫病具有防治作用，还能够促进茄科作物生长。

为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案；

本发明提供了一种生物菌剂，包括韩国假单胞菌CLP-23；所述韩国假单胞菌CLP-23的生物保藏号为CGMCC No.13203。

优选的，所述生物菌剂的有效活菌浓度为1×10¹⁰～5×10¹²cfu/ml。

本发明提供了上述技术方案所述生物菌剂的制备方法，包括将韩国假单胞菌CLP-23接种于液态培养基进行液态黑暗培养，得到发酵液；将所述发酵液冷冻干燥制成干粉，得到生物菌剂。

优选的，所述液态培养基包括营养肉汤液态培养基。

优选的，所述液态黑暗培养为黑暗震荡培养。

优选的，所述黑暗震荡培养的条件包括：温度为26～30℃，转速为 120～150rpm，时间为60～84h。

本发明提供了上述技术方案所述的韩国假单胞菌CLP-23或所述生物菌剂在防治茄科作物青枯病和/或黑胫病中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的韩国假单胞菌CLP-23或所述生物菌剂在促进茄科作物生长中的应用。

优选的，所述生物菌剂的使用量为0.1～0.5kg/亩。

优选的，所述应用包括：

当所述茄科作物处于苗床期时，所述生物菌剂的使用量为0.1～0.3kg/亩，将所述生物菌剂稀释500～600倍，喷施于育苗基质；

当所述茄科作物处于移栽期或团棵期时，所述生物菌剂的使用量为 0.3～0.5kg/亩，将所述生物菌剂稀释200～400倍灌根，间隔10天施用1次，连续施用2～3次；

当所述茄科作物处于发病前或发病初期时，所述生物菌剂的使用量为 0.4～0.5kg/亩，将所述生物菌剂稀释500～600倍灌根，间隔7天施用1次，连续灌根2～3次。

本发明提供了一种生物菌剂，包括韩国假单胞菌CLP-23；所述韩国假单胞菌CLP-23的生物保藏号为CGMCC No.13203。施用本发明提供的生物菌剂，可以调节土壤微生物菌群结构，提高土壤碱性磷酸酶、土壤过氧化氢酶和土壤脲酶的活性，提高土壤中速效钾、铵态氮、硝态氮的含量，进而改善土壤理化性质，提高土壤肥力；该菌株还能够在酸性条件下分泌更多的 IAA，从而促进烟草更好的生长发育；CLP-23菌株分泌的代谢物质2,4-DAPG 能够对烟草青枯病和黑胫病产生拮抗作用，进而防治土传根茎病害。本发明提供的菌株不仅能够修复酸性土壤，对烟草青枯病和黑胫病具有防治作用，还能够促进茄科作物生长。

生物保藏说明

韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)CLP-23菌株，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间为2016年10月27日，保藏编号为CGMCC No.13203。

附图说明

图1为基于16S rDNA(A)和gyrB(B)基因核苷酸序列构建CLP-23菌株系统发育树；

图2为不同pH条件CLP-23发酵液和无菌上清对R.solanacearum的拮抗活性；A为pH5.0，B为pH 5.5，C为pH 6.0，D为pH 6.5，E为pH 7.0， F为pH 7.5，G为pH 8.0；

图3为透射电镜观察CLP-23无菌上清液对R.solanacearum菌体的破坏， A为对照(40000×)，B为CLP-23无菌上清液处理24h，C为CLP-23无菌上清液处理48h；

图4为酸性与中性土壤条件CLP-23对烟草青枯病的防治效果；

图5为磷标准曲线；

图6为IAA标准曲线，A和B分别表示PC和S2标准曲线；

图7为标准品抗生素2,4-DAPG对R.solanacearum拮抗活性；

图8为CLP-23菌株对三种土壤酶活性的影响；

图9为CLP-23菌株对土壤肥力的影响；

图10为CLP-23-GFP标记菌株与CLP-23野生菌株的生长曲线；

图11为CLP-23-GFP在烟草根际的定殖；A-1和A-2为接种1d后 CLP-23-GFP定殖于根际形成保护膜；B-1和B-2为接种4d后CLP-23-GFP 定殖情况；C-1和C-2接种10d后CLP-23-GFP定殖于根尖细胞间隙。

具体实施方式

本发明提供了一种生物菌剂，包括韩国假单胞菌CLP-23；所述韩国假单胞菌CLP-23的生物保藏号为CGMCC No.13203。

本发明于2018年7月在湖南省张家界市慈利县高峰乡双河村(29°29′N， 110°40′E)、江垭镇细毛坪村(29°24′N，110°47′E)和三官寺镇吴王坡村 (29°24′N，110°42′E)酸性植烟土壤烟田中采集根际土壤样品，所述采集方法为五点采集法，每块田采集健株的根际土壤10份，每份样品100g，混匀保存于-20℃。通过嗜酸性PGPR菌株筛选，并将抑菌效果好的1株嗜酸拮抗细菌进行纯化，得到一株抑菌效果好嗜酸拮抗细菌(编号为CLP-23)。

本发明按照EasyPureBacteria Genomic DNAKit试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)操作步骤提取CLP-23菌株的基因组DNA，采用16S rDNA 通用引物27F/1492R进行PCR扩增，PCR反应条件：94℃，5min；94℃， 1min；56℃，1min；72℃，90s；35次循环。PCR扩增产物交由北京擎科生物技术有限公司测序，将16S rDNA基因序列在NCBI数据库进行同源性BLAST，并通过MEGA 5.1软件进行序列分析和系统发育树构建。CLP-23 菌株16S rDNA和gyrB基因序列长度分别为1408bp和809bp，在GenBank 中分别进行BLAST同源性比对，基于16S rDNA和gyrB基因基因序列构建系统发育树，结果如图1所示，CLP-23菌株与韩国假单胞菌P.koreensis (KT382238.1和FN554206.1)同源性为99.0％，CLP-23菌株鉴定为韩国假单胞菌。

在本发明中，所述生物菌剂的有效活菌浓度优选为1×10¹⁰～5×10¹²cfu/ml。更优选为1×10¹¹cfu/ml。

本发明提供了一种生物菌剂的制备方法，将所述韩国假单胞菌CLP-23 接种于液态培养基进行液态黑暗培养，得到发酵液；将所述发酵液冷冻干燥制成干粉，得到生物菌剂。

本发明将所述韩国假单胞菌CLP-23接种到液态培养基进行黑暗培养，得到生物菌剂。在本发明中，所述接种前优选包括韩国假单胞菌CLP-23活化处理，所述活化优选包括将韩国假单胞菌CLP-23划线接种于营养琼脂培养基上活化培养，得到韩国假单胞菌CLP-23单菌落；所述韩国假单胞菌 CLP-23优选为冻存于30％甘油中的韩国假单胞菌CLP-23菌株；所述活化培养优选为黑暗培养，所述活化培养的条件优选为：温度优选为28℃、时间优选为24～48h。所述液态黑暗培养优选包括以下步骤：挑取所述韩国假单胞菌CLP-23单菌落接种于液态培养基进行第一次液态培养，得到种子液；将种子液与液态培养基混合，进行第二次液态培养，得到生物菌剂；所述第一次液态培养的时间为12h；所述种子液的浓度优选为1×10⁶～1×10⁸cfu/ml，更优选为1×10⁷cfu/ml。所述种子液与液态培养基的体积比优选为1：1000。所述液态培养基优选包括营养肉汤液态培养基；所述营养肉汤液态培养基优选包括以下质量份的组分：8～12份蛋白胨、2～5份牛肉浸膏、2～5份氯化钠、 0.3～0.8份硫酸镁、0.2～0.8盐酸和800～1200份水；pH 5.5～5.9。

在本发明中，所述液态黑暗培养优选为黑暗震荡培养；所述黑暗震荡培养的条件优选包括：温度优选为26～30℃，更优选为28℃；转速优选为 100～150rpm，更优选为120rpm；时间优选为60～84h；更优选为72h。所述冷冻干燥优选包括第一次冷冻干燥和第二次冷冻干燥；所述第一次冷冻干燥的条件优选为：温度为-20℃，时间为24h；第二次冷冻干燥的条件优选为：温度为-45℃，时间为8h，气压<1Pa；所述冷冻干燥的保护剂优选为5％蔗糖和5％脱脂奶粉。

本发明提供了上述技术方案所述生物菌剂在防治茄科作物青枯病和/或黑胫病中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述生物菌剂在促进茄科作物生长中的应用。

在本发明中，所述生物菌剂的使用量优选为0.1～05L/亩，更优选为0.4L /亩。

在本发明中，所述应用优选包括：

当所述茄科作物处于苗床期时，所述生物菌剂的使用量为0.1～0.3kg/亩，将所述生物菌剂稀释500～600倍，喷施于育苗基质；

当所述茄科作物处于移栽期或团棵期时，所述生物菌剂的使用量为 0.3～0.5kg/亩，将所述生物菌剂稀释200～400倍灌根，间隔10天施用1次，连续施用2～3次；

当所述茄科作物处于发病前或发病初期时，所述生物菌剂的使用量为0.4～0.5kg/亩，将所述生物菌剂稀释500～600倍灌根，间隔7天施用1次，连续灌根2～3次。

下面结合实施例对本发明提供的一种生物菌剂及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

不同酸碱度条件下CLP-23抑菌活性

不同酸碱度NB培养基制备如下：用pH 4.0及8.0的酸碱缓冲液滴定 NB至pH 5.0、pH 5.5、pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5和pH8.0，121℃灭菌20min，备用。

菌株CLP-23对R.solanacearum的拮抗活性采用琼脂打孔法。将CLP-23 菌株接种于上述pH条件的NB中，28℃、150r/min振荡培养24h后的菌液用于抑菌活性测定，菌液经低温条件下5000r/min离心5min后，上清液经细菌过滤器(孔径为0.22μm)获得无菌滤液，以NB培养液为空白CK，在 NA平板上进行对峙实验，每个处理3次重复，28℃恒温培养48h，十字交叉法测量抑菌带宽度。

不同pH培养条件耐酸性拮抗细菌CLP-23对青枯菌的抑菌活性测定结果如表1和图2所示，图2中A为pH 5.0，B为pH 5.5，C为pH 6.0，D为 pH 6.5，E为pH 7.0，F为pH 7.5，G为pH8.0。在酸性pH5.0至偏碱性pH8.0 条件下，CLP-23对R.solanacearum均具有不同程度的抑制活性，在NA平板上表现不同宽窄的透明抑菌圈。对峙培养48h后，在pH5.5条件下，CLP-23发酵液和无菌滤液对R.solanacearum的抑菌带宽度最大，分别为8.5mm和 5.5mm，随着pH升高，CLP-23菌株的抑菌活性呈降低趋势，当pH升至8.0 碱性条件时，其发酵液和无菌滤液对R.solanacearum的抑菌带宽仅为4.8mm 和4.3mm，处理间差异显著。上述结果说明，酸性条件下CLP-23对青枯菌的拮抗活性强。

表1 不同pH培养条件耐酸性拮抗细菌CLP-23对青枯菌的抑菌活性差异

备注:不同字母表示显著性差异(p＜0.05),下同。

实施例2

CLP-23对R.solanacearum的破坏作用

CLP-23无菌滤液的制备方法：CLP-23菌株48h的发酵培养液经 8000rpm，5min低温条件离心后去弃菌体沉淀取上清经细菌过滤器(0.22μm) 除菌后即无菌滤液。

青枯菌发酵液的制备方法：将CLP-23菌接种到液态培养基中28℃、 120rpm黑暗条件下振荡培养48h，即发酵液。

分别取CLP-23无菌滤液10mL与90mL青枯菌发酵液(10⁸cfu/mL) 混合，空白对照是外加10mL的NB培养基处理，每个处理3个重复。混合后第24h和48h的菌液低温、5000r/min离心5min，收集菌体沉淀经无菌的PBS缓冲液冲洗3次，并以200μLPBS重悬后，加入500μL2.5％戊二醛固定2h，10000r/min离心，弃上清，沉淀以叔丁醇梯度脱水15min，真空干燥1h，透射电镜观察第24和48h的青枯菌菌体破坏程度。

透射电镜观察结果如图3所示，A为对照(40000×)，B为CLP-23无菌上清液处理24h，C为CLP-23无菌上清液处理48h。结果表明，CLP-23 能分泌胞外拮抗物质对青枯菌菌体有不同程度的破坏作用，杆状菌体受到破坏，其内含物泄露引起菌体瓦解，进而造成菌体死亡。当CLP-23无菌滤液处理24h后，菌体细胞壁边缘破损，菌体已出现皱缩、变形，内含物开始外泄；处理第48h时，杆状菌体已严重畸形，大部分内含物外泄，杆状菌体瓦解；而CK处理的菌体在第24和48h均呈完整的杆状，生长正常。

实施例3

酸性和中性条件下CLP-23的防病效果的盆栽试验

pH 5.5和7.0土壤制备：参照常规方法测定湿热灭菌土pH＝6.6。称取质量为5g的该土壤至50mL的锥形瓶中，按照水:土＝2.5:1的质量比例加入去离子水，250r/min振荡20min，静置30min测定pH，记录数据。取过20 目筛(孔径为0.9mm)的土壤，用酸、碱缓冲液充分混匀为pH 5.5和pH 7.0 的土壤，备用。

标准菌液的制备方法：CLP23发酵液离心(8000rpm、5min低温4℃) 取菌体沉淀于适量无菌水中悬浮2次，采用分光光度计和无菌水梯度稀释法调整CLP23菌悬液OD₆₀₀＝0.1，即浓度为1X10⁸cfu/mL作为标准液。

试验共设3个处理：处理1为CLP-23的标准菌液(10⁸cfu/mL)，处理2为72％农用链霉素(购自华北制药)稀释2000倍液，处理3为无菌水对照(CK)。将供试烟苗(假植后苗龄为45天的烟苗)根部经无水乙醇消毒和无菌水漂洗后，浸根于处理1～3的处理液中40min，然后移入盛有pH 5.5 和7.0土壤的花盆中(150mm×110mm)，缓苗3d后，用青枯菌标准菌液(浓度10⁸cfu/mL)灌根，每盆用量为10mL，将供试烟苗置于光周期为14 L:10D、昼夜温度为30℃、湿度约为75％的人工气候室内，每处理15株烟苗，3次重复。待烟株出现青枯病萎蔫症状后，每天观察烟株发病情况，待 CK的发病率达到80％，调查各处理的发病率和病情指数并统计防治效果，病情分级与病情指数计算参照烟草病虫害分级及调查方法(GB/T 23222-2008)。

酸性与中性土壤条件CLP-23对烟草青枯病的防治效果如图4所示，接种烟草青枯病15d后，CLP-23菌株对酸性和中性土壤条件烟草青枯病均具有防病效果。pH5.5酸性条件的防治效果为70.6％，而在中性土壤中的防治效果较之下降，仅为52.3％，处理间差异显著，说明CLP-23菌株在pH5.5 酸性植烟土壤条件的防病效果高于pH7.0中性土壤条件，且对照药剂72％链霉素WP在pH5.5和7.0条件时对青枯病防效分别为38.8％和45.8％，防病效果低于CLP-23处理，且在酸性植烟土壤中的防效较低。

实施例4

促生盆栽试验共设2个处理，处理1为浓度为10⁸cfu/mL的CLP-23标准菌液，处理2是无菌水对照处理(CK)。将待测试烟苗分别移栽于装有 pH 5.5和7.0的灭菌土壤的花盆中(150mm×110mm)，移栽后第3d进行菌液灌根，每株用量50mL，CK为等量无菌水。将供试烟苗置于光周期为 14L:10D、昼夜温度为32/30℃、湿度为75％的人工气候室内，每处理15 株烟苗，3次重复。30d后，流水小心洗去根部泥土，按烟草农艺性状调查方法(YC/T142-2010)测量并记载各处理烟株株高，称量整株干重和根干重 (将烟株置于70℃的烘箱中烘干1h至恒重)，采用丙酮乙醇混合液法测定各处理烟叶叶绿素含量。

试验结果如表2所示，在酸性和中性土壤条件下，经CLP-23处理过的烟草的株高、整株干重、根干重和叶绿素含量均有明显的增加。pH为5.5 的酸性土壤中，CLP-23菌株能不同程度的促进烟株营养生长，对株高、整株鲜重和干重、根干重及叶绿素含量的增长率分别为30.5％、10.7％、1.2％、 10.2％和10.5％，且均高于中性土壤中以上各指标，中性条件下各指标的增长率仅为-3.6％、-7.42％、5.47％、-13.04％和0.61％。上述结果说明，酸性土壤条件下CLP-23的促生效果好。

表2 CLP-23在酸性和中性土壤条件下的促生效果

备注:不同字母表示显著性差异(p＜0.05),下同。

实施例5

CLP-23生物菌剂的制备方法：将CLP-23菌株按照体积比1:1000接种量比接种于无菌营养肉汤液态培养基，28℃，120rpm条件下黑暗振荡培养 72h后，CLP-23生物菌剂的浓度为1x10¹¹cfu/ml。

大田条件下CLP-23对烟草生长发育的促生效果

试验方法：试验于2019年5～7月在山东沂水县四十里堡烟田(118.7°E, 35.7°N)烟草青枯病连年中等偏重发生的连作酸化烟田中进行。供试烟田(大小为20m×20m，每行40株，共20行)平分为2个处理区，试验共设2 个处理，处理1是CLP-23生物菌剂处理，处理2是灌溉水空白对照(CK) 处理，每处理每重复4行，共3次重复，共720株。供试品种为中烟100，苗床出苗后大约40d移栽至大田，缓苗3天后灌根接种CLP-23生物菌剂，每株使用量为100mL，间隔10天第2次使用，CK处理施用等量灌溉水。其它田间管理按照试验烟田统一生产规范进行，符合当地科学的农业实践 (GAP)。第二次施菌后35d调查，每处理随机选取15株，分别调查统计烟草株高，茎围，有效叶数，最大叶长、叶宽及最大单位叶面积等地上部生长指标，其中最大单叶叶面积计算公式如下：

最大单叶叶面积(m²)＝0.6345×(叶长×叶宽)

式中：0.6345为烤烟计算叶面积时的常数，品种间有差异。

利用DPS 7.05软件，采用Duncan氏新复极差法进行分析，同一列数据后的不同字母代表在P＜0.05水平下具有显著差异性，数据均为平均值±标准差。

CLP-23对烟草促生效应的田间试验结果如表3所示，CLP-23处理后，株高和茎围的平均值分别为81.88cm和7.88cm、平均有效叶数超过22片，最大叶长和叶宽为48.21和25.43cm，平均最大单位叶面积为827.36cm²， CK处理的株高和茎围平均值分别为分别是69.8cm和6.46cm，平均有效叶数为17片左右，最大叶长和叶宽为41.47和21.57cm，平均最大单位叶面积 603.67cm²，处理间差异显著，CLP-23对烟草株高、茎围、有效叶数，最大叶长、叶宽和最大单位叶面积比CK处理分别增长17.31％、21.98％、29.41％、 16.25％、17.89％和37.06％，上述结果说明CLP-23在大田条件下有助于促进烟草地上部生物量的积累从而促进烟草生长，其中对烟草最大叶单位面积、有效叶数、茎围株高的增加较明显。

表3 CLP-23对烟草促生效应的田间试验结果

备注:不同字母表示显著性差异(p＜0.05),下同。

实施例6

(1)磷标准曲线的绘制：分别吸取5mg/L磷酸二氢钾标准溶液0.0、 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于50ml容量瓶中，加入0.5mol/LNaHCO₃10.0 ml，加水使各瓶的总体积达到30ml，摇匀，最后加入钼锑抗试剂5.0ml混匀显色，定容，在720nm波长下进行比色，以OD₇₂₀值为横坐标，相应的磷含量为纵坐标，绘成标准曲线(图5)。相关系数R2在0.99以上，说明标准曲线适于水溶性磷含量的定量测定。

(2)溶磷作用定量测定：采用钼锑抗比色法测定耐酸拮抗菌株培养液中水溶性磷含量，确定该菌株溶磷能力，取耐酸拮抗菌株CLP-23标准菌液 (1x10⁸cfu/mL)按1％体积接种于pH 5.5和pH7.0的溶磷液态培养基中，28℃、 150r/min振荡培养5d，将培养好的发酵液于离心机中4000r/min，离心20 min，倒出上清液并定容至50ml，沉淀加1g石英砂在研钵中研磨10min 后用蒸馏水洗下，研磨液在离心机中4000r/min，二次离心20min，弃去沉淀，将上清液同样定容为50ml。将两次离心的上清液合并在一起，进行供试菌株发酵液中水溶性磷的测定，确定其溶磷能力。每个处理3次重复。取上清液5ml，加入0.5mol/LNaHCO₃溶液10ml，然后加入蒸馏水35ml，然后用移液管吸取钼锑抗显色剂试剂5.0ml，摇匀，室温静置30min后，在720nm波长下进行比色，调节不接种的溶磷培养基OD₇₂₀＝0，测定待测菌株上清液的吸光度，与标准曲线对比得到该菌株上清液中可溶性磷含量。另选取也具有溶磷能力的PGPR菌株假单胞菌属(Pseudomonas spp.)CLP-8 为对照菌株，同样方法测试菌株溶磷能力。

试验结果如表4所示：pH为5.5酸性和pH为7.0中性条件下耐酸拮抗菌株P.koreensis CLP-23培养液中水溶性磷含量均差异显著，在pH5.5的酸性条件下，水溶性磷含量分别为79.5mg/L，pH7.0中性条件时为41.1mg/L，因此，CLP-23在酸性条件下的溶磷能力强于中性条件，且对比CLP-8菌株 (来源于山东省临沂市沂水县四十里堡青枯病发病重田块烟株根际，生防细菌，假单胞属细菌Pseudomonas.spp.)的溶磷能力，CLP-23菌株溶磷能力更强，且其酸性条件的溶磷能力也更强，有利于其向酸性土壤中烟草营养发育提供更多的磷元素促进其吸收。

表4 pH5.5和pH7.0条件下CLP-23溶磷活性测定结果

备注:不同字母表示显著性差异(p＜0.05),下同。

实施例7

pH5.5和pH7.0时CLP-23分泌生长素吲哚乙酸(IAA)含量差异测定

(1)IAA标准曲线的绘制：标准曲线采用纯3-IAA制作，配制2组3-IAA 溶液，浓度依次为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5mg/L(做三次平行试验)和25、50、75、100、125、150、175mg/L(做三次平行试验)，分别取上述3-IAA溶液4ml，在第1组中加入PC比色液4ml，第2组中加入S2比色液4ml，在黑暗中静置0.5h，取出立即用分光光度计测定 OD530值，获得数据制作标准曲线。每个处理3次重复。

(2)IAA分泌量定量测定：采用Salkowski比色法定量测定耐酸拮抗菌株IAA分泌量，取标准菌悬液于无菌条件下按1％接种于pH 5.5和7.0的含100mg/L色氨酸的NB培养液中，28℃、170r/min振荡12d。将菌液 10000r/min离心10min，取上清，取4ml上清液加入等量比色液，在黑暗中静置0.5h，取出立即用分光光度计测定OD₅₃₀值，以未接种的NB培养液调零，并根据PC比色液和S2比色液的测定值范围对结果进行选择，用相应的标准曲线算出该菌株最终IAA分泌量。每个处理三次重复。

采用Salkowski比色法定量测定耐酸拮抗菌株IAA分泌量，标准曲线如图6所示。IAA分泌量如表5所示，菌株CLP-23在pH 5.5和7.0时IAA分泌量分别为29.61和19.21mg/L，两个处理间差异显著，说明该菌株在酸性条件下产IAA能力强于中性条件，酸性条件能促进CLP-23分泌更多的IAA 从而促进烟草更好的生长发育。

表5 酸性和中性条件CLP-23分泌IAA含量

备注:不同字母表示显著性差异(p＜0.05),下同。

实施例8

pH5.5和pH7.0条件CLP-23分泌脂肽类抗生素2,4-DAPG产量测定

(脂肽类抗生素为微生物拮抗物质的一种，具有靶标性强、拮抗活性强的特点，对多种植物病原真菌、细菌和线虫具有抑制或杀死作用而得到较广泛的研究)。

取CLP-23标准菌液按体积比1％分别接种于200mL、pH值为5.5和7.0 的NB中，以未接种的NB为空白对照，28℃、150r/min振荡培养72h后，菌株发酵液经10000r/min离心10min，除菌上清液通过适量1M HCl调整其pH为3.0，等体积乙酸乙酯萃取2次，有机相经旋转蒸发仪干燥后溶于 0.5mL甲醇中，重复3次。萃取物通过高效液相色谱仪法(HPLC)进行测定。C18反向色谱柱(150×4.6mm)，检测波长为270nm，进样体积10μL，流动相为乙腈：水(体积比)＝45:55(0.1％H₃PO₄)，流量为1.0mL/min。

标准品抗生素2,4-DAPG对茄科雷尔氏菌(R.solanacearum)的拮抗活性如图7所示，结果表明2,4-DAPG对茄科雷尔氏菌具有拮抗活性。

通过对酸性和中性条件下耐酸拮抗菌CLP-23产生的粗提物进行HPLC 分析，结果如表6所示，酸性和中性条件下耐酸拮抗菌株CLP-23的2,4-DAPG 分泌量差异显著，分别为9.24和6.60mg，即菌株CLP-23在酸性条件下 (pH5.5)产2,4-DAPG能力强于中性条件(pH7.0)，因此，菌株CLP-23 在酸性条件下对茄科雷尔氏菌的拮抗活性更强，更有利于发挥该菌株在酸性土壤条件下的防病效果。

表6 pH5.5酸性和pH7.0中性条件下CLP-23菌株2,4-DAPG产量测定结果

备注:不同字母表示显著性差异(p＜0.05),下同。

实施例9

田间生物修复土壤试验

土壤酶活性通常被作为评价土壤肥力、鉴别土壤熟化度的指标之一。过氧化氢酶活性表征土壤微生物活性及有机质含量，且活性与土壤pH密切相关，大致呈现碱性激活，酸性抑制的趋势，即提高酸性土壤pH。脲酶活性与土壤中氮素的供给和有机质含量密切相关。碱性磷酸酶活性主要参与土壤中有机磷化合物的矿化过程，其活性高低反应土壤中有效磷的利用状况。

CLP-23施菌方法同实例5。分别于第二次施菌后5d(5月7日)、25d (5月28日)和44d(6月21日)采用5点法收集各处理的土样，每点5 棵烟株，共20株；土样收集采用抖根法，即拔出根系，去除根围土，将主根和须根附着的土壤抖到自封袋中土样共约100g，混匀并置于-20℃冰箱保存、备用。各土壤酶活性的测定均参照关松荫方法(土壤酶及其研究法，1986)，土壤酶活包括脲酶(UE)和过氧化氢酶(S-CAT)；土壤肥力：速效钾(AK) 用火焰光度计法测定、速效磷(AP)用钼蓝比色法测定、铵态氮(AN)用靛酚蓝比色法测定、硝态氮(NN)氮用酚二磺酸比色法测定和有机质(OM)用重铬酸钾容量法(外加热法)测定。试验数据计算均为三次重复平均值。

试验结果显示如图8和表7所示，可以看出，CLP-23处理对根际土壤酶活性存在不同程度的影响。第二次施菌后5d、25d和44d，三种土壤酶活性在取样时间范围内均高于CK处理；其中，土壤碱性磷酸酶呈上升趋势，施菌后44d活性最高，比CK增长162.5％；过氧化氢酶和脲酶活性均呈先上升后下降的趋势；施菌25d时过氧化氢酶和脲酶活性最高，分别比CK增加133.3％和32.9％，处理间差异显著。上述结果说明施用CLP-23可提高供试三种土壤酶活性，增加土壤肥力，从而促进烟草生长。

表7 CLP-23处理对根际土壤酶活性的影响

CLP-23对土壤肥力的影响如表8和图9所示，可以看出第二次施菌后5 d，25d和44d时间内，CLP-23处理后速效钾、铵态氮、硝态氮含量均呈先上升后下降趋势，施菌25d时达到最高，且远高于同期CK处理水平；其中，速效钾、铵态氮、硝态氮较CK分别增长106.4％、76.1％和42.1％；速效磷含量呈上升趋势，施菌44d时达到最高，比CK增长48.8％；有机质含量至 44d时最高，为91.85mg/kg土，比CK处理增加13.39％。

表8-1 CLP-23对土壤肥力的影响

表8-2 CLP-23对土壤肥力的影响

实施例10

CLP-23-GFP标记菌株的构建及其在烟草根际的定殖

将重组表达载体sfGFP-p96在含氯霉素(50μg mL^-1)、28℃过夜培养后，通过电击转化为CLP-23感受态细胞。挑出阳性转化体，并将其过夜转移至含有氯霉素(50μg mL^-1)的LB肉汤中；吸取5升细菌培养物并制成载玻片。

CLP-23-GFP菌株的生长曲线和CLP-23-GFP菌株的质粒稳定性测试如图10所示，结果表明，CLP-23菌株中GFP的表达对其生长基本无影响；同时，质粒稳定性高。这表明CLP-23-GFP菌株中的外源质粒可以稳定地遗传。

烟草根际定殖采用浸根法。将根部清洗和消毒的烟苗根部浸入标记菌株 CLP-23-GFP(1x10⁸cfu/mL)菌液中40min，移栽至无菌土的花盆内，荧光电镜观察标记菌株CLP-23-GFP在烟草根围定殖和消长动态。

结果如图11所示，接种24h后可观察到，CLP-23-GFP标记菌株的绿色杆状菌体在烟草根尖根表周围大量定殖，包括纤毛上，形成一层较厚保护膜 (图11中A-1和A-2)；处理4d和10d后标记菌株数量有所下降，但标记菌株在烟草根部定殖数量变化不大(图1中B-1,B-2与C-1,C-2)，说明CLP-23 菌株可以在烟草根际定殖，保护根部抵抗病原菌的侵染，从而减轻病害的发生程度。

实施例11

pH5.5酸性条件下CLP-23与对照菌株生防短小芽孢杆菌B.pumilus CLB-4(菌种保藏号CGMCC.7.252)的拮抗活性对比试验

pH5.5酸性土壤制备方法同实例例4。试验设3个处理，处理1为CLP-23 发酵液(1×10⁸cfu/mL)，处理2为B.pumilus CLB-4发酵液(1×10⁸cfu/mL)，处理3为清水空白对照。将45d苗龄的供试烤烟品种K326根部经清水和70％酒精漂洗表面消毒后浸根于上述处理溶液中40min后，移栽至无菌土花盆中，每处理10株，各3次重复。供试烟苗置于28℃、相对湿度70％的温室中培养。培养30d后，拔出并清洗根部，统计调查株高、整株鲜重与干重、根干重(将烟株置于70℃的烘箱中烘干1h至恒重)及叶片叶绿素含量(测定方法同实例例4)等生长指标。

试验结果如表9所示，在pH5.5的酸性土壤中，CLP-23菌株对烟株生长，对株高、整株鲜重和干重、根干重和叶绿素含量提高具有明显的促进作用，与CK处理相比，上述各指标的增长率分别为46.51％、32.70％、 49.15％、30.57％和30.21％，而生防细菌CLB-4在pH酸性土壤条件下的促生效果不明显，各项生长指标与CK处理相当。在酸性和中性土壤条件下，经耐酸性拮抗细菌CLP-23处理过的烟草株高、整株干重、根干重和叶绿素含量明显提高。上述结果说明，酸性土壤条件下CLP-23的促生效果好。

表9 酸性土壤条件下CLP-23和对照菌株CLB-4促生效果测定

本发明提供了一株能够修复酸性土壤且对茄科青枯病和黑胫病具有防治作用的耐酸性韩国假单胞菌，本发明提供的菌株能够修复酸性土壤，且对烟草青枯病和黑胫病具有防治作用，还能够促进茄科作物生长。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种生物菌剂，其特征在于，包括韩国假单胞菌CLP-23；

所述韩国假单胞菌CLP-23的生物保藏号为CGMCC No.13203。

2.根据权利要求1所述的生物菌剂，其特征在于，所述生物菌剂的有效活菌浓度为1×10¹⁰～5×10¹²cfu/ml。

3.根据权 利要求1或2所述的生物菌剂的制备方法，其特征在于，将所述韩国假单胞菌CLP-23接种于液态培养基进行液态黑暗培养，得到发酵液；将所述发酵液冷冻干燥制成干粉，得到生物菌剂。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述液态培养基包括营养肉汤液态培养基。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述液态黑暗培养为黑暗震荡培养。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述黑暗震荡培养的条件包括：温度为26～30℃，转速为120～150rpm，时间为60～84h。

7.权利要求1或2所述的生物菌剂或权利要求3～6任意一项所述制备方法制得的生物菌剂在防治茄科作物青枯病和/或黑胫病中的应用。

8.权利要求1或2所述的生物菌剂或权利要求3～6任意一项所述制备方法制得的生物菌剂在促进茄科作物生长中的应用。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述生物菌剂的使用量为0.1～0.5kg/亩。

10.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述应用包括：

当所述茄科作物处于苗床期时，所述生物菌剂的使用量为0.1～0.3kg/亩，将所述生物菌剂稀释500～600倍，喷施于育苗基质；

当所述茄科作物处于移栽期或团棵期时，所述生物菌剂的使用量为0.3～0.5kg/亩，将所述生物菌剂稀释200～400倍灌根，间隔10天施用1次，连续施用2～3次；

当所述茄科作物处于发病前或发病初期时，所述生物菌剂的使用量为0.4～0.5kg/亩，将所述生物菌剂稀释500～600倍灌根，间隔7天施用1次，连续灌根2～3次。

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