CN115612638B - 一株罗氏假单胞菌oor2-11菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株罗氏假单胞菌OOR2‑11菌株及其应用。所述罗氏假单胞菌OOR2‑11菌株于2022年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62682，该菌株具有解有机磷、解钾、固氮、产吲哚乙酸、产铁载体等促生能力，可以促进多年生稻的生长，主要表现为促进植株的增高、根伸长、以及鲜重、叶绿素、氮含量、磷含量、钾含量和籽粒产量的增加，可用于制备促进水稻生长、提高水稻产量的产品，如制成微生物菌肥等。除促进多年生稻生长外，本发明所述OOR2‑11菌株所具有的解有机磷、解钾功能还可以防止土壤酸化、板结等土地退化现象出现。

Description

一株罗氏假单胞菌OOR2-11菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域。更具体地，涉及一株罗氏假单胞菌(Pseudomonas rhodesiae)OOR2-11菌株及其应用。
背景技术
多年生稻(Perennial Rice)是指种植一次可以连续收获多年(季)的新型稻作品种。相对于一年生水稻，多年生稻从第二季起，在稻作生产过程中不再需要买种、育秧、犁田、耙田、移栽等生产环节，而只需要田间管理和收获两个生产环节，每亩可节约5～6个人工投入(折合500～600元)，不仅减少了田间劳动时间和劳动次数、降低了劳动强度，免耕少耕也减少了水土流失，在维护粮食安全的同时具有良好的社会和生态效益，是一种绿色轻简化的新型稻作生产模式。
尽管多年生稻技术体现出巨大的生产优势，但是作为新型稻作生产方式，也存在着很多技术问题需要解决。如由于连续进行稻作生产下免耕少耕产生的一定的连作障碍，包括土壤酸化、土壤板结以及病虫害残留等问题，导致多年生稻的生长发育受阻，影响最终高产和稳产。尽管改变施肥方式，如多施有机肥和减施化肥是改善土壤结构的良好策略，但有机肥通常需要配合耕作方式进行施用，因此，基于免耕少耕的多年生稻作的生产需要更有效的营养补充策略。
植物内生菌是指能够定殖在植物各种组织和器官的细胞间或细胞内，并与植物建立和谐联合关系的一类微生物，是植物微生态系统的重要组成部分，具有广泛的生态学作用，具有较大的农业应用潜力。植物内生菌定殖到宿主植物后，会通过产生植物激素、固氮、溶磷、解钾、产生铁载体等，改变根系形态，促进植物健康生长，进而提高宿主植物的产量和品质。虽具有植物促生功能的植物内生菌菌株有很多，但不同菌株所能促进生长的植物种类是不同的，目前并未有关于可促进多年生稻生长发育并保证多年生稻高产稳产的植物内生菌的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服目前尚未有可促进多年生稻生长发育并保证多年生稻高产稳产的植物内生菌的不足，提供一株可促进多年生稻生长，提高多年生稻籽粒产量的罗氏假单胞菌OOR2-11菌株。
本发明的第一个目的是提供一株罗氏假单胞菌OOR2-11菌株。
本发明的第二个目的是提供所述罗氏假单胞菌OOR2-11菌株在促进水稻生长中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述罗氏假单胞菌OOR2-11菌株在提高水稻籽粒产量中的应用。
本发明的第四个目的是提供罗氏假单胞菌OOR2-11菌株在制备促进水稻生长的产品中的应用。
本发明的第五个目的是提供所述罗氏假单胞菌OOR2-11菌株在制备提高水稻籽粒产量的产品中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种水稻促生剂或水稻籽粒灌浆促进剂。
本发明的第七个目的是提供一种促进水稻幼苗生长的方法。
本发明的第八个目的是提供一种提高水稻籽粒产量的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明从药用野生稻根部中分离纯化得到了一株罗氏假单胞菌，将其命名为OOR2-11菌株，该菌株具有解有机磷、解钾、固氮、产吲哚乙酸(IAA)、产铁载体等多种促生功能，对多年生稻具有显著的促生作用，可在多年生稻的生长发育过程中促进营养元素的吸收，最终达到增产的效果。因此，本发明申请保护所述罗氏假单胞菌(Pseudomonasrhodesiae)OOR2-11菌株，所述菌株于2022年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62682。
鉴于本发明所述罗氏假单胞菌OOR2-11菌株可以促进多年生稻生长，提高多年生稻的籽粒产量。因此，本发明还申请保护OOR2-11菌株的以下应用：
本发明申请保护所述罗氏假单胞菌OOR2-11菌株在促进水稻生长中的应用。
具体地，所述应用为罗氏假单胞菌OOR2-11菌株在促进水稻幼苗生长中的应用。
本发明还申请保护所述罗氏假单胞菌OOR2-11菌株在提高水稻籽粒产量中的应用。
本发明还申请保护所述罗氏假单胞菌OOR2-11菌株在制备促进水稻生长的产品中的应用。
具体地，所述应用为罗氏假单胞菌OOR2-11菌株在制备促进水稻幼苗生长的产品中的应用。
本发明还申请保护所述罗氏假单胞菌OOR2-11菌株在制备提高水稻籽粒产量的产品中的应用。
作为一种可选的实施方式，所述产品为微生物菌肥。
本发明还提供了一种水稻促生剂或水稻籽粒灌浆促进剂，其是以所述罗氏假单胞菌OOR2-11菌株或罗氏假单胞菌OOR2-11菌株的菌液为活性成分。
本发明还提供了一种促进水稻幼苗生长的方法，所述方法为：催芽前，先用所述罗氏假单胞菌OOR2-11菌株的菌液进行浸种处理。
本发明还提供了一种提高水稻籽粒产量的方法，所述方法为：移栽前，先用所述罗氏假单胞菌OOR2-11菌株的菌液进行浸泡处理。
具体地，所述菌液的浓度为1.0×107～1.0×109cfu/mL，浸种或浸泡处理时间为10～14h。
具体地，所述水稻为多年生稻。
更具体地，所述多年生稻为云大107或PR23。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一株具有解有机磷、解钾、固氮、产IAA、产铁载体等促生功能的罗氏假单胞菌OOR2-11菌株，该菌株于2022年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62682。所述OOR2-11菌株可以促进多年生稻的生长，主要表现为促进植株的增高、根伸长、以及鲜重、叶绿素、氮含量、磷含量、钾含量和籽粒产量的增加，可用于制备促进水稻生长、提高水稻产量的产品，如制成微生物菌肥等。除促进多年生稻生长外，本发明所述OOR2-11菌株所具有的解有机磷、解钾功能还可以防止土壤酸化、板结等土地退化现象出现。
附图说明
图1为OOR2-11菌株的菌落形态特征。
图2为OOR2-11菌株的革兰氏染色结果。
图3为OOR2-11菌株16S rDNA序列的PCR扩增检测结果；图中M为DNA marker；1为OOR2-11菌株的16S rDNA基因。
图4为OOR2-11菌株系统发育树。
图5为OOR2-11菌株的解有机磷功能鉴定结果。
图6为OOR2-11菌株的解有钾功能鉴定结果。
图7为OOR2-11菌株的固氮功能鉴定结果。
图8为罗氏假单胞菌OOR2-11菌株固氮酶nifH基因的PCR扩增检测结果；图中M为DNA marker；1为OOR2-11菌株的nifH基因。
图9为OOR2-11菌株的产IAA功能鉴定结果。
图10为OOR2-11菌株的产铁载体功能鉴定结果。
图11为罗氏假单胞菌OOR2-11菌株接种的云大107幼苗与对照组幼苗的对比图。
图12为罗氏假单胞菌OOR2-11菌株接种的PR23幼苗与对照组幼苗的对比图。
图13为OOR2-11菌株对多年生稻产量性状指标的影响结果；其中，图A～E依次为OOR2-11菌株对多年生稻PR23结实率、每穗(籽)粒数、千粒重、株前穗数、单株产量的影响结果；图F～J依次为OOR2-11菌株对多年生稻云大107结实率、每穗(籽)粒数、千粒重、株前穗数、单株产量的影响结果；*代表p＜0.05，**代表p＜0.01。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 OOR2-11菌株的分离和培养
本发明所述OOR2-11菌株来源于药用野生稻根部，其分离、纯化过程如下：
采用表面消毒研磨法和平板稀释分离法对药用野生稻植株中的内生菌进行分离；分别剪取健康药用野生稻植株的根、茎、叶，自来水冲洗表面污渍后，用滤纸吸干表面水分；表面消毒程序为：(1)根：75％酒精浸泡5min，无菌水漂洗1次，2.5％次氯酸钠浸泡3min，无菌水漂洗3次；(2)茎：75％酒精浸泡4min，无菌水漂洗1次，2.5％次氯酸钠浸泡2min，无菌水漂洗3次；(3)叶：75％酒精浸泡150s，无菌水漂洗1次，2.5％次氯酸钠浸泡2min，无菌水漂洗3次。
表面消毒完成的植株组织用无菌滤纸吸干表面的水分后，将不同组织分别放入无菌研钵中，加入适量无菌水，研磨后对研磨液进行稀释(10-2、10-3、10-4、10-5)，吸100μL至NA培养基上，用无菌涂布器涂匀；同时吸取100μL第3次漂洗液涂板，用来检测组织表面消毒是否彻底。最后将NA培养基倒置于37℃黑暗培养箱中培养1～2d直至有菌落长出，观察菌落形态，挑取形态不同的细菌菌落进行纯化；编号后采取甘油保存法，于-80℃下保存菌种。
将-80℃下保存的菌种取出，用接种环蘸取一环菌液于NA平板表面划线，37℃倒置培养1～2d，挑取单菌落于800μL的NB培养基中打匀，37℃，200rpm，振荡培养16～24h。
NA培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，调pH至7.0～7.5，121℃灭菌20min。
NB培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，蒸馏水定容至1L，调pH至7.0-7.5，121℃灭菌20min。
实施例2 OOR2-11菌株的鉴定
1、形态学鉴定
(1)菌落形态特征
将分离保存的OOR2-11菌株在NA平板上划线，于37℃恒温培养箱培养24h后使用体式镜观察该菌株的单菌落形态特征。OOR2-11菌株的菌落形态特征如图1所示，由图1可知，OOR2-11菌株的菌体呈乳白色、圆形、无凸起、表面光滑、边缘整齐，菌落直径大小为4～5mm。
(2)菌落革兰氏染色特征
从NA平板上挑取单菌落于NB培养基中打匀，37℃，200rpm，振荡培养16～24h，取适量菌液进行革兰氏染色并于显微镜下观察其菌体形态特征。OOR2-11菌株的革兰氏染色结果如图2所示，由图2可知，OOR2-11菌株为革兰氏阴性细菌，呈杆状，菌体大小为0.8～1.0μm×6.0～8.0μm。
2、分子生物学鉴定
(1)PCR扩增
提取OOR2-11菌株的DNA并对其16S rDNA基因片段进行PCR扩增，所用的扩增引物为：
正向引物，16S rDNA(27F)：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
反向引物，16S rDNA(1492R)：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
PCR条件包括以下：PCR反应体系：2×PCR Buffer 12.5μL、2mM dNTPs 5μL、10pmoL/mL 27F 0.75μL、10pmoL/mL 1492R 0.75μL、KOD FX(1.0U/μL)0.5μL、DNA 1.0μL、ddH2O 4.5μL；PCR扩增程序：94℃预变性5min，98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸90s，共35次循环，最后68℃延伸5min。
PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检验并测序。OOR2-11菌株16S rDNA序列的PCR扩增检测结果如图3所示，由图3可知，本发明成功扩增得到了OOR2-11菌株的16S rDNA。
OOR2-11菌株的16S rDNA序列长为1465bp，序列如下所示：
CTCCGATTGGGTACCGTCCCCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCTGGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTATGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATTACGTGCTGGTAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAATGTTCCCGAAGGCACCAATCTATCTCTAGAAAGTTCATTGGATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAGAGCTCAAGGCTCCCAACGGCTAGTTGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCATACTCTAGTCAGTCAGTTTTGAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCCAACTTAACAAACCACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTCGGTAACGTCAAAACCATCACGTATTAGGTAACGGCCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGTTACGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCCCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCTGATAGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTCCGTTTCCGAACGTTATCCCCCACTACCAGGCAGATTCCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTCTCAAGAGAAGCAAGCTTCTCTCTACCGCTCGACTTGCATGTGTTAGGCCTGCCGCCAGCGTCATTGACGGGGGGGAAAA
(2)系统发育树的构建
将测序所得的OOR2-11菌株的16S rDNA序列在NCBI数据库进行Blast比对，利用mega X建立系统发育树，构建所得的OOR2-11菌株系统发育树如图4所示。
经同源性比对和系统进化发育树分析发现，OOR2-11菌株的16S rRNA序列与假单胞菌属(Pseudomonas)相似性达到100％，与罗氏假单胞菌(Pseudomonas rhodesiae)88A6菌株(ACCESSION：KT695836.1，分离自美国密苏里土壤)、IARI-HHS2-17菌株(ACCESSION：KF054779.1，分离自印度北部山区小麦叶际)和90F12-1菌株(ACCESSION：KT695839.1，分离自美国密苏里土壤)相似性为99.93％，且聚集在同一个进化分支上。上述形态学和分子鉴定结果表明OOR2-11菌株为罗氏假单胞菌(Pseudomonas rhodesiae)(图4)。
本发明所述罗氏假单胞菌OOR2-11菌株于2022年8月4日保藏于广东省微生物保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62682，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼3楼。
实施例3罗氏假单胞菌OOR2-11菌株促生功能鉴定
1、解有机磷功能鉴定
采用滤纸片法，吸取5μL活化好的OOR2-11菌株的菌液接种在贴于有机磷培养基的滤纸片上，将有机磷培养基上接种了NB培养基的滤纸片作为阴性对照，28℃倒置培养2～3d后观察是否有透明圈，根据透明圈和菌落圈比值(记为Mp)判断其解磷能力。罗氏假单胞菌OOR2-11菌株的解有机磷功能鉴定结果如图5所示，由图5可知，OOR2-11菌株产生了透明圈，表明其具有解有机磷功能，另计算得该菌株的解有机磷能力Mp值为1.48±0.013。
有机磷培养基：葡萄糖10g，卵磷脂0.2g，MgSO4·7H2O 0.03g，NaCl 0.3g，(NH4)2SO40.5g，FeSO4·7H2O 0.03g，NaCl 0.3g，酵母膏0.4g，CaCO3 5g，MnSO4·4H2O 0.03g，琼脂20g，蒸馏水1000mL；混匀后调节pH为7.0。
2、解钾功能鉴定
采用滤纸片法，吸取5μL活化好的OOR2-11菌株的菌液接种在贴于解钾培养基的滤纸片上，另将解钾培养基上接种了NB培养基的滤纸片作为阴性对照，28℃倒置培养2～3d后观察是否有透明圈，根据透明圈和菌落圈比值(记为Mp)判断其解钾能力。罗氏假单胞菌OOR2-11菌株的解有钾功能鉴定结果如图6所示，由图6可知，OOR2-11菌株产生了透明圈，表明其具有解钾功能，另计算得该菌株的解钾能力Mp值为1.83±0.046。
解钾培养基：蔗糖5.0g，MgSO4 0.5g，CaCO3 2.5g，FeCl3 0.2g，NaH2PO42.0g，钾石灰粉1.0g，琼脂15g，蒸馏水1000mL；混匀后调节pH为7.0～7.1。
3、固氮功能鉴定
采用划线法，在Ashby培养基上接种罗氏假单胞菌OOR2-11菌株，将接种了NB培养基的Ashby培养基作为对照，28℃倒置培养2～3d，菌株能够稳定生长视为有固氮功能。罗氏假单胞菌OOR2-11菌株的固氮功能鉴定结果如图7所示，由图7可知，OOR2-11菌株具有固氮功能。
Ashby培养基：甘露醇5g，MgSO4·7H2O 0.2g，KH2PO4 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO4·2H2O0.1g，CaCO3 5g，琼脂15g；混匀后调节pH为7.0。
本发明还利用固氮酶nifH基因的扩增引物对OOR2-11菌株进行了PCR扩增和电泳检测。
固氮酶nifH基因的扩增引物为：
Zehr-F：5'-TGYGAYCCNAARGCNGA-3'
Zehr-R：5'-NDGCCATCATYTCNCC-3'
PCR条件包括以下：PCR反应体系：10×Ex Taq Buffer 2.5μL、2.5mM dNTP Mix0.5μL、10pmoL/mL Zehrf 0.5μL、10pmoL/mL Zehrr 0.5μL、Ex Taq(5.0U/μL)1μL、DNA 1.0μL、ddH2O 19.5μL；PCR扩增程序：95℃预变性3min，95℃变性1min，57℃退火50s，72℃延伸30s，共32次循环，最后72℃延伸5min。
PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检验。OOR2-11菌株固氮酶nifH基因的PCR扩增检测结果如图8所示，由图8可知，OOR2-11菌株具有固氮酶nifH基因。
4、产IAA(吲哚乙酸)功能鉴定
IAA定性测定：采用比色法，将OOR2-11菌株接种至King B培养基中，摇床28℃125r/min培养2d；然后吸取50μL菌悬液和50μL Salkowski’s试剂于白色点滴板上，同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照加入50μL 50mg/L吲哚乙酸，阴性对照加入King B培养基，将点滴板避光30min后观察其颜色变化，变为粉红色说明其能产生IAA。罗氏假单胞菌OOR2-11菌株的产IAA功能鉴定结果如图9所示，由图9可知，OOR2-11菌株具有产IAA(吲哚乙酸)功能。
IAA定量测定：配制质量浓度为10mg/L～60mg/L，间隔为10mg/L的IAA标准品溶液，并吸取2mL OOR2-11菌株的菌悬液和2mL Salkowski’s试剂混合，室温避光30min，分别在OD530 nm条件下测定其吸光度值，吸取2mL King B培养基与2mL Salkowski’s试剂混合液为空白对照，以IAA标准溶液质量浓度为横坐标，OD530nm值为纵坐标绘制IAA标准曲线。将OOR2-11菌株接种于King B培养基中，每个菌株3个重复，37℃、200r/min条件下培养48h后取出，10,000r/min离心10min，取上清液2mL与等体积Salkowski显色剂混合，25℃避光反应30min，测定OD530nm值。根据自制的IAA标准曲线回归方程y＝0.0195x-0.0129(R2＝0.9953)计算该菌株产IAA的能力。经过计算，OOR2-11菌株的产IAA量为3.34μg/mL。
King B培养基：色氨酸0.1g，K2HPO4 1.725g，蛋白胨20g，MgSO4·7H2O1.5g，丙三醇15mL，蒸馏水1000mL，混匀后调节pH为7.0，121℃灭菌20min。
5、产铁载体功能鉴定
定性检测：采用滤纸片法，在CAS培养基上接种OOR2-11菌株，将接种NB培养基的CAS培养基作为阴性对照，然后在28℃倒置培养2～3d后观察是否有橙黄色晕圈，根据橙黄色晕圈和菌落圈比值(记为Mp)判断其产铁载体能力。罗氏假单胞菌OOR2-11菌株的产铁载体功能鉴定结果如图10所示，由图10可知，OOR2-11菌株具有产铁载体功能，另通过计算该菌株产铁载体能力Mp值为3.02±0.083。
定量检测：将罗氏假单胞菌OOR2-11菌株接种至MKB液体培养基中，28℃、180r/min摇床培养48h，取适量菌液10,000r/min离心10min，再取上清3mL与CAS检测液等体积混合，黑暗中静置30min，测630nm处的吸光值(As)，以双蒸水为对照调零。另取空白培养基与CAS检测液等体积混匀，以其吸光值作参比值(Ar)，据根公式[(Ar-As)/Ar]×100％计算，即得铁载体的相对含量。通过计算，罗氏假单胞菌OOR2-11菌株产铁载体的相对含量为69.69％。
CAS培养基：A液：0.012g铬天青(CAS)溶于10mL水，加入2mL浓度为1mmol/L的FeCl3；B液：0.015g十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)溶于8mL水；C液：将A液加入B液中，混匀备用；10×MM9溶液：Na2HPO4 30g，KH2PO4 1.5g，NaCl 2.5g，NH4Cl 5g，水500mL，混匀后稀释10倍备用；D液：取10×MM9液20mL，加入到150mL溶解有6.04g 1,4-哌嗪二乙磺酸的水中，混匀后调节pH到6.8，然后加入琼脂粉3.2g。
CAS检测培养基：混匀C液和D液，加入0.2mL浓度为1mmol/L CaCl2，4mL浓度为1mmol/L MgSO4·7H2O，2mL 20％葡萄糖溶液，4mL 10％酪蛋白氨基酸溶液。
Salkowski’s试剂：0.5mol/L FeCl3 1mL，浓H2SO4 30mL，蒸馏水50mL。
CAS检测液：取6mL 10mM十六烷基三甲基溴化铵加入100mL容量瓶中，再取1.5mL1mM FeCl3溶液和7.5mL 2mM铬天青(CAS)的混合液，用30mL无菌水溶解4.3g无水哌嗪，同时加入6.25mL 12mM HCl，得到PH＝5.6的缓冲液，将此缓冲液加入上述容量瓶中，定容至100mL，混合均匀。
MKB培养基：酪蛋白氨基酸5.0g，甘油15mL，KH2PO4 2.5g，MgSO4·7H2O2.5g，调节PH至7.0～7.2，121℃灭菌20min。
实施例4罗氏假单胞菌OOR2-11菌株促进多年生稻幼苗生长
分别选取健康一致的多年生稻籼稻品种云大107种子和多年生稻粳稻品种PR23种子，在42℃下烘种2d以打破休眠，在超净工作台内用75％酒精洗2次，每次5min，15％次氯酸钠洗3次，每次8min进行消毒，用提前活化好的OOR2-11菌株菌液(菌液浓度为1.0×108cfu/mL)浸种12h，然后催芽至露白；CK对照使用NB培养基浸种12h，然后催芽至露白；催芽后分别播种于装有灭菌土的苗盘中，每穴9粒种子，每个处理3个重复，待多年生稻长到4叶期时统计植株的株高、根长、鲜重和叶绿素含量。
罗氏假单胞菌OOR2-11菌株接种的云大107幼苗与对照组幼苗的对比图片如图11所示，由图11可知，罗氏假单胞菌OOR2-11菌株接种的云大107幼苗粗壮，说明其能够促进籼型多年生稻的生长。
罗氏假单胞菌OOR2-11菌株对云大107幼苗的促生效果如表1所示：
表1 OOR2-11菌株对云大107幼苗促生效果
由表1可以看出，OOR2-11菌株处理后的云大107植株株高，根长、鲜重和叶绿素含量均高于CK，其中根长、鲜重和叶绿素含量均显著高于CK(p＜0.05)，说明OOR2-11菌株能够促进多年生稻籼稻品种云大107的细胞伸长、适应性、生物量积累和光合作用。
罗氏假单胞菌OOR2-11菌株接种的PR23幼苗与对照组幼苗的对比图片如图12所示，由图12可知，罗氏假单胞菌OOR2-11菌株接种的PR23幼苗粗壮，说明其能够促进粳型多年生稻的生长。
罗氏假单胞菌OOR2-11菌株对PR23幼苗的促生效果如表2所示：
表2 OOR2-11菌株对PR23幼苗促生效果
由表2可以看出，OOR2-11菌株处理后的PR23植株株高，根长和鲜重均高于CK，其中株高和鲜重显著大于CK(p＜0.05)，说明OOR2-11菌株能够促进多年生稻粳稻品种PR23的细胞伸长和生物量积累。
实施例5罗氏假单胞菌OOR2-11菌株提高多年生稻植株内氮、磷和钾含量
在测定完罗氏假单胞菌OOR2-11菌株对于促进多年生稻幼苗生长的生理指标后，将实验组和对照组的多年生稻植株分为根、茎、叶三部分，于105℃下杀青30min，75℃条件下烘干至恒质量，通过粉碎，过筛(420μm)，用浓硫酸消化制成待测液，用Auto Analyzer3(AA3)连续流动分析仪和火焰分光光度计测定氮、磷、钾含量，结果分别如表3和表4所示。
表3 OOR2-11菌株对云大107植株内氮、磷、钾的影响
全氮、全磷、全钾的单位均为g/kg。
由表3可以看出，OOR2-11菌株可以显著性提高云大107植株根部和茎部氮、磷、钾含量以及叶部氮、钾含量(p＜0.05)；可以极显著提高云大107植株叶部磷含量(p＜0.01)。
表4 OOR2-11菌株对PR23植株内氮、磷、钾的影响
全氮、全磷、全钾的单位均为g/kg。
由表4可以看出，OOR2-11菌株可以显著性提高PR23植株根部磷、钾含量以及茎部和叶部氮、磷、钾含量(p＜0.05)。
实施例6罗氏假单胞菌OOR2-11菌株提高多年生稻植株籽粒产量
在温室移栽用OOR2-11菌株菌液浸泡处理12h的(浸植株所用菌液的浓度为1.0×108cfu/mL)多年生稻云大107和PR23植株，培养至成熟收获，进行产量性状指标评价。
罗氏假单胞菌OOR2-11菌株对多年生稻产量性状指标的影响结果如如13所示，其中，图13A～E依次为OOR2-11菌株对多年生稻PR23结实率、每穗(籽)粒数、千粒重、株前穗数、单株产量的影响结果；图13F～J依次为OOR2-11菌株对多年生稻云大107结实率、每穗(籽)粒数、千粒重、株前穗数、单株产量的影响结果；*代表p＜0.05，**代表p＜0.01。
由图13可知，罗氏假单胞菌OOR2-11处理后的多年生稻单株籽粒产量显著高于未处理对照CK，OOR2-11处理后可以提高产量4.5％左右。千粒重表型调查结果显示罗氏假单胞菌OOR2-11处理后的多年生稻千粒重显著高于未处理对照CK，说明OOR2-11促进籽粒产量可能是通过促进灌浆进而提高单株产量。
上述结果表明，本发明所述罗氏假单胞菌OOR2-11可以在多年生稻云大107和PR23中定殖，调节体内内生菌系统，促进植株生长，最终增加籽粒产量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株罗氏假单胞菌(Pseudonymous rhodesiae)OOR2-11菌株，其特征在于，所述菌株于2022年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62682。
2.权利要求1所述罗氏假单胞菌OOR2-11菌株在促进水稻生长中的应用。
3.权利要求1所述罗氏假单胞菌OOR2-11菌株在提高水稻籽粒产量中的应用。
4.权利要求1所述罗氏假单胞菌OOR2-11菌株在制备促进水稻生长的产品中的应用。
5.权利要求1所述罗氏假单胞菌OOR2-11菌株在制备提高水稻籽粒产量的产品中的应用。
6.一种水稻促生剂或水稻籽粒灌浆促进剂，其特征在于，以权利要求1所述菌株或其菌液为活性成分。
7.一种促进水稻幼苗生长的方法，其特征在于，所述方法为：催芽前，先用权利要求1所述菌株的菌液进行浸种处理。
8.一种提高水稻籽粒产量的方法，其特征在于，所述方法为：移栽前，先用权利要求1所述菌株的菌液进行浸泡处理。
9.根据权利要求7或8所述方法，其特征在于，所述菌液的浓度为1.0×107～1.0×109cfu/mL，浸种或浸泡处理时间为10～14h。
10.根据权利要求2～5任一所述应用或7或8所述方法，其特征在于，所述水稻为多年生稻。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116144529B (zh) * 2022-11-01 2024-02-23 云南大学 一株水稻科萨克氏菌oor3-1菌株及其应用
CN116254192B (zh) * 2022-11-29 2024-02-23 云南大学 一株产铁载体的水稻太平洋芽孢杆菌菌株及其应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009196920A (ja) * 2008-02-20 2009-09-03 Nippon Soda Co Ltd 微生物農薬製剤の保存方法
CN101541948A (zh) * 2006-11-08 2009-09-23 日本曹达株式会社 对植物病害具有防除能力的微生物和使用该微生物的植物病害防除剂
KR20090105426A (ko) * 2008-04-02 2009-10-07 충북대학교 산학협력단 배추좀나방의 유충 창자로부터 분리한 식물 생장을촉진하는 박테리아 균주 및 이를 이용한 식물 생장 촉진방법
KR20160121994A (ko) * 2015-04-13 2016-10-21 충북대학교 산학협력단 저온에서 식물의 생장을 촉진하는 내한성 슈도모나스 프레데릭스버겐시스 os261 균주 및 이의 용도
CN112007947A (zh) * 2020-08-19 2020-12-01 中国科学院城市环境研究所 罗氏假单胞菌具有修复重金属污染环境和重金属耐性的用途
CN113881606A (zh) * 2021-11-15 2022-01-04 广东海洋大学 一种耐盐促生的假单胞菌rl-wg26菌株及其应用
JP2022031416A (ja) * 2021-12-24 2022-02-18 日本曹達株式会社 植物病害防除方法および農園芸用殺菌剤組成物
CA3106780A1 (en) * 2021-01-21 2022-07-21 Saint Mary's University Methods and compositions for increasing plant growth using a biochar-microbial composite
CN116144529A (zh) * 2022-11-01 2023-05-23 云南大学 一株水稻科萨克氏菌oor3-1菌株及其应用
CN116478870A (zh) * 2023-03-27 2023-07-25 云南大学 一株嗜麦芽寡养单孢菌olr3-17菌株及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11825849B2 (en) * 2021-01-21 2023-11-28 Saint Mary's University Methods and compositions for increasing plant growth using a biochar-microbial composite

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101541948A (zh) * 2006-11-08 2009-09-23 日本曹达株式会社 对植物病害具有防除能力的微生物和使用该微生物的植物病害防除剂
JP2009196920A (ja) * 2008-02-20 2009-09-03 Nippon Soda Co Ltd 微生物農薬製剤の保存方法
KR20090105426A (ko) * 2008-04-02 2009-10-07 충북대학교 산학협력단 배추좀나방의 유충 창자로부터 분리한 식물 생장을촉진하는 박테리아 균주 및 이를 이용한 식물 생장 촉진방법
KR20160121994A (ko) * 2015-04-13 2016-10-21 충북대학교 산학협력단 저온에서 식물의 생장을 촉진하는 내한성 슈도모나스 프레데릭스버겐시스 os261 균주 및 이의 용도
CN112007947A (zh) * 2020-08-19 2020-12-01 中国科学院城市环境研究所 罗氏假单胞菌具有修复重金属污染环境和重金属耐性的用途
CA3106780A1 (en) * 2021-01-21 2022-07-21 Saint Mary's University Methods and compositions for increasing plant growth using a biochar-microbial composite
CN113881606A (zh) * 2021-11-15 2022-01-04 广东海洋大学 一种耐盐促生的假单胞菌rl-wg26菌株及其应用
JP2022031416A (ja) * 2021-12-24 2022-02-18 日本曹達株式会社 植物病害防除方法および農園芸用殺菌剤組成物
CN116144529A (zh) * 2022-11-01 2023-05-23 云南大学 一株水稻科萨克氏菌oor3-1菌株及其应用
CN116478870A (zh) * 2023-03-27 2023-07-25 云南大学 一株嗜麦芽寡养单孢菌olr3-17菌株及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
嗜碱假单胞菌Ej2浸种对盐胁迫下水稻根系内生菌群落结构的影响;沙月霞;微生物学报;第1919-1935页 *

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