CN115710566B - 一种用于稻田综合种养的菌株及其应用 - Google Patents

一种用于稻田综合种养的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

一种用于稻田综合种养的菌株及其应用，本发明涉及一种菌株及其应用。本发明用于稻田综合种养的菌株为产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM‑9，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC：24991。本发明所述的产酸克雷伯氏菌HLM‑9兼具产DDP‑IV抑制剂能力、IAA能力、解无机磷、有机磷以及具有较强的抗逆性，能够促进农作物的生长，特别适合在水稻生长的应用，不仅对水稻幼苗的萌发有较好效果，还能一定程度上提高鲤鱼的饲料利用率，这在产酸克雷伯氏菌的研究中尚属首次。

Description

一种用于稻田综合种养的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种菌株及其应用。
背景技术
稻田综合种养技术是将种稻和养鱼(鸭、蟹等水产)结合起来，把两个生产场所重叠在一起，提高了土地和水资源的利用率，充分发挥水稻和鱼(鸭、蟹等水产)共生互利的作用，从而获得有机水稻和有机鱼(鸭、蟹)双丰收，达到“一水两用、一地多收”的效果；有利于粮食安全、食品安全和生态安全。
在稻田综合种养环境中目前已经分离出一些具有功能性的菌株，但多数是功能单一的菌株，难以同时解决多种问题。
发明内容
本发明提供了一种用于稻田综合种养的菌株及其应用。
本发明用于稻田综合种养的菌株为产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC：24991。
上述产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)HLM-9的菌株在稻田综合种养中的应用。
本发明产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)HLM-9在LB固体培养基上的菌落特征为：菌落形态为球形或者椭圆形(略微不规则)，菌落颜色为乳白色，表面隆起且湿润、光滑、黏稠以接种环挑之，出现拉丝现象，主要以单细胞形式存在，偶有二联体或者链状，革兰氏阴性细菌。
本发明产酸克雷伯氏菌HLM-9菌液滴加Salkowski比色液后，室温避光条件下1mL玻璃瓶中颜色变成淡红色，产酸克雷伯氏菌HLM-9菌株具有产生长素IAA的能力；产酸克雷伯氏菌HLM-9每毫升菌液中产66.24μg IAA。
本发明产酸克雷伯氏菌HLM-9接种在蒙金娜无机磷培养基上，培养一段时间后菌落周围形成明显的溶无机磷圈，产酸克雷伯氏菌HLM-9的溶无机磷圈直径D为8.01mm，菌落直径d为3.10mm，D/d为2.58，产酸克雷伯氏菌HLM-9具有解无机磷功能。
本发明产酸克雷伯氏菌HLM-9接种在蒙金娜有机磷培养基上，培养一段时间后菌落周围形成极为明显的溶有机磷圈，产酸克雷伯氏菌HLM-9的溶有机磷圈直径D为18.82mm，菌落直径d为4.51mm，D/d为4.17，产酸克雷伯氏菌HLM-9菌株具有较强的解有机磷功能。
本发明产酸克雷伯氏菌HLM-9菌株接种在SKM培养基上，培养一段时间后菌落周围形成明显的水解圈，产酸克雷伯氏菌HLM-9的水解圈直径D为14.40mm，菌落直径d为4.06mm，D/d为3.55；产酸克雷伯氏菌HLM-9菌株在37℃时DDP-IV抑制剂产率高达53.28％，产酸克雷伯氏菌HLM-9具有较强的产DDP-IV抑制剂的能力。
本发明产酸克雷伯氏菌HLM-9具有产吲哚-3-乙酸(IAA)的能力，IAA作为植物生长调节物质，可以促进植物根系生长，增加根系长度和侧根生长数量，加快作物生长过程中对土壤养分的吸收转化效率，还能够刺激植物分泌ACC脱氨酶。本发明产酸克雷伯氏菌HLM-9同时具有良好的降解有机磷和无机磷的能力，可以将植物难以吸收的磷转化为易吸收的磷，从而达到促进农作物生长的目的。本发明产酸克雷伯氏菌HLM-9促进农作物的生长和增加农作物产量。本发明产酸克雷伯氏菌HLM-9还具有较强的产DDP-IV抑制剂的能力，可以有效降低鱼类血糖，有效的提高鲤鱼的饲料中糖分的利用，提高鲤鱼产量。本发明所述的产酸克雷伯氏菌HLM-9特别适合稻田综合种养的应用。
本发明所述的产酸克雷伯氏菌HLM-9兼具产DDP-IV抑制剂能力、IAA能力、解无机磷、有机磷以及具有较强的抗逆性，不仅对水稻幼苗的萌发有较好效果，还能一定程度上提高鲤鱼的饲料利用率，在产酸克雷伯氏菌的研究中尚属首次。
本发明产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC：24991，保藏日期是2022年5月30日。
附图说明
图1为产酸克雷伯氏菌HLM-9进行Salkowski比色法测定产IAA能力的结果图；
图2为产酸克雷伯氏菌HLM-9有机磷固体培养基上的解磷圈；
图3为产酸克雷伯氏菌HLM-9无机磷固体培养基上的解磷圈；
图4为产酸克雷伯氏菌HLM-9 2％脱脂奶粉培养基上的乳蛋白水解圈；
图5为产酸克雷伯氏菌HLM-9构建的系统发育树；
图6为产酸克雷伯氏菌HLM-9水培盒试验结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
具体实施方式一：本实施方式用于稻田综合种养的菌株为产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC：24991。
一、获得本实施方式产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9的方法
1、2021年9月，选取辽宁省盘锦市盘山县胡家镇西胡村养殖的鲤鱼群体，随机选择3尾健康的1龄鲤(150±10g)，采用MS-222麻醉剂(250mg/L)麻醉，使用无水乙醇擦拭鲤的表面，在超净工作台中用灭菌后的剪刀和镊子进行解剖，取出鲤的整条肠道，轻轻挤出内含物置于含玻璃珠和50mL无菌水的锥形瓶中，以180r/min的转速室温振荡30min，再进行梯度稀释，将10-3、10-4、10-5梯度取100μL涂布于LB固体培养基平板上，每个梯度重复3次，置于28℃培养24-48h。培养48h后，选取不同形状的菌株进行分离。
2、吲哚-3-乙酸(IAA)产生菌的筛选以及定量测定
将从鲤肠道内容物中分离出的菌株接种到含有L-色氨酸的R2A液体培养基中，置于28℃恒温摇床180r/min震荡培养4d。吸取500μL菌液于2mL玻璃瓶中，加入500μL的Salkowski比色液。同时用500mg/L的IAA加入Salkowski比色液作为阳性对照。将2mL玻璃瓶置于室温避光条件下保存30min，观察颜色变化。若颜色变红，表示该菌株具有产生IAA的功能。
产生IAA的功能的菌株进行定量检测：精确称取IAA 10mg，先用少量的无水乙醇溶解，然后加入蒸馏水定容至100mL，配置成浓度为100μg/mL的IAA溶液作为贮备液，然后将贮备液稀释配置成浓度分别为0(空白)、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μg/mL的系列标准液，作为工作液。分别取上述工作液2mL按顺序加入到8支试管中，加入2倍体积的Salkowski比色液，置于40℃避光条件下保温30min，然后测在波长530nm处的吸光值。以OD530为横坐标，IAA浓度为纵坐标，绘制IAA标准曲线。在与初筛相同的培养条件下对菌株产IAA能力进行定量测定。首先用分光光度法测定波长600nm处的菌液的OD值，然后取菌液以10000r/min的转速离心10min，取上清液加入等体积Salkowski比色液，在40℃条件下避光放置30min使其显色，测定波长530nm处的OD值。计算OD600值为1时，单位体积菌液中IAA的浓度。(菌液浓度较高时可适当稀释)
如图1所示，从鲤肠道内容物中分离出的菌株HLM-9的菌液在滴加Salkowski比色液后，室温避光条件下1mL玻璃瓶中颜色变成淡红色，说明菌株HLM-9具有产生长素的能力，对植物的生长具有一定的促生作用。对菌株HLM-9的产IAA能力定量检测中，结果表明用含L色氨酸的LB液体培养基，接种菌株HLM-9，30℃，180rpm培养24h后，菌株HLM-9每毫升菌液中产66.24μg IAA。菌株IAA分泌能力较强。
3、菌株HLM-9解有机磷能力鉴定
将菌株HLM-9接种于蒙金娜有机磷细菌培养基的平板上。每个梯度重复3次，置于28℃培养24-48h。菌株HLM-9接种在蒙金娜有机磷培养基上，培养一段时间后的菌落周围形成极为明显的溶有机磷圈，如图2所示，采用十字交叉法测量，菌株HLM-9的溶有机磷圈直径D为18.82mm，菌落直径d为4.51mm，D/d为4.17，说明菌株HLM-9具有较强的解有机磷功能。
4、菌株HLM-9解无机磷能力的鉴定
将菌株HLM-9用灭菌牙签分别接种于蒙金娜无机磷细菌培养基的平板上。每个梯度重复3次，置于28℃培养24-48h。菌株HLM-9接种在蒙金娜无机磷培养基上，培养一段时间后菌落周围形成明显的溶无机磷圈，如图3所示，采用十字交叉法测量，菌株HLM-9的溶无机磷圈直径D为8.01mm，菌落直径d为3.10mm，D/d为2.58，说明菌株HLM-9具有一定的解无机磷功能。
5、菌株HLM-9产DDP-IV抑制剂的鉴定
将菌株HLM-9接种在SKM培养基上，28℃培养48h后菌落周围形成明显的水解圈，菌株HLM-9的水解圈直径D为18.72mm，菌落直径d为4.31mm，D/d为4.34(如图4所示)，菌株HLM-9有产DDP-IV抑制剂的能力。
对菌株HLM-9进一步试验：在96孔板中，准确滴加25μL，1.6mmol/L甘氨酰－脯氨酰－对硝基苯胺和25μL CFS。在37℃下反应15min，再加入50μL，0.01U/mL DDP-IV，在37℃继续反应1h，最后加入100μL 1mol/L醋酸钠缓冲溶液(pH＝4.0)终止反应，使用酶标仪在405nm处检测反应溶液的吸光值。DDP-IV抑制率计算公式：
Figure BDA0003953149800000041
Where，X为25μL样品+25μLGly-pro-phy+50μLDDP-IV+100μL醋酸钠，P为25μL样品+50μLTris-HCl+25μLGly-pro-phy+100μL醋酸钠，S为25μLTris-HCl+25μLGly-pro-phy+50μLDDP-IV+100μL醋酸钠，T为75μLTris-HCl+25μLGly-pro-phy+100μL醋酸钠。
菌株HLM-9在37℃时DDP-IV抑制剂产率高达53.28％，说明菌株HLM-9具有较强的产DDP-IV抑制剂的能力。
6、菌株HLM-9的鉴定
生理生化鉴定：将保藏后的菌株HLM-9菌株在固体LB培养基平板上三区划线，分离出单菌落并对其形态进行描述，根据《常用细菌系统鉴定手册》对菌株进行革兰氏染色以及生理生化鉴定。
菌株HLM-9的部分生理生化指标见表1，根据在LB固体培养基上的菌落特征为：菌落形态为球形或者椭圆形(略微不规则)，菌落颜色为乳白色，表面隆起且湿润、光滑、黏稠以接种环挑之，出现拉丝现象，主要以单细胞形式存在，偶有二联体或者链状，革兰氏阴性细菌。《伯杰氏细菌鉴定手册》对芽孢杆菌属生理特征的描述，HLM-9与产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)模式种的生理生化具有相同特征，由各项生理生化推断菌株HLM-9可能为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。
表1菌株HLM-9生理生化结果
Figure BDA0003953149800000051
16S rRNA鉴定：选用北京索莱宝生物科技公司的细菌基因组DNA提取试剂盒，提取分离纯化后的菌株DNA。采用细菌通用引物27F/1492R进行PCR扩增，PCR扩增体系为25μL体系：10×缓冲液2.5μL，Taq酶0.5μL，引物27F 0.5μL，引物1492R 0.5μL，DNA模板1μL，ddH2O20μL。反应程序设定为95℃预变性5min；94℃变性50s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环次数30次，72℃再延伸10min，4℃保存。将PCR扩增产物送往RuiBiotech公司测序。通过NCBI数据库比对菌株16S rRNA的测序结果，并构建系统进化树。
对16S rRNA序列进行测序后，在NCBI中进行BLAST比对发现菌株HLM-9的16SrRNA基因序列与产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)相似度为99％。由图5可知，菌株HLM-9的系统发育树可以看出菌株HLM-9与产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(NR_112010.1)同处最小的一个分支，进化距离较近，综合生理生化指标将菌株HLM-9鉴定为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。
7、产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9抗逆性检测
①耐酸性能检测：将产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9接种到pH为2.0、3.0、4.0的LB液体培养基中，初始孢子数为2×108cfu/mL，3h后吸取菌液涂板，37℃培养24h后，测定其孢子数，并计算菌株的存活率。
产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9耐酸性如表2所示，说明产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9具有优异的耐酸性。
②耐胆盐检测：将产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9吸取1mL菌液(初始孢子数为2×108cfu/mL)放于灭菌过的平皿内，然后用含0.5％、1.0％和1.5％牛胆酸钠的LB固体培养基倾注平板，同时用不含牛胆酸钠的MRS固体培养基作为对照组，37℃培养48h，进行菌落计数，并计算菌株的存活率。
产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9耐胆盐能力如表2所示，说明产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9具有优异的耐胆碱能力。
表2产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9耐酸性和耐胆盐能力检测
Figure BDA0003953149800000061
③溶血实验
溶血分为α溶血(不完全性溶血，产生草绿色溶血环)、β溶血(完全性溶血，呈界限分明、无色透明的溶血环)以及不溶血。
在每个新鲜的血平板上划线接种产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9，30℃培养48h后观察。产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9溶血实验结果为阴性，初步说明产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9没有人畜致病的风险。
具体实施方式二：本实施方式配制产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9菌液。
黄豆芽100g加水1000mL，煮沸1h，过滤后补足水分至1L，121℃湿热灭菌后存放备用，此即质量分数为10％的豆芽汁。
产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9菌液培养基由1000mL质量分数为10％的豆芽汁、9.25g葡萄糖、2.71g肉蛋白胨、1.88g硝酸铵和0.82g氯化锰组成。
以0.3％的接种量将产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9种子液接种于Klebsiella oxytoca HLM-9菌液培养基，37℃、180r/min、培养24h，产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9菌液的活菌数达到1.79×109cfu/mL(而产酸克雷伯氏菌HLM-9种子液的活菌数为7.27×108cfu/mL，产酸克雷伯氏菌HLM-9种子液是接种在LB液体培养基中制成)。
实施例1水稻萌发实验
按照具体实施方式二的方法制备产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9菌液分别稀释至菌体浓度为2.0×104cfu/mL和2.0×105cfu/mL，作为菌液，备用。
选用水稻LJ31作为供试水稻，各处理组分别选取形态饱满、大小一致的水稻种子，用70％乙醇浸没种子消毒15min，再用无菌水冲洗三次去除乙醇残留。消毒后的水稻种子置于100mL锥形瓶中，加入相应的浸种溶液50mL，置于28±0.5℃培养箱中浸种2天，再催芽2天后，将发芽一致的种子置于水培盒中，放入植物光照培养箱进行28℃常温培养14天。
设置3组处理：
对照组：浸种溶液为无菌水；
104组：浸种溶液为菌体浓度为2.0×104cfu/mL产酸克雷伯氏菌Klebsiellaoxytoca HLM-9菌液；
105组：浸种溶液为菌体浓度为2.0×105cfu/mL产酸克雷伯氏菌Klebsiellaoxytoca HLM-9菌液。
其中，植物光照培养箱内昼/夜光照时长12h/12h，光强12000lx，植物光照培养箱内湿度设置为60％。
在水培盒培养条件下，各处理的生长情况如图6所示，104组和105组的水稻生长状况明显优于对照组，并且促生长效果与浸种溶液中产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytocaHLM-9的浓度呈正相关关系。从表3中可以看出，105组根长较104组和对照组分别提升了18.66％和38.07％；105组地上部较104组和对照组分别提升了13.83％和31.06％；105组鲜重较104组和对照组分别提升了16.99％和24.23％；105组干重较104组和对照组分别提升了17.15％和30.86％，进而说明产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HLM-9能大幅度提升水稻幼苗的地上部、根长、鲜重和干重，有利于水稻植株的萌发。
表3产酸克雷伯氏菌HLM-9对水稻幼苗生长的影响，n＝20
Figure BDA0003953149800000081
本发明所述的产酸克雷伯氏菌HLM-9兼具产DDP-IV抑制剂能力、IAA能力、解无机磷、有机磷以及具有较强的抗逆性，对水稻幼苗的萌发有较好效果。

Claims (2)

1.一种用于稻田综合种养的菌株，其特征在于用于稻田综合种养的菌株为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)HLM-9，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC：24991。
2.根据权利要求1所述菌株在稻田综合种养中的应用。
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杨丽娟等.产酸克雷伯氏菌提高玉米幼苗耐盐碱胁迫的机理.《植物营养与肥料学报》.2021,第27卷(第6期),全文. *

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