CN108587970A - 一种产酸克雷伯氏菌及其在促进潞党参生长中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产酸克雷伯氏菌，其分类命名为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，菌株号LDS17，已保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2017583，保藏日为2017年10月16日。本发明菌株通过富集培养，可以在以1‑氨基环丙烷‑1‑羧酸(ACC)为惟一氮源的培养基中正常生长，且具有较强的ACC脱氨酶活性和其他促生特性(产IAA、嗜铁素、产HCN、产NH₃、固氮和溶磷)；该菌株制成菌剂接种于潞党参盆栽幼苗，结果表明，该菌剂能明显促进其生长发育。干旱胁迫下接种菌株LDS17有效促进潞党参的生长及其抗旱性。因此，本发明能为将来开发潞党参专用微生物肥料提供优良的菌株资源。

Description

一种产酸克雷伯氏菌及其在促进潞党参生长中的应用

技术领域

本发明属于生物肥料领域中的微生物肥料技术领域，具体涉及一种潞党参根际高效产ACC脱氨酶产酸克雷伯氏菌及其应用。

背景技术

中药党参为桔梗科植物党参(Codonopsis pilosula)的干燥根，有增强免疫力、扩张血管、降压、改善微循环、增强造血功能等作用(关琳静等，2015)。党参为我国常用大宗中药材之一，道地药材为山西潞党参。潞党参主产于山西省东南部的晋城、长治等地区，特别是晋城市陵川县占县域总面积70％的东部山区，这里气候冷凉，昼夜温差较大，所产党参品质上乘，历来就是潞党参的主产区之一。党参轮作现象严重，常年采收易造成地力衰退，再加上我省常出现季节性干旱、低温和土壤污染等非生物逆境，而其喜凉爽、湿润的习性，更易遭受逆境的胁迫，影响党参的正常生长，降低产量与品质。目前，主要靠增施肥料、改进栽培、培育抗性品种等措施来防止地力衰退和提高党参抗逆能力(李晓霞等，2012)。但这些措施存在投入大、周期长、见效慢或环境风险等问题。而且化肥的大量使用会引起水体和土壤污染、土壤板结等一系列环境问题。另外，我国中药材生产质量管理规范(GAP)给中药材栽培提出了高要求，严防高毒农药、化肥影响药材品质安全，确保药材质量达到安全、有效、稳定、可控及优质无公害的要求。因此，有必要利用其自身的代谢特点探寻新的生物学措施来提高逆境条件下我省重要道地药材-潞党参的丰产栽培。

山西省地处华北生态环境脆弱地带，属干旱、半干旱气候，受水文气象条件的制约，年降水量从北向南约为350～700mm，且分布不均匀，多集中于7～9月份，因此干旱成为山西省药用植物种植产业可持续发展的主要障碍之一(武建凯等，2010)。干旱胁迫会影响中药材的生长发育，并进一步抑制其分泌次生代谢产物。据报道，在干旱胁迫下，植物体内活性氧代谢系统失调，导致其根系的乙烯代谢明显增强，而乙烯含量的异常增加会抑制植物生长，加快叶片成熟、衰老和死亡，降低叶片光合作用，从而降低其产量，并且会阻碍植株在胁迫因子消除后的复原(Zahir等，2008)，具体表现为可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸以及保护酶活性的变化。

含有1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶活性的植物根际促生菌是一类能够通过吸收、分解植物根系分泌出的ACC，并利用其分解产物α-丁酮酸和氨分别作为C源和N源，促使根系不断的向外分泌ACC，从而降低根系中ACC和应激乙烯的水平，减轻逆境下乙烯对植物的伤害，促进植物生长发育，提高植物产量的有益微生物(Farzad et al.，2009)。并且，这些根际细菌往往能通过产生3-吲哚乙酸(IAA)和嗜铁素等促生因子，来直接或间接地促进药用植物生长发育、提高其抗逆能力。冯维维等江苏沿海滩涂盐生药用植物中华补血草(Limonium sinense)根际分离筛选出多种促生特性(固氮、溶磷、产IAA)的ACC脱氨酶细菌，具有一定研究价值(冯维维等，2016)；田磊等从人参(Panax ginseng C.A.Mey)内生菌中获得了一株具有较高ACC脱氨酶活性的菌株JJ8-3，且具有解磷特性、固氮潜能和产生嗜铁素能力，并证明能明显促进人参种子及根部的生长(田磊等，2014)；但到目前为止，关于潞党参促生菌的研究还较少，而且，对接种产ACC脱氨酶细菌潞党参在干旱胁迫下的膜脂过氧化作用、可溶性蛋白含量以及保护酶活性的研究更是鲜见报道，而明确这些生理指标对干旱胁迫下接种产ACC脱氨酶细菌对提高潞党参抗旱性具有重要意义。因此，分离筛选获得具有促生抗逆性能的微生物并研制成菌肥加以应用对于发展潞党参产业刻不容缓。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种潞党参根际高效具ACC脱氨酶活性的产酸克雷伯氏菌。

本发明还要解决的一个技术问题是提供上述产酸克雷伯氏菌的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

2016年7月15日从山西省陵川县的潞党参根际土壤中，筛选获得了一株具ACC脱氨酶活性的产酸克雷伯氏菌，其分类命名为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，菌株号LDS17，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2017583，保藏日为2017年10月16日。

菌株LDS17的主要生物学特征：在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，菌落凸起，白色，中心不透明，边缘光滑湿润；菌体短杆状，革兰氏染色阴性，大小约(0.5～0.8)μm×(1～2)μm，无芽孢，无鞭毛；好氧，氧化酶反应阴性，接触酶反应阳性，淀粉水解阴性，M.R.和吲哚试验阳性，V.P.试验阴性；油脂水解实验阴性，纤维素分解实验阴性，产氨试验阳性，柠檬酸盐生长试验阳性。

Biolog公司根据细菌代谢的氧化-还原过程，于1989年推出了用于细菌鉴定的Biolog自动鉴定系统。该系统利用细菌对95种碳源的代谢情况来鉴定菌种，即每种细菌形成各自特有的代谢指纹图谱，选用四唑紫作为细菌能否利用供试碳源的指示剂。与传统方法相比，Biolog系统具有自动化和标准化程度高、结果快速准确和操作简便等优点。Biolog细菌鉴定系统已广泛应用于细菌快速鉴定。通过BiologGenIII系统对LDS17进行鉴定，该菌株在鉴定板培养16～24h时的读数相似值(SIM值)为0.711，大于0.50，符合Biolog系统关于理想结果的要求，而且鉴定结果的相似性(PROB)都为99％，因此该菌株利用Biolog系统，准确鉴定到了种，为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。

CCTCC NO：M 2017583菌株16SrDNA基因序列，见SEQ ID No.1所示。

将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，能在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。与LDS17菌株相似性最高的是Klebsiella oxytoca，同源性达到99％。构建进化树发现，LDS17与Klebsiella oxytoca同属一个遗传分枝，亲缘关系十分接近。结合形态、生理生化特征、Biolog GenIII鉴定系统及16SrDNA序列分析，鉴定为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。

产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)LDS17菌株具有产IAA、产嗜铁素、产NH₃、产HCN和溶无机磷等能力。

上述产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)LDS17菌株发酵生产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶中的应用也在本发明保护范围之内，其ACC脱氨酶活性最高的最佳发酵条件如下：

(1)培养基条件的优化：温度：30℃；时间：24h；pH：6；转速：150r/min。

(2)培养基组分的优化：碳源：果糖；氮源：蛋白胨；无机盐：氯化钠。

上述产酸克雷伯氏菌在促进潞党参生长中的应用也在本发明的保护范围之内。CCTCC NO：M 2017583菌株可将降解乙烯合成的前体物质1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)，进而减少过量乙烯的合成，促进潞党参生长，增加盆栽幼苗的抗旱性。

有益效果：本发明的潞党参根际土壤产ACC脱氨酶细菌产酸克雷伯氏菌CCTCC NO：M 2017583具有较强的产ACC脱氨酶活性，且同时具有产IAA、产嗜铁素、产NH₃、产HCN和溶无机磷等能力。本发明的潞党参根际土壤产ACC脱氨酶细菌产酸克雷伯氏菌CCTCC NO：M2017583制成菌剂接种潞党参幼苗。结果表明，该菌剂能明显促进潞党参的生长发育，而且干旱胁迫下接种菌株LDS17可以较对照组提高潞党参盆栽苗POD、CAT和SOD活性，增加可溶性蛋白含量，降低MDA含量，促进幼苗生长，从而有效提高潞党参的抗干旱能力。因此，本发明为将来开发潞党参专用微生物肥料提供了优良的菌株资源。

附图说明

产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)LDS17，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，菌种保藏号：CCTCC NO：M 2017583，保藏日为2017年10月16日。

图1为LDS17菌株菌落形态。

图2为LDS17菌株菌体电镜照片。

图3为LDS17菌株在CAS培养基上的黄绿色晕圈(A)和分泌IAA能力的定性检测照片(B)。

图4为LDS17菌株对潞党参盆栽幼苗的促生效果。

具体实施方式

根据下述实施例，可以使本领域的技术人员更好地理解本发明。实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：菌株LDS17的ACC脱氨酶活性测定。

(1)将菌株LDS17接入50mL TSB培养基，28℃200r/min振荡培养24h后，吸取1mL菌悬液至50mL TSB培养基，28℃200r/min扩大培养24h后，4℃9000r/min离心10min，并收集菌体。

(2)用DF液体培养基不加[(NH₄)₂SO₄]将菌体离心洗涤2次，重悬于25mLADF培养基中，28℃200r/min培养48h以诱导其产生ACC脱氨酶，将菌悬液于4℃9000r/min离心10min，弃上清，收集菌体并记录菌体重量，再用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值＝7.6)将菌体离心洗涤2次。

(3)将菌体重悬于600μL含有30μL甲苯的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值＝8.5)中，迅速振荡30s以破碎细胞，即为粗酶液。取上述100μL粗酶液，4℃贮存，用于蛋白测定；其余粗酶液需立即用于ACC脱氨酶活性测定。

(4)取200μL粗酶液加入到20μL 0.5mol/L ACC中混匀，于30℃条件下水浴15min。随即加入1mL 0.56m_ol/L的HCl终止反应，同时以不加粗酶液为对照组，每个处理设3个重复，12000r/min离心5min，取上清液。

(5)每1mL上清液加入800μL 0.56mol/L HCl和300μL 0.2％2，4-二硝基苯肼溶液(2mol/L HCl中溶解)，30℃保温30min后，加入4.5mL 2mol/L NaOH混匀，540nm下测定吸光度值。

(6)绘制α-酮丁酸标准曲线：取0.102g α-酮丁酸溶于10mL 0.1mol/L Tris-HCl(pH值8.5)，配制成100mmol/L的α-酮丁酸母液。使用前先将母液浓度稀释为10mmol/L，分别取0、10、20、40、60、80、100、120μL 10mmol/L的母液稀释液加入试管中，用0.1mol/L Tris-HCl(pH值8.5)补足至1mL，α-酮丁酸浓度范围为0.024～0.293μmol/mL。

(7)使用Bradford蛋白定量试剂盒定量测定蛋白质，以牛血清蛋白作为标准蛋白质做标准曲线。ACC脱氨酶活力以反应体系中每毫克酶蛋白每小时生成α-酮丁酸的μmol量表示，酶活力单位为α-酮丁酸μmol/(mg·h)。

从表1可以看出，LDS17菌株产生的ACC脱氨酶活性为6.27U/mg，其活性较空白对照高94.26％。

表1菌株LDS17ACC脱氨酶活性测定

实施例2：LDS17菌株的促生特性

(1)产嗜铁素能力测定

在CAS培养基上对LDS17菌株进行点接种，28℃培养48～72h，如菌株周边有黄绿色晕圈产生，及证明该菌株具产嗜铁素能力。

(2)溶无机磷能力测定

在NBRI-BPB培养基上对LDS17菌株进行点接种，28℃培养48～72h，如菌株周边有透明圈产生，及证明该菌株具溶无机磷能力。用接种环挑取该细菌菌株，接种于装有20mLNBRI-BPB培养基的100mL三角瓶中，以未接菌空白NBRI-BPB培养基为对照，30℃，180r/min振荡培养3d，发酵液(4℃，12000r/min)离心10min，在波长600nm处测定上清液OD₆₀₀值，对其溶磷能力进行初步分级。分级标准为溶磷能力强(+++)：OD₆₀₀≤-1；较强(++)：-1＜OD₆₀₀≤-0.5；弱(+)：-0.5＜OD₆₀₀≤-0.1。

(3)产植物生长素IAA能力测定

S1比色液的配制：准确称取12g FeCl₃溶于300mL去离子水中，然后缓慢加入429.7mL浓硫酸，冷却后定容至1L，测定范围为0.3～20mg/L。

S2比色液的配制：将称量好的4.5g FeCl₃溶于300mL去离子水中，慢慢加入587.4mL浓硫酸，冷却后定容至1L，测定IAA范围为5～200mg/L。

IAA定性测定方法：

采用Salkowski比色法测定待测菌株分泌IAA能力。将待测菌株接种在NA液体培养基中培养12h(28℃、120r/min)后，用无菌水调节OD值为0.05，各取0.1mL五株菌株菌悬液分别接种到不含色氨酸的King培养液和含有100mg/L的色氨酸King培养液中，每个三角瓶装50mL的培养液，重复3次，以加0.1mL无菌水的培养液为空白对照，一起置于28℃、120r/min的摇床上振荡培养7d。分别取菌悬液和空白对照500μL，各加入500μL比色液，每个处理设3个重复，室温下静置15min观察其颜色变化，实验组均变红则为阳性，表示能分泌IAA；颜色越深表示分秘数量越多；实验组均不变色为阴性，表示不分泌IAA。

IAA定量测定方法：

取1mL菌悬液接种到准备好的50mL的King+色氨酸液体培养基中，取培养液2mL，12000r/min离心15min，每1mL上清液加2mL S2试剂，室温暗处显色30min后，于530nm处测定OD值，以空白培养基作对照。

(4)产HCN能力测定

待测菌株划线于含4.4g/L甘氨酸的LB固体培养基上，同时在培养基上平铺浸有2％的Na₂CO₃和0.5％的2，4，6-三硝基苯酚溶液的滤纸并密封，28℃培养4d，若滤纸由橘黄色变为红色则证明有HCN产生。

(5)产NH₃测定

待测菌株接种到10mL 10g/L蛋白胨溶液试管，28℃培养2～3d，每管加0.5mLNessler’s试剂，若出现黄色反应则证明该菌株为产NH₃阳性反应。

(6)固氮能力测定

待测菌株划线于Ashby无氮固体培养基，28℃培养2～3d，若菌株能正常生长，则说明该菌株具有固氮能力。

对供试菌株LDS17进行产IAA、嗜铁素、产NH₃、产HCN、固氮和溶磷等促生特性的研究，发现该菌株点接种在CAS培养基上28℃培养48～72h后，菌株周边有黄绿色晕圈产生；划线于Ashby无氮固体培养基，28℃培养48～72h后，菌株能正常生长；菌株接种到10mL 10g/L蛋白胨溶液试管，28℃培养2～3d，每管加0.5mL Nessler’s试剂，可以出现黄色反应；菌株划线于含4.4g/L甘氨酸的LB固体培养基上，同时在培养基上平铺浸有2％的Na₂CO₃和0.5％的2，4，6-三硝基苯酚溶液的滤纸并密封，28℃培养4d，滤纸由橘黄色变为红色；菌株点接种于NBRI～BPB培养基上，28℃培养7d后，菌株周边有透明圈，具有溶磷能力，且上清液在600nm处的吸光值为-0.875，溶磷等级为++；通过定性和定量均证明该菌株具有分泌IAA的能力，且浓度达到8.771mg/L(表2)。以上说明该菌株具有产IAA、嗜铁素、产NH₃、产HCN、固氮和溶磷等多种促生特性，是一株非常有潜力的植物促生菌。

表2潞党参根际土壤产ACC脱氨酶细菌的促生特性

注：“-”表示阳性；“+”表示阴性

实施例3：LDS17温室盆栽试验：

将菌株LDS17活化后，用接种环挑取少量菌体接种于装有50mL NA培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4)的100mL三角瓶中，28℃，200r/min振荡培养24h。发酵液(4℃，10000r/min)离心10min，收集菌体，无菌生理盐水润洗菌体3次后，无菌生理盐水调节菌悬液(10⁸cfu/mL)制成接种剂。接种潞党参幼苗，以等量无菌生理盐水为对照，接种量为5mL/株。每处理10个重复，置于温室统一管理，光照为12h/天，适时浇水。

潞党参接种后30d和60d生长情况见表3，可以看出，接种LDS17能够显著促进潞党参的生长。不同时间段接种产ACC脱氨酶菌株LDS17与对照处理对其幼苗的苗高、地径和生物量的影响如表3所示。30d、60d时，接种处理潞党参幼苗的苗高、地径和生物量均显著高于对照。图4为潞党参接种LDS17后30d和60d时的照片，可以看出接种后的潞党参明显高于对照。

表3接种菌株LDS17对潞党参幼苗生长的影响

注：P＜0.05，同列不同行小写字母不相同代表差异显著

实施例4：干旱胁迫下接种菌株LDS17对潞党参幼苗生理指标的测定：

挑取大小一致饱满无病害的潞党参种子经表面消毒后播种于塑料小杯中，每杯播种5粒，培养60d，每天补充水分，60d后开始进行干旱处理20d，实验设两个处理：①正常水分处理：土壤含水量为田间最大持水量的70％；②干旱胁迫处理：土壤含水量为田间最大持水量的35％。每个处理设10个重复。分别称取实验组与对照组0.1g新鲜叶片于pH＝7.0的磷酸缓冲液中研磨成浆，并定容到5mL，4℃10000rpm离心20min取上清，4℃条件下保存用于酶活测定。测定指标包括：(1)苗高；(2)丙二醛(MDA)含量；(3)可溶性蛋白测定；(4)过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性。

由表4可知，正常处理条件下接种组MDA含量较不接种组降低了6.13％，干旱处理条件下接种组MDA含量较不接种组降低了21.07％，且差异显著(P＜0.05)，说明经干旱处理20d后，叶片中膜脂过氧化物MDA大量积累，使得干旱条件较正常条件下叶片中MDA含量高。干旱条件下接种菌株LDS17较正常水分处理条件下MDA含量有所降低，说明接种菌株LDS17可以缓解因干旱胁迫造成的植物膜系统损伤，从而保护细胞膜结构。干旱胁迫条件下接种菌株LDS17对潞党参株高具有一定影响，正常处理条件下接种组株高较不接种组增加了3.95％，干旱处理条件下接种组株高较不接种组增加了6.12％，且差异显著(P＜0.05)。干旱胁迫条件下接种菌株LDS17可以增加潞党参可溶性蛋白含量，正常处理条件下接种组可溶性蛋白含量与不接种组无差异，干旱处理条件下接种组可溶性蛋白含量较不接种组增加了12.23％，且差异显著(P＜0.05)。

接种产ACC脱氨酶的PGPR的作用机理主要是靠降低植物体内乙烯水平的途径来实现的。本试验中正常处理条件下接种组的SOD、POD和CAT活性分别较不接种组增加了0.42％、4.48％和2.62％，干旱处理条件下接种组SOD、POD和CAT活性分别较不接种组增加了6.24％、12.15％和20.49％(P＜0.05)。以上结果表明接种菌株LDS17能提高SOD、POD和CAT活性以清除由于干旱逆境所产生的过量活性氧，从而提高潞党参的耐旱能力。

表4不同接种处理条件下对潞党参生理指标影响

序列表

<110> 长治学院

<120> 一种产酸克雷伯氏菌及其在促进潞党参生长中的应用

<130> 18WS1V0010041

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1274

<212> DNA

<213> Klebsiella oxytoca

<400> 1

acgccgatga catgattacg ccagcttgca tgcctgcagg tcgacgatta cggctacctt 60

gttacgactt caccccagtc atgaatcaca aagtggtaag cgccctcccg aaggttaagc 120

tacctacttc tttcgcaacc cactcccatg gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg 180

aacgtattca ccgtggcatt ctgatccacg attactagcg attccgactt catggagtcg 240

agttgcagac tccaatccgg actacgacat actttatgag gtccgcttgc tctcgcgagg 300

tcgcttctct ttgtatatgc cattgtagta cgtgtgtagc cctactcgta agggccatga 360

tgacttgacg tcatccccac cttcctccag tttatcactg gcagtctcct ttgagttccc 420

ggccggaccg ctggcaacaa aggataaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat 480

ttcacaacac gagctgacga cagccatgca gcacctgtct cacggttccc gaaggcacca 540

aagcatctct gctaagttcc gtggatgtca agagtaggta aggttcttcg cgttgcatcg 600

aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcatttg agttttaacc 660

ttgcggccgt actccccagg cggtcgactt aacgcgttag ctccggaagc cactcctcaa 720

gggaacaacc tccaagtcga catcgtttac agcgtggact accagggtat ctaatcctgt 780

ttgctcccca cgctttcgca cctgagcgtt agtctttgtc cagggggccg ccttcgccac 840

cggtattcct ccagatctct acgcatttca ccgctacacc tggaattcta cccccctcta 900

caagactcca gcctgccagt ttcgaatgca gttcccaggt tgagcccggg gatttcacat 960

ccgacttgac agaccgcctg cgtgcgcttt acgcccagta attccgatta acgcttgcac 1020

cctccgtatt accgcggctg ctggcacgga gttagccggt gcttcttctg cgggtaacgt 1080

catcgacagc tataccttat cgcttcctcc cgctgaagta ctttacaccc gagctctcat 1140

acacgcgcat gctgcatcag cttgcgccat tgtgcatatt cccactgctg cctccgtagg 1200

actgacggat tcagcttcca gtggctgtca tctctctcga aacgagctag gaatctgcgc 1260

tcgccctaag ttga 1274

Claims (3)

1.一种产酸克雷伯氏菌，其分类命名为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，菌株号LDS17，已保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2017583，保藏日为2017年10月16日。

2.权利要求1所述的产酸克雷伯氏菌在促进潞党参生长中的应用。

3.权利要求1所述的产酸克雷伯氏菌在发酵生产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶中的应用。