CN103146610B

CN103146610B - 一株植物根际促生菌及其应用

Info

Publication number: CN103146610B
Application number: CN201310079130.4A
Authority: CN
Inventors: 李辉信; 虞丽; 闫小梅; 叶成龙; 姜瑛; 胡锋; 焦加国; 徐莉; 刘满强; 陈小云
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2013-03-12
Publication date: 2014-08-20
Anticipated expiration: 2033-03-12
Also published as: CN103146610A

Abstract

本发明属于农业微生物领域，涉及一株根际促生菌及其应用。该植物根际促生菌（Pseudomonas fluorescens Y1），于2013年1月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类名为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），保藏号CGMCC No.7130。该菌株利用难溶性磷酸盐为磷源进行生长能力强，可以提高肥料的利用率，促进植物根系发育和对肥料的吸收，增加植株体磷含量：本发明针对花生具有良好的促进生长效果，菌株高效的解磷作用促进花生的生长发育和对磷肥的利用率。

Description

一株植物根际促生菌及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物领域，涉及一株根际促生菌及其应用。

背景技术

潮土是河流沉积物受地下水运动和耕作活动影响而形成的土壤，因有夜潮现象而得名。在中国，多分布于黄河中、下游的冲积平原及其以南江苏、安徽的平原地区和长江流域中、下游的河、湖平原和三角洲地区。潮土分布区地势平坦，土层深厚，水热资源较丰富，造种性广，是我国主要的旱作土壤，盛产粮棉。但潮土分布面积最大的黄淮海平原，旱涝灾害时有发生，尚有盐碱危害，加之土壤养分低或缺乏，大部分属中、低产土壤，作物产量低而不稳。必须加强潮土的合理利用与改良。

在土壤中许多微生物能够溶解难溶态磷，促进植物对磷的吸收，增加作物产量和改善作物品质，将解磷微生物作为生物肥料，不但可以提高土壤中磷的利用效率，节肥增产，而且可改善土壤结构，提高土壤有机质含量。植物促生菌Plant growth-promoting rhizobacteria，简称PGPR)被界定为在一定条件下有利于植物生长的自由生活在土壤、根际、根表、叶际的细菌。这些细菌能够固氮、溶磷、溶铁，并产生植物激素，如生长素、赤霉素、细胞分裂素和乙烯。此外，它们还能提高植物的抗逆性，包括干旱、高盐、重金属毒害和农药。但现在大部分植物促生菌还为被驯化成可有效应用于促进植物生长并具有较好固氮溶磷效果的菌种，未必适应潮土的土壤环境。因此从潮土中分离得到植物促生菌，和作物形成共生体系，利用生物修复改善潮土，成为当前研究的热点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种根际促生菌，可以在潮土环境中有效促进作物生长，同时可将难溶性磷酸盐转化为可被生物利用的可溶性磷酸盐；本发明的另一个目的是提供一种根际促生菌在花生栽培上的应用。

本发明的目的可以通过以下的技术方案实现：

植物根际促生菌Y1，分类命名为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），于2013年1月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.7130。

所述植物根际促生菌Y1，菌落较小、圆形、扁平稍隆起、光滑、湿润。严格好氧，化能异养。最适生长温度为30℃。接触酶阳性，硝酸还原阴性。解磷能力强，能以难溶性磷酸盐为磷源进行生长，并将其转化为可溶性磷酸盐。

本发明所述的植物根际促生菌培养时使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵；使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、木糖、甘露醇、麦芽糖；使用的无机组分包括但不限于氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、氢二钾、磷酸三钙、二水氯化钙、七水合硫酸镁、七水和硫酸亚铁。本发明的根际促生菌发酵可在28～32℃环境下进行，其最适生长pH为6～8。

所述植物根际促生菌利用难溶性磷酸盐为磷源进行生长的能力强。

本发明所述的植物根际促生菌能利用难溶性磷酸盐为磷源进行生长，并将其转化为可溶性磷酸盐。在实验室摇瓶条件下，所述的植物根际促生菌对磷酸三钙的转化量达424.92mg/L。相对于采用灭活菌作为空白对照的结果，所述植物促生菌对磷酸三钙的转化量比空白对照高出392.17mg/L（图1）。作为本发明的优化方案，所述植物根际促生菌的发酵在pH6-8下进行时，其将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐效果最佳。

有益效果：本发明的一株植物根际促生菌Y1（CGMCC No.7130）可有效将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐，提高肥料的利用率，促进植物根系发育和对肥料的吸收，增加植物体磷含量；本发明针对花生具有良好的促生长效果，提高了花生对磷肥的利用效率。

附图说明

图1表示菌株Y1对难溶性磷酸盐的利用情况；

图2表示不同初始pH对菌株Y1溶解难溶性磷酸盐能力的影响；

图3表示不同装液量对菌株Y1溶解难溶性磷酸盐能力的影响；

图4表示不同碳源对菌株Y1溶解难溶性磷酸盐能力的影响；

图5表示不同氮源对菌株Y1溶解难溶性磷酸盐能力的影响；

图6表示土壤中接种菌株Y1并种植花生30天后对花生株高的影响；

图7表示土壤中接种菌株Y1并种植花生30天后对花生地上部鲜重的影响；

图8表示土壤中接种菌株Y1并种植花生30天后对花生地上部干重的影响；

图9表示土壤中接种菌株Y1并种植花生30天后对花生根鲜重的影响；

图10表示土壤中接种菌株Y1并种植花生30天后对花生根干重的影响；

图11表示土壤中接种菌株Y1并种植花生30天后对花生根总长的影响；

图12表示土壤中接种菌株Y1并种植花生30天后对花生根平均直径的影响；

图13表示土壤中接种菌株Y1并种植花生30天后对花生根表面积的影响；

图14表示土壤中接种菌株Y1并种植花生30天后对花生根尖数的影响；

图15表示土壤中接种菌株Y1并种植花生30天后对土壤有效磷含量的影响；

图16表示土壤中接种菌株Y1并种植花生30天后对花生植株全氮含量的影响；

图17表示土壤中接种菌株Y1并种植花生30天后对花生植株全磷含量的影响；

图18表示土壤中接种菌株Y1并种植花生30天后对花生植株全钾含量的影响。

生物材料保藏信息

植物根际促生菌Y1，分类名为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），于2013年1月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No.7130。

具体实施方式

实施例1

首先准备以下几种培养基。

LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.0～7.2，121℃灭菌，20min。

LB液体培养基：不加琼脂，其它条件同上。

无机磷细菌培养基（PKO培养基）：磷酸三钙5g，葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，七水合硫酸镁0.3g，氯化钾0.3g，硫酸锰0.03g，七水合硫酸亚铁0.03g，pH7.0琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.0～7.2，121℃灭菌，20min。

将从南京板桥采取的植物根际潮土挑根过筛后称取l0g置于盛有100ml灭菌水的250ml的三角瓶中，在摇床中，30℃，150r/min振荡20min，静置10min，得到土壤悬浮液。该土壤悬浮液中含有若干种促生菌，采用稀释法稀释后涂于LB培养基，将平板倒置于30℃，恒温箱中培养24h后，挑取不同类型典型单个菌落，经平板纯化后，4℃保存在LB斜面待用。

下面再通过定性测定和定量测定筛选出有解磷能力的植物促生细菌。

定性测定：将纯化后的菌株接种到无机磷细菌培养基（PKO培养基）中，30℃下培养96h，可以看到有明显的菌落，初步判断为有一定的解磷能力，将具有解磷能力的菌种进入下一轮的定量测定。

定量测定：对初步筛选获得的解磷细菌进行定量测定，将已经纯化得到的解磷菌接种于盛有50mL的无机磷细菌培养基的250mL三角瓶中，30℃，180r/min培养96h后，将培养液装入离心管中，4℃下10000r/min离心，15min，收集上清液用钼蓝比色法测定发酵液中有效磷的含量。

通过以上测定即可筛选出解磷能力强的菌株。

将上述方法筛选分离出的菌株Y1，经上海英俊生物工程有限公司测序根据16SrDNA的测序结果，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov在线查询分析，利用Blast软件在GenBank中与其它的16SrDNA序列进行同源性比较，选择相近的序列与Y1的序列用MEGA version3软件构建Y1的16SrDNA系统进化树。根据该菌株的生理生化特征，鉴定为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），同源性为99%。该菌株于2013年1月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.7130。

该菌种呈革兰氏阴性、无芽孢的不规则杆状。菌落：较小、圆形、扁平稍隆起、光滑、湿润。严格好氧，化能异养。最适生长温度为30℃。接触酶阳性，硝酸还原阴性。解磷能力强，能以难溶性磷酸盐为磷源进行生长，并将其转化为可溶性磷酸盐。

实施例2

好氧性试验

把灭过菌的LB培养基倒入3个已灭菌的试管中，大约在2/3处，在无菌操作台上，用接种针挑取斜面培养的所述菌，穿刺接种到上述培养基中（必须穿刺到管底）。30℃培养，分别在3天至7天观察结果。在琼脂柱表面上生长者为好氧菌，如沿穿刺线生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌。

植物根际促生菌Y1（CGMCC No.7130）的试验结果表现，菌落沿琼脂柱表面生长，穿刺线内无菌落生长，为严格好氧。

过氧化氢酶的测定

在干净载玻片上滴1滴3%H₂O₂，取18～24h的LB斜面培养物1环，在H₂O₂中涂抹，若有气泡产生则为阳性，否则为阴性。

植物根际促生菌Y1（CGMCC No.7130）的试验结果为接触酶阳性。

甲基红试验（M.R试验）

a.培养基及试剂：蛋白胨5g，葡萄糖5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，调节pH7.0～7.2，分装试管，每管装4～5mL，121℃灭菌20min。试剂：甲基红0.1g，95%酒精300mL，蒸馏水200mL。

b.菌种培养及结果观察接种菌株于上述培养液中，30℃培养l～2天。在培养液中加入几滴甲基红试剂，如培养液呈现红色，为甲基红阳性，黄色为阴性（甲基红变色范围4.4红色～6.0黄色）。

植物根际促生菌Y1（CGMCC No.7130）的试验结果为M.R阴性。

乙酞甲基甲醇试验（VP试验）

a.培养基培养基同甲基红试验。

b.菌种培养及结果观察接种与培养同甲基红试验。做VP试验时，取培养液（约2mL）和等量的40%NaOH相混合，加少量肌酸，充分振荡2～5min后，如培养液出现红色，即为VP阳性。

植物根际促生菌Y1（CGMCC No.7130）的试验结果为VP阴性。

淀粉水解试验

a.培养基及试剂在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装三角瓶，121℃灭菌20min备用。路哥氏碘液：碘片1g，碘化钾2g，先用少量（3～5mL）蒸馏水溶解碘化钾，现加入碘片，待碘完全溶解后，加水稀释至300mL。

b.菌种培养及结果观察取菌种点接于平板上，30℃培养2～4天，形成菌落后，在平板上滴加路哥氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解。透明圈的大小一般说明水解淀粉能力的大小。

植物根际促生菌Y1（CGMCC No.7130）的试验结果为淀粉水解阳性。

明胶水解试验

a.培养基及试剂：蛋白胨5g，明胶120g，蒸馏水1000mL。调节pH7.2～7.4，分装试管，培养基高度约为4～5cm，121℃灭菌20min。

b.菌种培养及结果观察用穿刺法接种在试管中央。在30℃温箱中培养一个月，观察明胶是否液化。

植物根际促生菌Y1（CGMCC No.7130）的试验结果为明胶水解阳性。

硝酸盐还原试验

a.培养基及试剂：蛋白胨10g，硝酸钾1g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.4。格里斯氏（Gries）试剂：A液：对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸（10%左右）150mL；B液：蔡胺0.1g，蒸馏水20mL，稀醋酸（10%左右）150mL。二苯胺试剂：二苯胺0.5g溶于l00mL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释。

b.菌种培养及结果观察将试验菌接种于硝酸盐液体培养基中，30℃培养1、3、5天。在白色瓷盘小孔中倒入少许培养液，然后在其中分别滴1滴试剂A和B液，当培养液变为粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色等时，表示有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性，否则为阴性。

植物根际促生菌Y1（CGMCC No.7130）的试验结果为硝酸盐还原阴性。

柠檬酸盐的利用试验

a.培养基及试剂：柠檬酸钠2g，NaCl5g，MgSO₄·7H2O0.2g，(NH₄)₂·HPO₄1g，1%溴百里香酚蓝水溶液10mL，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH6.8～7.0，121℃灭菌20min。

b.菌种培养及结果观察取幼龄菌种接种于斜面上，30℃培养3～7天，培养基呈碱性（蓝色）者为阳性反应，不变者则为阴性。

植物根际促生菌Y1（CGMCC No.7130）柠檬酸盐利用的试验结果为阳性。

实施例3

为了进一步验证实施例1得到的根际促生菌Y1(CGMCC No.7130)解磷的能力和最适条件，下面针对不同pH、不同装液量、不同碳源、不同氮源对解磷效果的影响。

将无机磷细菌培养基（PKO培养基）分别调节到不同的pH(4、5、6、7、8、9、10)，取50mL装于250mL的三角瓶中，按1%（v/v）接种量接种处于对数生长期的Y1菌后，置于30℃，180r/min摇床培养96h，按定量测定的方法测定Y1菌解磷的效果，结果如图2所示，表明Y1(CGMCC No.7130)在pH为9和10时解磷效果较差，在强碱环境中，菌种无法良好的生长和进行新陈代谢，在微酸微碱环境中Y1菌解磷效果高于酸性环境，该菌种解磷效果最佳的pH为6～8。

将无机磷细菌培养基（PKO培养基）分别按25mL，50mL，75mL，100mL，150mL装入250mL的三角瓶中，按1%(v/v)接种量接种处于对数生长期的Y1菌后，置于30℃，180r/min摇床培养96h，按定量测定的方法测定Y1菌解磷的效果。由于菌株Y1是好养代谢，通气量影响菌株解磷的效果。结果如图3所示，表明在装液量为50mL时，Y1的解磷效果最佳，而装液量为25mL时，Y1的解磷效果最差。

在无机磷细菌培养基（PKO培养基）（不含葡萄糖）分别加入1%(w/v)的碳源，碳源包括葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、木糖醇、麦芽糖。取50mL装于250mL的三角瓶中，按1%(v/v)接种量接种处于对数生长期的Y1菌后，置于30℃，180r/min摇床培养96h，按定量测定的方法测定Y1菌解磷的效果。结果如图4所示，该菌株在供给葡萄糖时，其解磷效果最强，而在供给乳糖时，Y1菌的解磷效果最差。

在无机磷细菌培养基（PKO培养基）（不含硫酸铵）分别加入0.1%(w/v)的氮源，氮源包括蛋白胨、谷氨酸、酵母粉、硫酸铵、硝酸钾、硝酸铵。取50mL装于250mL的三角瓶中按1%(v/v)接种量接种处于对数生长期的Y1菌后，置于30℃，180r/min摇床培养96h，按定量测定的方法测定Y1菌解磷的效果。结果如图5所示，该菌株在供给硝酸铵时，其解磷效果最佳，其次是硫酸铵，但在供给酵母粉时，Y1菌的解磷效果最差。

实施例4

Y1（CGMCC No.7130）对花生具有明显促生长作用，下面通过盆栽试验进行说明。

采集自然条件下0-20cm土层的新鲜潮土，过5mm筛，每盆装土200g，种植花生，调节含水量至田间最大持水量的60%。30天后采样，用根系扫描仪（LA1600+scanner，Canada）扫描获得根系图像后，用根系分析软件（Winrhizo2003b，Canada）进行相关根系指标分析；并测定花生植株的株高、地上部鲜重和干重、根鲜重和干重；土壤速效磷含量；花生植株全氮、全磷、全钾含量。

花生种子：花生种子进行20%双氧水表面消毒20min，无菌水冲洗多次，催芽2天，选取发芽一致的种子备用。

接菌处理：将本发明的菌株Y1（CGMCC No.7130）接种于LB液体培养基，30℃，180r/min摇床培养，培养菌长至对数生长期，然后将菌悬液10000r/min离心10min，再用无菌水重悬，同样操作重复三次，并将菌悬液均匀喷施于土壤中，接种量为10⁸CFU/g，即每克干土接种10⁸CFU的Y1。

对照处理：作为对照，土壤不喷洒Y1菌液，加等量无菌水。

结果如图6～图18所示。从图6～图10可以看出，经接菌Y1处理后，植株的株高、地上部鲜重和干重以及跟的鲜重和干重都有显著增加，明显促进了花生生长；从图11～图14可以看出，接种Y1处理与不接菌处理进行对比，花生根系总长度、根平均直径，根表面积、根尖数都明显增加，菌株Y1促进了花生根系的发育；从图15可以看出，经接菌处理后，土壤有效磷含量略微降低，这可能是因为虽然Y1有解磷的能力，但由于植株吸收了较多的磷，因此土壤中磷含量略有降低；从图16～图18可以看出，经接种Y1处理后，花生植株的全氮、全磷、全钾含量较对照组有明显增加。结合以上结果可以看出，本发明的植物根际促生菌Y1对根基的生长、发育具有明显效果，解磷能力强，可以有效促进作物生长发育。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.植物根际促生菌Y1，分类命名为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），于2013年1月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC NO.7130。

2.权利要求1所述的植物根际促生菌Y1在促进花生生长中的应用。

3.权利要求1所述的植物根际促生菌Y1在花生栽培上的应用。