CN105062910A - 一株杨树根际解磷细菌Pseudomonas frederiksbergensis JW-SD2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株杨树根际解磷细菌JW-SD2及其应用，该杨树根际解磷细菌的分类命名为<i>Pseudomonas？frederiksbergensis</i>？JW-SD2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC？M？2015350，保藏日期为：2015年6月2日，保藏地址为：中国武汉武汉大学。该菌株对土壤中的磷酸三钙具有较强的溶解能力；该菌株对温度、酸碱度、盐度等土壤环境因素具有良好的适应能力，能够在复杂的环境条件下发挥其解磷能力；通过盆栽试验证实接种JW-SD2菌株，能够显著的促进NL-895杨树苗木的生长。因此，该JW-SD2是一株优良的生物菌肥资源菌株，具有良好的应用开发潜力和前景。

Description

一株杨树根际解磷细菌Pseudomonas frederiksbergensis JW-SD2及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株杨树根际解磷细菌PseudomonasfrederiksbergensisJW-SD2及其应用。

技术背景

杨树是中国最主要的造林树种之一，全国杨树林面积达700万公顷。磷是植物生长发育所必须的三大营养元素之一，但由于磷在土壤中往往以不溶性的磷化合物存在，不能供给植物直接吸收利用，成为了制约植物生长的限制性营养元素。杨树人工林多采用短期轮伐的经营方式，频繁的收获进一步造成了杨树林地磷元素的缺乏和地力衰退。土壤缺磷已经成为了影响杨树生长，阻碍杨树产业可持续发展的瓶颈问题。农林业上采用施用磷肥来增加土壤肥力，但由于可溶性的磷酸根离子和土壤金属离子的迅速螯合，使得磷肥的使用效率极低。加之磷肥的高额成本及施用过程存在破坏生态环境的风险，开发和利用新型的磷肥替代产品成为了农林业发展迫切的要求。因此，以解磷细菌为代表的生物菌肥开发和利用受到了人们的关注。

解磷细菌是一类能够溶解不溶性磷化合物，增加土壤肥力，促进植物生长的土壤细菌。解磷细菌在植物根际土壤中分布广泛，目前解磷细菌的开发和研究工作主要集中在农业上，而关于解磷细菌在林木根际的筛选和应用研究相对较少。不同的解磷细菌所具有的解磷能力也有所不同，分离高效的解磷细菌，挖掘土壤磷库资源，是解磷细菌研究的基础。此外，弄清楚解磷细菌的解磷特性，研究其植物促生能力将为其开发和应用奠定基础。而这些研究也将进一步为我国林业生产中急需解决土壤缺磷问题提供新的解决路径。

发明内容

发明目的：为了解决现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一株杨树根际解磷细菌P.frederiksbergensisJW-SD2，其具有较强的解磷能力，并能在复杂的环境条件下发挥其解磷能力。本发明的另一目的是提供上述的杨树根际解磷细菌P.frederiksbergensisJW-SD2在促进杨树苗木生长上的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一株杨树根际解磷细菌，其分类命名为PseudomonasfrederiksbergensisJW-SD2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCM2015350，保藏日期为：2015年6月2日，保藏地址为：中国武汉武汉大学。

所述的杨树根际解磷细菌P.frederiksbergensisJW-SD2在溶解难溶性无机磷酸盐中的应用。

所述的难溶性无机磷酸盐为磷酸钙。

所述的环境条件因素包括温度，酸碱度，溶氧条件，盐离子浓度。

所述的杨树根际解磷细菌P.frederiksbergensisJW-SD2在促进杨树苗木生长中的应用。

解磷细菌P.frederiksbergensisJW-SD2分离自山东沂水杨树根际土壤(棕壤土)。

JW-SD2的生物学特征：JW-SD2菌株接种于LB培养基，30℃培养3天后，菌落圆形，黄色不透明，边缘整齐，表面湿润光滑(图1，A)；显微镜观察发现，该菌株为棒状或短杆状，具有一端生的一根或两根鞭毛(图1，B)；该菌株为好氧性细菌(图1，C)。JW-SD2菌株接种于NBRIP培养基，30℃培养5天，菌落圆形，黄色不透明，菌落中心薄而边缘厚，菌落外围有明显的溶磷透明圈，直径为菌落直径的3倍(图2)。

JW-SD2菌株16SrDNA序列，见SEQIDNO.1所示。GenBank数据库BLAST序列比对结果显示，该JW-SD2与Pseudomonasfrederiksbergensis(KC934887.1)具有99％的相似度。Biolog检定系统鉴定结果也表明JW-SD2为一株Pseudomonas菌株。结合形态特征、Biolog检定系统鉴定和16SrDNA序列分析，JW-SD2菌株被鉴定为PseudomonasfrederiksbergensisJW-SD2。

上述的杨树根际解磷细菌P.frederiksbergensisJW-SD2对难溶性磷酸盐有较强的溶解能力，能够在较为复杂的环境条件下发挥其解磷能力。接种实验结果表明，接种JW-SD2菌株的NL895杨树苗高、地径生长均显著强于对照处理，说明该JW-SD2菌株对杨树苗木具有较好的促生作用。

所述的杨树根际解磷细菌P.frederiksbergensisJW-SD2的解磷方法：将P.frederiksbergensisJW-SD2菌株在LB培养基活化，30℃，180r/min培养至菌体浓度为10⁸cfu·mL^-1，取1mL发酵液5000×g离心5min，收集菌体，无菌生理盐水洗涤2次，将菌体重新悬浮于1mL灭菌生理盐水中，制备成种子液；按1％接种量将JW-SD2菌种子液接入含磷的NBRIP培养基，20-35℃，pH4-10，并向NBRIP培养基中添加质量百分比浓度0％-3.0％的NaCl，180r·min^-1进行震荡培养解磷48-96h。

所述的杨树根际解磷细菌P.frederiksbergensisJW-SD2的解磷方法，优选：30℃，pH7，加入1.0％NaCl，180r·min^-1进行震荡培养解磷72h。

有益效果：与现有技术相比，本发明的杨树根际解磷细菌P.frederiksbergensisJW-SD2的优势包括：对难溶性的无机磷酸盐磷酸三钙(Ca₃(PO₄)₂)具有较强的溶解能力；能够在较大变化幅度的温度、酸碱度、溶氧条件、盐离子浓度条件下发挥其解磷能力；通过盆栽杨树苗的接种试验，证明JW-SD2菌株能够显著的促进杨树苗的生长。因此，本发明的P.frederiksbergensisJW-SD2能为开发微生物菌肥提供优良的菌株资源，具有良好的应用开发潜力和前景。

附图说明

图1是JW-SD2菌株的生物形态学特征图；其中，A图为JW-SD2菌株接种于LB培养基，30℃培养3天后示意图，B图是显微镜观察发现图，C图为好氧性细菌图；

图2是JW-SD2菌株在NBRIP培养基上的解磷情况结果图；

图3是JW-SD2菌株在NBRIP液体培养基中解磷动力学结果图；

图4是JW-SD2菌株在NBRIP液体培养基中的pH及可滴定酸度结果图；

图5是JW-SD2菌株在不同温度条件下的解磷能力结果图；

图6是JW-SD2菌株在不同初始pH下的解磷能力结果图；

图7是JW-SD2菌株在不同装液量下的解磷能力结果图；

图8是JW-SD2菌株在不同NaCl浓度下的解磷能力结果图；

图9是JW-SD2菌株对NL895杨树苗(Populuseuramericanacv.)生长影响的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。根据下述实施例，可以使本领域的技术人员更好地理解本发明。实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

以下实例中，LB培养基的配方为：胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0，固体培养基添加1.5g/100mL的琼脂。磷酸盐生长培养基(NBRIP)的配方为：葡萄糖10g，Ca₃(PO₄)₂5g，MgCl₂.6H₂O5g，KCl0.2g，MgSO₄.7H₂O0.25g，(NH₄)₂SO₄0.1g，蒸馏水1000mL，pH7.0，固体培养基添加1.5g/100mL的琼脂。杨树根际解磷细菌P.frederiksbergensisJW-SD2在不同环境条件下的解磷能力均在NBRIP培养基中进行，pH利用1mol·L^-1HCl或NaOH进行调整，装液量实验在100mL三角瓶中进行，NaCl浓度实验使用分析纯NaCl试剂。

实施例1JW-SD2菌株解磷试验

将-80℃保存的P.frederiksbergensisJW-SD2菌株活化2次后，接种于LB培养基，30℃，180r/min培养20h，发酵液菌体浓度为10⁸cfu·mL^-1。取1mL发酵液5000×g离心5min，收集菌体，无菌生理盐水洗涤2次，将菌体重新悬浮于1mL灭菌生理盐水中，制备成种子液。按1％接种量将JW-SD2种子液接入NBRIP培养基，30℃，180r·min^-1进行震荡培养，以不接菌处理作为空白对照，每隔24h对取3组重复进行采样测定，直到第192h。采用分光光度计测定发酵液OD₆₀₀nm，比浊法测定细菌生长量。发酵液10000×g离心15min，采用钼锑抗比色法测定上清液可溶性含量，PB-10标准型PH计测定上清液pH，可滴定酸法测定上清液可滴定酸度。

结果如图3所示，JW-SD2菌株在72h之前具有较强的解磷能力，最高解磷量达7.75mmol·L^-1，此后JW-SD2菌株解磷量总体呈现逐渐下降的趋势。细菌生长测定结果显示JW-SD2菌株在48h时达到稳定期，96h后细菌数量出现明显下降趋势。pH及可滴定酸测定结果显示(图4)，在24h时，发酵液中pH达到最低值(4.23)，此时发酵液中的可滴定酸度也达到最大(41.03mmol·L^-1)，随着发酵时间的递增，发酵液pH逐渐上升，可滴定酸度逐渐下降。

实施例2温度对JW-SD2菌株解磷能力的影响

按实施例1方法制备P.frederiksbergensisJW-SD2种子液。按1％接种量向装有50mLNBRIP培养基的100mL三角瓶中接入JW-SD2种子液，分别置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃五个不同温度下进行震荡培养。每种温度处理均设立3组重复，以不接菌处理作为空白对照。72h后测定发酵液中可溶性磷含量，研究温度对JW-SD2菌株解磷能力的影响。

随着培养温度的上升，P.frederiksbergensisJW-SD2菌株的解磷能力呈现先上升后下降的趋势(图5)。在20℃到35℃的温度变化范围内该菌株表现出了较高的解磷能力，当培养温度为30℃时，JW-SD2菌株解磷能力极显著(P<0.01)高于其它温度处理，解磷量达7.79mmol·L^-1。当培养温度为20℃、25℃和35℃时，该菌株解磷量依次为5.30、6.74和6.95mmol·L^-1。当培养温度为40℃，便检测不到该菌株的解磷活性。从结果可以看出，JW-SD2菌株能够适应较大幅度的温度变化，并发挥解磷效力。

实施例3初始pH对JW-SD2菌株解磷能力的影响

利用1mmol·L^-1HCl或NaOH溶液分别调节培养基pH至4、5、6、7、8、9和10，培养基其它成分保持不变。以1％接种量向装有50mL培养基的100mL三角瓶中接入JW-SD2菌株种子液。每种温度处理均设立3组重复，以不接菌处理作为空白对照。30℃震荡培养72h，测定发酵液中可溶性磷含量，研究pH对JW-SD2菌株解磷能力的影响。

结果如图6所示，随着初始pH的上升，P.frederiksbergensisJW-SD2菌株的解磷能力表现出先下降后上升，后又下降的趋势，该菌株的解磷能力受到pH的显著影响。当初始pH值为7时，该菌株具有最大的解磷能力，解磷量达7.20mmol·L^-1，显著(P＜0.01)高于其它处理。当初始pH值为4、5、6、8、9、10时，JW-SD2菌株解磷量依次为6.51、5.06、6.32、6.10、5.56、0.28mmol·L^-1。以上结果表明，JW-SD2菌株具有较强的酸碱度耐受性，能够在大幅度变化的pH环境中发挥解磷作用。

实施例4装液量pH对JW-SD2菌株解磷能力的影响

在100mL三角瓶中分别装入20、40、50、60和80mLNBRIP培养基，使得装液量与三角瓶体积比分别为1/5、2/5、1/2、3/5和4/5。按1％接种量分别接入JW-SD2菌株种子液进行震荡培养。每种装液量处理均设立3组重复，以不接菌处理作为空白对照。30℃震荡培养，72h后测定发酵液中可溶性磷含量，研究装液量对JW-SD2菌株解磷能力的影响。

如图7所示，P.frederiksbergensisJW-SD2菌株在装液量为1/5时具有最高的不溶性矿质磷酸盐溶解量，7.41mmol·L^-1，显著(P＜0.01)高于其它装液量处理。在装液量分别为2/5、1/2、3/5、4/5时，该菌株仍具有较好解磷能力，解磷量分别为4.20、4.99、4.10、3.16mmol·L^-1。装液量直接反应了培养基溶氧水平，说明JW-SD2菌株能够在较大溶氧范围内发挥其解磷能力。

实施例5盐离子浓度对JW-SD2菌株解磷能力的影响

向NBRIP培养基中分别按质量百分比浓度0％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％和8.0％加入NaCl，保持培养基其它成分不变。以1％接种量向装有50mL培养基的100mL三角瓶中接入JW-SD2菌株种子液。每种NaCl浓度处理均设立3组重复，以不接菌处理作为空白对照。30℃震荡培养72h，测定发酵液中可溶性磷含量，研究盐离子浓度对菌株解磷能力的影响。

结果如图8所示。随着NaCl浓度的增加，该菌株的解磷能力出现了先上升后下降的变化趋势。该菌株在NaCl浓度1.0％时具有最大的解磷量，7.25mmol·L^-1。在NaCl浓度为0到3.0％之间时，该菌株的解磷能力保持在5.02mmol·L^-1以上。从上述结果可以看出，JW-SD2菌株具有较好的NaCl耐受力，这对其在高盐土壤中发挥解磷作用具有重要意义。

实施例6JW-SD2菌株促进NL895杨树苗木生长试验

将-80℃保存的P.frederiksbergensisJW-SD2菌株活化2次后，接种于LB培养基，30℃，180r/min培养20h，发酵液菌体浓度为10⁸cfu·mL^-1。取1mL发酵液5000×g离心5min，收集菌体，无菌生理盐水洗涤2次，将菌体重新悬浮于1mL灭菌生理盐水中，制备成接种液。

分别采用灭菌土和非灭菌土进行NL895杨扦插苗(Populuseuramericanacv.)培植，土壤采集自南京紫金山，40天后选取长势相近的杨树苗作为接种对象，接种前测量杨树苗苗高、地径，作为第一次测定结果。采用灌根法向每株杨树苗接入10mL上述接种液，对照处理杨树苗接入10mL灭菌蒸馏水，接种与对照处理分别设立5组重复，接种后杨树苗置于同一温室环境下生长，适时使用灭菌水浇水。分别于接种后50、100、150天进行第二(H2,D2)、三(H3,D3)、四次(H4,D4)苗高地径测量，计算增长率。增长率(％)＝(Yn-Y₁)-(Yn_(ck)-Y_ck1)×100/(Yn_(ck)-Y_ck1)，(Y＝H或者D，H为苗高，D为地径，n＝2，3，4)。

结果如图9和表1所示，接种JW-SD2菌株能够显著的促进杨树苗木的生长(P<0.05)。接种第50、100、150天时，灭菌土中接种处理的杨树苗苗高增长率分别比对照高出33.16％、27.17％和12.28％，地径增长率分别比对照高出15.73％、19.79％和14.84％；非灭菌土中接种处理的杨树苗苗高增长率分别为42.61％、38.15％和19.02％，地径增长率分别为14.82％，20.27％和14.26％。说明P.frederiksbergensisJW-SD2菌株无论在灭菌土或非灭菌土中对杨树苗的促生效果均较好，且能够持续促进杨树苗木的生长。

表1PseudomonasfrederiksbergensisJW-SD2菌株对杨树生长的影响

SEQUENCELISTING

<110>南京林业大学

<120>一株杨树根际解磷细菌PseudomonasfrederiksbergensisJW-SD2及其应用

<130>100

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1460

<212>DNA

<213>Pseudomonasfrederiksbergensis

<400>1

attgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggcagcacgggtacttgtac60

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Claims (6)

1.一株杨树根际解磷细菌，其分类命名为PseudomonasfrederiksbergensisJW-SD2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCM2015350，保藏日期为：2015年6月2日，保藏地址为：中国武汉武汉大学。

2.权利要求1所述的杨树根际解磷细菌P.frederiksbergensisJW-SD2在促进杨树苗木生长中的应用。

3.权利要求1所述的杨树根际解磷细菌P.frederiksbergensisJW-SD2在溶解难溶性无机磷酸盐中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的无机磷酸盐为磷酸钙。

5.权利要求1所述的杨树根际解磷细菌P.frederiksbergensisJW-SD2的解磷方法，其特征在于：将P.frederiksbergensisJW-SD2菌株在LB培养基活化，30℃，180r/min培养至菌体浓度为10⁸cfu·mL^-1的种子液；按1%接种量将JW-SD2菌液接入含磷的NBRIP培养基，20-35℃，pH4-10，并向NBRIP培养基中添加质量百分比浓度0%-3.0%的NaCl，180r·min^-1进行震荡培养解磷48-96h。

6.权利要求5所述的杨树根际解磷细菌P.frederiksbergensisJW-SD2的解磷方法，其特征在于：30℃，pH7，加入1.0%NaCl，180r·min^-1进行震荡培养解磷72h。