CN105936881B - 一种用于降解褐藻酸的嗜糖芽孢杆菌及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于降解褐藻酸的嗜糖芽孢杆菌及其应用方法，将烘干后的海藻磨成粉末，海藻粉末按照一定的比例加入水中，装入发酵罐后，在一定温度，一定时间下灭菌；种子液制备：筛选得到一株能够降解褐藻酸的发酵菌株YIC～ALG3，接种至2216E液体培养基过夜培养；将种子液按按照一定质量比加入发酵罐中，在一定条件下发酵，发酵后，得到利用微生物发酵处理褐藻原料制备海藻液。本发明发酵过程稳定可控，发酵周期短，产物功效显著，适于规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于降解褐藻酸的嗜糖芽孢杆菌，本发明还涉及利用所述嗜糖芽孢杆菌制备海藻液的方法以及利用所述嗜糖芽孢杆菌制备肥料的方法。
背景技术
海藻肥料以天然海藻为原料，经过特殊生化工艺处理，提取并保留海藻天然活性成分，精炼浓缩而形成的一种新型有机肥料。海藻肥料具有提高作物产量和品质，抵抗病虫害及不良环境以及改良土壤保持水土的功效，其应用于农业生产有巨大的市场需求和良好的发展前景。但是，要保障海藻肥料的质量，就必须把握好海藻原料和提取工艺两个关键环节。
首先，海藻肥料质量的优劣取决于所用的原料。目前，海藻肥生产企业所用的原料主要以褐藻为主，包括泡叶藻、昆布、海带、马尾藻等。其他藻类如墨角藻、浒苔、石莼、卡帕藻等也有少数企业在用。国外海藻肥企业绝大多数使用褐藻为原料，其中尤以泡叶藻应用最为广泛如Seasol、Maxicrop等知名品牌，实际作用效果也表明泡叶藻是优质的海藻原料。但是，我国沿海没有泡叶藻分布，国内企业采用的原料种类繁杂，品质参差不一，造成海藻肥产品质量良莠不齐，甚至有些厂家打着“海藻肥”的幌子，直接勾兑褐藻酸，黄腐酸、氮磷钾等冒充海藻肥，影响了海藻肥质量，扰乱了海藻肥市场。
其次，决定海藻肥质量的第二个因素是提取工艺。不同的提取工艺对海藻肥活性成分的种类和含量影响巨大。目前，海藻活性成分的提取方法主要有化学法、物理法以及生物法。化学法主要是利用酸、碱及有机溶剂处理海藻细胞，使细胞消解或内源物质增溶，该方法操作简单，容易实现，也是国内外绝大多数海藻肥生产企业采用的方法。但是，化学试剂对海藻细胞内的活性物质成分的破坏是相当大的，并且残留的有机试剂对环境也是潜在的危害。物理法的原理是控制压力，温度等物理环境条件，利用机械力使海藻细胞破碎，内容物释放。该方法虽然工艺清洁、环境友好，但是对于仪器设备的要求严苛，反应条件变化剧烈，成本较高，难以实现大规模生产。生物法包括酶法降解和微生物发酵两种方法，其主要原理是破坏海藻细胞壁结构并降解大分子物质为植物容易吸收利用的小分子物质，该方法反应温和，产物多元化，整个生产过程安全环保无污染，是理想的海藻肥生产方法。
利用微生物发酵法生产海藻肥料的研究相对较少，仅有的几例研究是选用多种微生物对 海藻原料进行类似堆肥发酵或好氧发酵处理，存在发酵过程可控性差，发酵周期长，目标产物不明确等问题，难以满足工业化生产要求的统一，稳定，可控的标准，产品的质量难以保障。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，第一、提供一种性能优良的用于降解褐藻酸的嗜糖芽孢杆菌；第二、提供利用所述嗜糖芽孢杆菌制备海藻液和海藻肥的方法，该方法发酵过程稳定可控，发酵周期短，产物功效显著，适于规模化生产。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一株用于降解褐藻酸的嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3，保藏号为CGMCC No12155。
一种利用权利要求1所述的嗜糖芽孢杆菌发酵处理褐藻原料制备海藻液的方法，其特征在于按照以下步骤进行：
1)、制备海藻粉末：将烘干后的海藻磨成粉末；
2)、制备产品A：海藻粉末与水按照质量比1～10:100装入发酵罐中，在100～150℃条件下灭菌15～35min，得到产品A；
并制备种子液：将所述的嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3接种至液体培养基培养20～30小时；
嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3与培养基之间的体积比为1～10:100；
3)、制备产品B：将种子液加入到产品A中得到产品B，其中种子液与产品A的质量比为1～10:100；
4)、产品B发酵：在温度为20℃～40℃，pH5～9的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为6～10天；
5)、制备海藻液和海藻渣：收集发酵液即为利用微生物发酵处理褐藻原料制备海藻液；并收集海藻渣。
所述液体培养基的pH7.2～7.4，并按照以下质量比配成：海藻酸钠5份、硫酸铵5份、硫酸镁1份、磷酸氢二钾2份、硫酸亚铁0.01份、琼脂20份和蒸馏水1000份的混合物。
所述海藻是指鼠尾藻，铜藻和马尾藻中的一种或任意比例的两种以上。
步骤1)所述粉末目数为40～60目。
含有所述的海藻液的肥料，其特征在于：含有所述的海藻液以及氮肥、磷肥和钾肥中的一种或者任意比例的两种以上。
含有权利所述的海藻渣的肥料，其特征在于：含有所述的海藻渣以及氮肥、磷肥和钾肥 中的一种或者任意比例的两种以上。
所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的生物特性如下：
褐藻酸碳源培养基：海藻酸钠5g，硫酸铵5g，硫酸镁1g，磷酸氢二钾2g，硫酸亚铁0.01g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.2～7.4。
YIC～Alg3菌株在褐藻酸唯一碳源平板上生长48h后，菌落不规则，淡黄色，中间不透明，边缘半透明，表面褶皱。显微镜观察菌株为杆状，在末端或近末端可产生芽孢，革兰氏阳性，能运动，生长后期菌体易聚集成团(图1)。生长温度范围20～45℃，PH范围6～9，NaCl浓度范围0～15％，菌株最适生长温度37℃，最适生长pH 7.5。触酶，氧化酶，VP试验阳性，能够利用葡萄糖，甘露糖，甘露醇，果糖，乳糖，半乳糖，淀粉；不能利用山梨醇，纤维素。系统发育树如图2所示。根据其生理生化特征，16SrDNA序列及系统发育树信息，将该菌株鉴定为嗜糖芽孢杆菌Bacillus halosaccharovorans。
注：+表示可以利用，～表示不能利用。
YIC～Alg3菌株的16SrDNA序列为：
TATACATGCAAGTCGAGCGAGGTCTTCGGACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGATTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAACATTTCGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGATGGCTTTTAGCTATCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGTTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACTAGAGTAACTGCTAGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCA GGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTCGCTACTTCTAGAGATAGAAGGTTCCCCTTCGGGGGACGAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGATGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCGAGACTGCGAAGTTAAGCGAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCGTAAGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGACAGA。
本发明具有以下有益技术效果：
本发明通过筛选得到一株海洋来源的嗜糖芽孢杆菌，该菌株具有降解褐藻酸的能力，一方面能够降解褐藻酸生成小分子量的褐藻寡糖等易于植物吸收利用的营养成分；另一方面破坏海藻细胞壁结构促使海藻体内更多营养物质得以释放。利用该菌株发酵处理铜藻、鼠尾藻等马尾藻属海藻原料，发酵一定天数后在发酵液中可检测到分子量在4000Da以下、聚合度为2-20的褐藻寡糖，以此发酵液作为海藻肥母液，直接或者复配N、P、K，微量元素，氨基酸，有机质等有效成分用于农作物生长。肥效实验表明，利用该方法获得发酵液能够明显促进植物根系生长，改良土壤微环境，提高作物产量。
本发明还具有以下特点：
1、采用本发明得到的海洋来源的嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3对海藻发酵，发酵过程稳定可控，发酵周期短，产物功效显著，适于规模化生产。
2、本发明得到的发酵液具有水溶性好，易于植物吸收利用，同时作为一种重要的信号分子，能够参与植物的生长调节和诱导抗病过程促进植物的生长，提高植物对不良环境及病虫 害的抵抗力。
3、本发明得到的海藻肥具有肥效显著的特点。
附图说明
图1是显微观察YIC～Alg3菌株的革兰氏染色及聚集成团现象图。
图2基于16SrDNA序列构建的YIC～Alg3菌株系统发育树示意图。
图3是不同温度对YIC～Alg3菌株产酶的影响的示意图。
图4是不同褐藻酸浓度对YIC～Alg3菌株产酶的影响示意图。
图5是不同pH对YIC～Alg3菌株产酶的影响示意图。
图6是不同发酵时间YIC～Alg3菌株产酶情况示意图。
具体实施方式
下面结合具体实例进一步说明本发明。
以下是本发明海藻液制备实施例。
本发明筛选得到一株用于降解褐藻酸的嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3，保藏号为CGMCCNo12155，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年3月2日，分类命名：嗜糖芽孢杆菌Bacillus halosaccharovorans。
从图1看出：YIC～Alg3菌株呈杆状，革兰氏染色阳性，发酵后期易凝聚成团。
从图2看出：根据16SrDNA序列分析，YIC～Alg3菌株与嗜糖芽孢杆菌亲缘关系最近。
从图3看出：YIC～Alg3菌株在发酵温度30-40℃时，菌体生物量及酶活保持在较高水平。
从图4看出：YIC～Alg3菌株在褐藻酸浓度为0.4-1.0％时，菌体生物量及酶活保持在较高水平。
从图5看出：YIC～Alg3菌株在pH为6.0-8.0时，菌体生物量及酶活保持在较高水平。
从图6看出：YIC～Alg3菌株在发酵24h，菌体生物量及酶活达到最高值。
实施例1
将洗净烘干后的新鲜鼠尾藻磨成50～60目粉末；
海藻粉末与水按照质量比2:100装入发酵罐中，在115℃条件下灭菌35min，得到产品A；并制备种子液：将所述的嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3接种至液体培养基培养20小时；所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的保藏号为CGMCC No12155；所述液体培养基为：海藻酸钠5g、硫酸铵5g、硫酸镁1g、磷酸氢二钾2g、硫酸亚铁0.01g、琼脂20g和蒸馏水1000ml的混合物，pH7.2～7.4；嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3和培养基的体积比例为2:100。将种子液加入到产品A中，其中种子液与产品A的质量比为1:100，得到产品B；在温度为20℃，pH5.5～6.0的条件下对产品B进行发 酵，发酵时间为7天；收集发酵液即为利用微生物发酵处理褐藻原料制备海藻液；并收集海藻渣。
实施例2
将洗净烘干后的新鲜铜藻和新鲜马尾藻按照质量比1:1复配，磨成50～60目粉末；
海藻粉末与水按照质量比4:100装入发酵罐中，在115℃条件下灭菌25min，得到产品A；并制备种子液：将所述的嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3接种至液体培养基培养22小时；所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的保藏号为CGMCC No12155；所述液体培养基为：海藻酸钠5g、硫酸铵5g、硫酸镁1g、磷酸氢二钾2g、硫酸亚铁0.01g、琼脂20g和蒸馏水1000ml的混合物，pH7.2～7.4；嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3和培养基的体积比例为5:100。将种子液加入到产品A中，其中种子液与产品A的质量比为5:100，得到产品B；在温度为25℃，pH6.5～7.0的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为8天；收集发酵液即为利用微生物发酵处理褐藻原料制备海藻液；并收集海藻渣。
实施例3
将洗净烘干后的新鲜马尾藻磨成50～60目粉末；
海藻粉末与水按照质量比6:100装入发酵罐中，在125℃条件下灭菌35min，得到产品A；并制备种子液：将所述的嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3接种至液体培养基培养24小时；所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的保藏号为CGMCC No12155；所述液体培养基为：海藻酸钠5g、硫酸铵5g、硫酸镁1g、磷酸氢二钾2g、硫酸亚铁0.01g、琼脂20g和蒸馏水1000ml的混合物，pH7.2～7.4；嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3和培养基的体积比例为8:100。将种子液加入到产品A中，其中种子液与产品A的质量比为4:100，得到产品B；在温度为30℃，pH7～7.5的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为9天；收集发酵液即为利用微生物发酵处理褐藻原料制备海藻液；并收集海藻渣。
实施例4
将洗净烘干后的新鲜马尾藻磨成50～60目粉末；
海藻粉末与水按照质量比9:100装入发酵罐中，在140℃条件下灭菌15min，得到产品A；并制备种子液：将所述的嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3接种至液体培养基培养20小时；所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的保藏号为CGMCC No12155；所述液体培养基为：海藻酸钠5g、硫酸铵5g、硫酸镁1g、磷酸氢二钾2g、硫酸亚铁0.01g、琼脂20g和蒸馏水1000ml的混合物，pH7.2～7.4；嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3和培养基的体积比例为5:100。将种子液加入到产品A中，其中种子液与产品A的质量比为8:100，得到产品B；在温度为35℃，pH8～8.5的条件下对产品B进行发酵， 发酵时间为9天；收集发酵液即为利用微生物发酵处理褐藻原料制备海藻液；并收集海藻渣。
以下是含有本发明海藻液的肥料的制备实施例。
实施例5肥料：将海藻液与熔融尿液按照质量比1:50混合，经喷浆、造粒、烘干、筛分和包装后得到海藻氮肥。
实施例6肥料：将海藻液与氮肥、磷肥和钾肥按照质量比1：20:30:35混合，经造粒、烘干、筛分和包装后得到海藻复混肥。
以下是含有本发明海藻渣的肥料的制备实施例。
实施例7肥料：将实施例一得到的海藻渣与氮肥和有机质按照质量比1:20:10混合，经造粒、烘干、筛分和包装后得到海藻有机肥。
实施例8肥料：将实施例一得到的海藻渣与氮肥、磷肥、钾肥和有机质按照质量比1:15：20:25：10混合，经造粒、烘干、筛分、包装后得到N:10,P2O5:14,K2O:6,有机质:20的有机无机肥。
实施例6至8中，所述氮肥是硫酸铵，磷肥是磷酸一铵，钾肥是硫酸钾，有机质是蘑菇渣。
下面结合实验数据进一步说明本发明海藻液的有益效果：
实验一：海藻提取液对番茄种子萌发影响
一材料与方法：
1.1试验地点:五洲丰农业科技有限公司实验室。
1.2番茄品种：烟粉2号。
1.3供试肥料：海藻生物发酵提取液。
1.4试验设计：
试验将海藻提取液分别稀释200、400、600、800倍配置成海藻肥溶液，以清水为对照。共5个处理，4次重复。将番茄种子放入各不同稀释浓度的海藻溶液和清水(CK)中浸种10h，之后用清水冲洗。用四分法取种子100粒，以适当间距平放在铺有直径为10cm滤纸的培养皿中，以清水保持湿润，置于生化培养箱中28℃暗培养，每天及时补充水分及通气，并记录萌发种子数，计算发芽势和发芽率。幼苗子叶张开后，测量幼苗的株高、根长。
2结果与分析：
2.1不同处理对番茄种子萌发的影响
表1海藻液浸种对番茄种子萌发的影响
由表1可见，使用海藻提取液对番茄种子萌发均有不同程度的促进作用，浸种可以是种子萌发快而整齐，促进幼苗的生长，其中发芽率分别比对照增加4.6％、6.9％、5.9％和2.3％，发芽势分别比对照增加5.0％、6.0％、4.2％和1.0％，株高分别比对照增加10.3％、17.2％、9.2％和3.4％，根长分别比对照增加18.7％、40.6％、31.2％和-3.1％；其作用表现为随着稀释倍数的增大，呈现由低到高再到低的变化。其中稀释200倍和800倍对番茄发芽率、发芽势的影响差异不显著，表明海藻提取液的浓度过低或过高效果都不理想。稀释400倍和600倍两个处理作用最为显著，不仅对番茄种子提高发芽率和发芽势最用明显，而且对幼苗株高、根长的促进也最显著，以400倍为最优。
实验二：海藻复合肥对番茄产量的影响
1材料与方法：
1.1试验地点：烟台市农业科学院蔬菜所温室，中性棕壤，中高肥力。
1.2番茄品种：烟粉2号。
1.3供试肥料：15-15-15三元复合肥，添加海藻液的15-15-15三元复合肥。
1.4试验设计：试验设2个处理，3次重复，共6个小区，各小区随机排列。小区面积15m2，定植75株。小区单收分别计算产量。处理1亩施1000kg腐熟鸡粪和100kg三元复合肥作基肥，处理2亩施1000kg腐熟鸡粪和100kg添加海藻液的三元复合肥作基肥。
2015年1月4日播种育苗，2015年3月15日定植，单秆整枝，留四穗果后打顶，其他管理同常规。
2结果与分析
由表2可以看出，添加海藻液复合肥与常规施肥处理相比，小区Ⅰ增产30.9kg、增幅19.6％，小区Ⅱ增产6.6kg、增幅4％，小区Ⅲ增产45.7kg、增幅33.2％，折合亩产增产1231.1kg，综合增产18.1％。并且海藻肥处理区番茄生长势强，茎粗、根系发达，耐寒性强，叶肉厚，叶色浓，病虫害轻，特别是生长中后期肥效尤其明显。
表2海藻复合肥对番茄产量的影响
实验三：海藻有机肥对番茄产量的影响
1材料与方法：
1.1试验地点：烟台市农业科学院蔬菜所温室，中性棕壤，中高肥力。
1.2番茄品种：烟粉2号。
1.3供试肥料：普通有机肥，海藻渣有机肥。
1.4试验设计：试验设2个处理，3次重复，共6个小区，各小区随机排列。小区面积15m2，定植75株。小区单收分别计算产量。处理1亩施300kg普通有机肥和100kg15-15-15三元复合肥作基肥，处理2亩施300kg海藻渣有机肥和100kg15-15-15三元复合肥作基肥。
2015年1月4日播种育苗，2015年3月15日定植，单秆整枝，留四穗果后打顶，其他管理同常规。
2结果与分析
由表3可以看出，海藻渣有机肥与普通有机肥处理相比，小区Ⅰ增产28.6kg、增幅17.6％，小区Ⅱ增产16.6kg、增幅9.95％，小区Ⅲ增产33.7kg、增幅21.9％，折合亩产增产1169.0kg，综合增产16.3％。海藻渣有机肥处理的增产效果显著，同时番茄生长势强，茎粗、根系发达，叶肉厚，叶色浓绿，对番茄的生长和产量有显著的影响。
表3海藻渣有机肥对番茄产量的影响
Claims (6)
1.一株用于降解褐藻酸的嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3，保藏号为CGMCC No12155。
2.一种利用权利要求1所述的嗜糖芽孢杆菌发酵处理褐藻原料制备海藻液的方法，其特征在于按照以下步骤进行：
1）、制备海藻粉末：将烘干后的海藻磨成粉末；
2）、制备产品A：海藻粉末与水按照质量比1～10:100装入发酵罐中，在100～150℃条件下灭菌15～35min，得到产品A；
并制备种子液：将所述的嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3接种至液体培养基培养20～30小时；
嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3与培养基之间的体积比为1～10:100；
3）、制备产品B：将种子液加入到产品A中得到产品B，其中种子液与产品A的质量比为1～10:100；
4）、产品B发酵：在温度为20℃～40℃，pH5～9的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为6～10天；
5）、制备海藻液和海藻渣：收集发酵液即为利用微生物发酵处理褐藻原料制备海藻液；并收集海藻渣。
3.如权利要求2所述的嗜糖芽孢杆菌发酵处理褐藻原料制备海藻液的方法，其特征在于：所述海藻是指鼠尾藻，铜藻和马尾藻中的一种或任意比例的两种以上。
4.如权利要求2所述的嗜糖芽孢杆菌发酵处理褐藻原料制备海藻液的方法，其特征在于：步骤1）所述粉末目数为40～60目。
5.含有权利要求2～4任意一项所述方法制备的海藻液的肥料，其特征在于：含有所述的海藻液以及氮肥、磷肥和钾肥中的一种或者任意比例的两种以上。
6.含有权利要求2～4任意一项所述方法制备的海藻渣的肥料，其特征在于：含有所述的海藻渣以及氮肥、磷肥和钾肥中的一种或者任意比例的两种以上。
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