CN105274009A

CN105274009A - 一种防治植物终极腐霉病害的木霉菌株及制剂

Info

Publication number: CN105274009A
Application number: CN201510679282.7A
Authority: CN
Inventors: 陈凯; 李纪顺; 赵晓燕; 李舒依; 杨合同; 吴晓青; 王贻莲; 魏艳丽; 扈进冬
Original assignee: BIOTECHNOLOGY CENTER OF SHANDONG ACADEMY OF SCIENCES
Current assignee: ECOLOGY INSTITUTE OF SHANDONG ACADEMY OF SCIENCES (THE SINO-JAPANESE FRIENDSHIP BIOTECHNOLOGY RESEARCH CENTER, SHANDONG ACADEMY OF SCIENCES); SHANDONG WFS ECO-ENGINEERING Co.,Ltd.
Priority date: 2015-11-24
Filing date: 2015-11-24
Publication date: 2016-01-27
Anticipated expiration: 2035-11-24
Also published as: CN105274009B

Abstract

本发明公开了一种防治植物终极腐霉病害的木霉菌株及制剂。该木霉菌株为厚垣孢木霉（<i>Trichoderma？</i><i>chlamydospora</i>）？CCTCC-TW20622，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是CGMCC？NO.11337，保藏日期是2015年9月8日。该木霉菌株产生的纤维素酶和葡聚糖酶可消解终极腐霉的细胞壁，引起菌丝破裂；对终极腐霉有强烈的抑制作用，平板抑制率达100%。本发明制剂对由终极腐霉引起的植物病害防治效果达到90%以上。

Description

一种防治植物终极腐霉病害的木霉菌株及制剂

技术领域

本发明涉及一种防治植物病害的木霉及其应用，特别是涉及一种防治植物终极腐霉病害的木霉菌株及制剂。

背景技术

终极腐霉（Pythiumultimum）属于真菌界真菌门鞭毛菌亚门藻状菌纲霜霉目腐霉科，为低等真菌，目前报道分布甚广，它不仅栖息在土壤中，还广泛侵染大豆、菜豆、豌豆、甘薯、松苗、咖啡、苹果、柑橘、桃、棉花、菊花、大丽花、南瓜、西瓜、甘蔗、苜蓿、番茄等150余种经济植物，引起苗枯，猝倒、根腐、脚腐、枯萎等多种病害。

目前常用的预防及防治该病害的方法有：农田管理改善、应用抗性品种、化学药剂防治，但效果不甚明显，且化学农药施用不当造成了一系列的环境及健康问题。随着生活水平的提高，人们对绿色食品、有机食品需求越来越大，对支撑其生产的绿色、无污染、高效生物农药的需求也日益扩大。国内外也开展了相关的研究，如李琳（2013）等分离到的棘孢木霉T31对腐霉的平板抑制率为74.39%，但没有开发出相关产品，仅有10多项相关的发明专利涉及植物提取抑菌有效成分或微生物菌株可防治腐霉猝倒病的报道。BinLi(2007)筛选到14株类芽孢杆菌，防治黄瓜腐霉猝倒病防效达到73%；Novozymes公司利用专利菌株利迪链霉菌WYEC108研制了防治腐霉、疫霉、镰刀菌、丝核菌等病原菌的生物杀菌剂；国外还有报道利用木霉菌、荧光假单胞菌防治玉米腐霉猝倒病的成功案例。

然而，国内登记防治作物猝倒病的药剂99个，其中仅有2个产品不是化学农药，且为捷克进口产品，国内没有相关产品报道，因此研制多机制防治腐霉病害的微生物农药成为市场急需。木霉（Trichodermaspp.）具有多种生防机制：寄生、竞争、水解酶活性、抗生性代谢产物等，是重要的植物病害生物防治菌，目前已有10多个木霉产品获得农药登记并得到广泛应用，故利用木霉研发生物农药防治由终极腐霉类低等真菌引起的植物病害成为可能。

发明内容

本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种防治植物终极腐霉病害的木霉菌株及制剂。该木霉产生的纤维素酶和葡聚糖酶可消解终极腐霉的细胞壁，引起菌丝破裂；对终极腐霉有强烈的抑制作用，平板抑制率达100%。本发明制剂对由终极腐霉引起的植物病害防治效果达到90%以上。

本发明一种防治植物终极腐霉病害的木霉菌株及制剂的技术方案为，该木霉TrichodermachlamydosporaCCTCC-TW20622在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，其保藏编号是：CGMCCNO.11337，菌种的拉丁文名称是Trichodermachlamydospora，参据的微生物（株）：CCTCC-TW20622，保藏日期是2015年9月8日。

该木霉CCTCC-TW20622在PDA平板上对终极腐霉抑制率高达100%，其产生的纤维素酶和葡聚糖酶可消解终极腐霉的细胞壁，引起菌丝破裂；CCTCC-TW20622在PDA平板上产生分生孢子能力较弱，而产生厚垣孢子的能力较强，4d后可产生大量的厚垣孢子；液体发酵厚垣孢子产量为5亿/mL。

该木霉ITS扩增引物：ITS1-F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGT

AA-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，菌株CCTCC-TW20622的ITS序列全长为613bp，如下所示：

GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTTCTGAAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGGAACCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCAT。

该木霉tef1扩增引物：EF1-728F：5’-CATCGAGAAGTTCGAGA

AGG-3’，EF200R：5’-GCCATCCTTGGAGATACCAGC-3’，菌株CCTCC-TW20622的tef1序列全长为649bp，如下所示：

CATCGAGAAAAGTCGAGAAGGTAAGCTAATTTCACTATTTTTATTACTACGCTTTATTGGCACAGTCGTGTGTCCGGCAATCCTGTTCTCAGTCTTGTCAATTTTTCTCTCGCATCGTCACACCCCGCTCTACCTGTCTCTACCCCTCCTTTGGCACAGCAAAAATTTTCTGGCTGCCTTGTTTGGTTTTTAGTGGGGTGCCATCTTTTTTTTCTGGCAACCCCGCTAATCGCCGCTGTCCCTCATCCATCGTCTTAACAATTTGTTCACTCAATCGCATCTCATTTTCTCTGTGGTTCAATGTGCTGATCATGATTCAATCAATAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCTTTCAAGTATGCGTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTCTGGAAGTTCGAGACTCCCAAGTACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTTTAGTATCCTCATTGGCGTTTCGAAATCATGATTCTAACGTGCCACTCTACAGACGCTCCCGGCCACCGTGATTTCATCAAGAACATGATCACTGGTACCTCCCAGGCTGACTGCGCTATCCTGATTATCGCTGCCGGTACTGGTGAGTTCGAGGCTGGTATCTCCAAAGGATGGC。

该木霉rpb2扩增引物：fRPB2-5F：5’-GA(T/C)GA(T/C)(A/C)G

(A/T)GATCA(T/C)TT(T/C)GG-3’，fRPB2-7cR：5’-CCCAT(A/G)GCT

TG(T/C)TT(A/G)CCCAT-3’，菌株CCTCC-TW20622的rpb2序列全长为1146bp，如下所示：

GTTCCGTGGTATCATGCGCAGAATGAATACTGAGCTGGCCAACTACCTGAGACGATGTGTTGAGGGTAACCGCCACTTCAACCTTGCTGTTGGCATCAAGCCCGGTACACTTTCCAACGGACTCAAGTACTCACTCGCCACTGGAAACTGGGGTGACCAGAAGAAAGCAATGAGCTCGACTGCGGGTGTCTCACAGGTGCTTAACCGTTACACTTTTGCTTCTACACTTTCCCATTTGCGTCGTACCAATACACCCATCGGAAGAGATGGTAAGTTGGCGAAGCCTCGACAGCTCCACAACACACACTGGGGTTTGGTGTGCCCGGCCGAGACCCCTGAAGGACAGGCTTGTGGTCTGGTCAAGAATTTGTCTCTGATGTGTTACGTCAGTGTTGGATCTCCTTCTGAGCCTTTGATCGAGTTTATGATCAACAGAGGCATGGAAGTCGTTGAGGAGTATGAGCCACTGAGGTATCCCCATGCCACAAAGATCTTTGTGAATGGTGTCTGGGTTGGAATTCATCAAGACCCAAAGCATCTGGTAAACCAAGTCTTGGATACTCGTCGCAAGTCCTATCTGCAGTACGAGGTCTCTCTGATCAGAGAAATTCGAGACCAAGAATTCAAAATCTTCTCTGATGCCGGTCGTGTTATGCGACCCGTCTTCACTGTACAGCAGGAAGATGACCCGGAAACGGGTATCAACAAGGGCCACCTGGTTTTGACCAAGGACCTCGTCAATAGACTGGCCAAAGAGCAGGCTGAGCCTCCAGAAGACCCAAGCATGAAGCTCGGATGGGAGGGGCTGATCAGGGCTGGTGCGGTGGAATATCTCGACGCCGAGGAGGAAGAAACGTCCATGATTTGCATGACACCGGAAGATCTTGAGCTTTATCGTCTTCAAAAGGCCGGCATTGCCACGGATGAAGACATAGGAGATGACCCAAATAAGCGTCTCAAGACCAAGACAAATCCGACAACTCACATGTATACGCATTGCGAGATTCACCCGAGTATGATTCTAGGTATCTGTGCTAGTATCATTCCTTTCCCCGATCACAACCAGGTATGTCAACCCGAGAAGATAATGTTTCTTCTTTGTTCATCTTTCTGTATGTTACGTTCAAAACGCTAACTGATGCTATA。

所述木霉制备的制剂，由该木霉经过斜面培养、三角瓶培养、液体培养后得到的发酵液，以及凹凸棒土、羧甲基纤维素钠、茯苓粉、黄原胶、SDS组成。

所述的发酵液制备过程为：

（1）斜面培养：采用固体PDA培养基，将菌株接种在试管培养基上，25℃培养2d～3d；

（2）三角瓶培养：采用液体PDB培养基，将试管菌种接种在液体三角瓶中，置于摇床上25℃振荡培养1d～2d；

（3）液体培养：采用发酵培养基，115℃灭菌30min，将三角瓶种接种发酵罐，接种量0.2%，25℃培养，溶氧量40%～50%，通气量1：0.6～0.8，搅拌速度为160r/min，培养24h后，添加0.4%草酸，调整发酵参数：25℃培养，溶氧量20%～30%，通气量1：0.4～0.6，搅拌速度为140r/min，继续培养24h～30h，至厚垣孢子量达到5亿/mL以上时，结束发酵得到发酵液。

步骤（3）中，发酵培养基为，玉米粉2%，葡萄糖0.5%，豆饼粉4%，磷酸氢二钾0.2%，磷酸二氢钾0.2%，碳酸钙0.5%，余量为水，pH5.5~6.0。

所述的制剂，由以下成分组成：

发酵液20mL

凹凸棒土（300目）78g

羧甲基纤维素钠0.8g

茯苓粉0.8g

黄原胶0.2g

SDS0.2g。

本发明的有益效果为：该木霉产生的纤维素酶和葡聚糖酶可消解终极腐霉的细胞壁，引起菌丝破裂；该木霉CCTCC-TW20622在PDA平板上产生分生孢子能力较弱，而产生厚垣孢子的能力较强，4d后可产生大量的厚垣孢子；液体发酵厚垣孢子产量为5亿/mL，该木霉菌株CCTCC-TW20622对终极腐霉有强烈的抑制作用，25℃对峙培养4d，已完全覆盖终极腐霉，且终极腐霉的气生菌丝成塌陷现象，抑制率达100%。温室试验和小区试验表明，本发明制剂对由终极腐霉引起的植物病害防治效果达到90%以上。

本发明制剂对茄子猝倒病的防治效果达到了94.9%，对番茄猝倒病防治效果达到了90%以上。

附图说明

图1所示为基于rpb2序列的CCTCC-TW20622系统发育进化树；

图2所示为CCTCC-TW20622分别在SNA培养基、PDA培养基、CMD培养基上25℃下培养7d的平板形态；

图3所示为CCTCC-TW20622的显微形态；其中，a，分生孢子；b~e，分生孢子梗；f，厚垣孢子，标尺：a~e，5μm；f，10μm；

图4所示为CCTCC-TW20622在PDA平板上对终极腐霉的抑制结果；

图5所示为CCTCC-TW20622与终极腐霉对峙培养时的显微形态；

图6所示为CCTCC-TW20622分别在β-1,3-葡聚糖酶培养基和纤维素培养基平板培养基上的水解圈。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案。

实施例1：木霉菌株的分离

从全国各地采集土样及水样，利用选择性培养基PDAm分离木霉。称取10g土样，倒入100mL生理盐水三角瓶中，25℃，160r/min摇床振荡1h，进行梯度稀释，每稀释度取1mL放入平板中，加入45℃左右的PDAm混匀，25℃培养7d~14d，对于水样，直接取1mL与PDAm混匀倒平板。待平板中长出木霉后，挑取木霉菌落转接PDA平板，并镜检纯化至单菌落后保存。

PDAm：200g马铃薯，20g葡萄糖，15g琼脂，0.1g链霉素（streptomytin），0.3g氯霉素（chloramphenicol），0.02g玫瑰红（rosebengal），0.5%曲酮（TritonX-100），1000mL蒸馏水。

PDA：200g马铃薯，20g葡萄糖，15g琼脂，1000mL蒸馏水。

本实验从229个样品中，分离保存木霉菌株323株，其中菌株CCTCC-TW20622分离自山东省济南市七星台森林公园内的松蘑上。

实施例2：菌种鉴定

主要通过平板形态、显微形态、ITS、tef1及rpb2序列结果进行鉴定。

ITS扩增引物：ITS1-F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，菌株CCTCC-TW20622的ITS序列全长为613bp，如下所示：

GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTTCTGAAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGGAACCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCAT；

tef1扩增引物：EF1-728F：5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG

-3’，EF200R：5’-GCCATCCTTGGAGATACCAGC-3’，菌株CCTCC-TW20622的tef1序列全长为649bp，如下所示：

CATCGAGAAAAGTCGAGAAGGTAAGCTAATTTCACTATTTTTATTACTACGCTTTATTGGCACAGTCGTGTGTCCGGCAATCCTGTTCTCAGTCTTGTCAATTTTTCTCTCGCATCGTCACACCCCGCTCTACCTGTCTCTACCCCTCCTTTGGCACAGCAAAAATTTTCTGGCTGCCTTGTTTGGTTTTTAGTGGGGTGCCATCTTTTTTTTCTGGCAACCCCGCTAATCGCCGCTGTCCCTCATCCATCGTCTTAACAATTTGTTCACTCAATCGCATCTCATTTTCTCTGTGGTTCAATGTGCTGATCATGATTCAATCAATAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCTTTCAAGTATGCGTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTCTGGAAGTTCGAGACTCCCAAGTACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTTTAGTATCCTCATTGGCGTTTCGAAATCATGATTCTAACGTGCCACTCTACAGACGCTCCCGGCCACCGTGATTTCATCAAGAACATGATCACTGGTACCTCCCAGGCTGACTGCGCTATCCTGATTATCGCTGCCGGTACTGGTGAGTTCGAGGCTGGTATCTCCAAAGGATGGC；

rpb2扩增引物：fRPB2-5F：5’-GA(T/C)GA(T/C)(A/C)G(A/T)

GATCA(T/C)TT(T/C)GG-3’，fRPB2-7cR：5’-CCCAT(A/G)GCTTG(T/C)

TT(A/G)CCCAT-3’，菌株CCTCC-TW20622的rpb2序列全长为1146bp，如下所示：

目前木霉分子鉴定序列比对网站有www.isth.info和www.ncbi.nlm.nih.gov。

将ITS序列提交www.isth.info中的TrichOKEY进行比对，结果分别在97、118、265、423、525处发现了木霉的5个DNA寡核苷酸条形编码，表明CCTCC-TW20622为木霉属，但在该数据库中找不到与该序列同源性较高的序列信息，初步表明该菌株可能为新种。

将ITS序列提交www.ncbi.nlm.nih.gov进行比对，CCTCC-TW20622与TrichodermagamsiistrainTJG4[KJ652466.1]同源性为99%；将tef1序列提交NCBI进行比对，CCTCC-TW20622与TrichodermagamsiistrainTK7a[KR051477.1]同源性为97%；将rpb2序列提交NCBI进行比对，CCTCC-TW20622与TrichodermagamsiistrainS488[KJ665270.1]同源性为99%。

利用与CCTCC-TW20622的同源性大于95%的rpb2序列构建系统发育进化树（如说明书附图图1所示），CCTCC-TW20622与TrichodermagamsiistrainS488[KJ665270.1]位于同一分支，同源性99.3%，与TrichodermaneokoningiistrainG.J.S.04-216[KJ665318]同源性98.4%，与其它菌株的同源性都较低。

将CCTCC-TW20622接种PDA和SNA培养基，分别于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下培养3d，测量菌落半径，结果见表1。相同温度下，CCTCC-TW20622在PDA培养基上的生长速度比SNA快，在2种培养基上的最适生长温度为25℃左右，菌株在40℃不生长。

表1CCTCC-TW20622在不同培养基、不同温度下培养3d的菌落半径（mm）

。

CCTCC-TW20622在SNA培养基上25℃培养7d，气生菌丝白色稀疏，卷毛状，无水溶性色素产生，无明显分生孢子产生；25℃培养10d，可见少量灰绿色分生孢子产生。

CCTCC-TW20622在PDA培养基上25℃培养7d，气生菌丝白色絮状，培养基背面淡黄色，无明显分生孢子产生，有椰子香气味；25℃培养10d，接种处有少量黄绿色分生孢子产生。

CCTCC-TW20622在CMD培养基上25℃培养7d，气生菌丝奶白色，网状，培养基背面淡黄色，无明显分生孢子产生，有椰子香气味；25℃培养10d，气生菌丝成白色菌丝团或浅黄色颗粒，无明显分生孢子产生。

25℃下培养7d的平板形态见说明书附图图2。

CCTCC-TW20622在显微镜（40×100×）下分生孢子、分生孢子梗、厚垣孢子形态见说明书附图图3所示，分生孢子黄绿色，椭圆形，大小约（4.5~2.3）μm×（3.2~2.3）μm，分生孢子梗属Trichoderma组，有长的主轴，侧枝常对生，瓶梗十字形轮生。瓶梗（5.4~2.9）μm×（3.4~1.5）μm。PDA培养基培养4d产生厚垣孢子，亚球形，间生或端生，大小约（10.7~6.5）μm×（10.2~6.4）μm。

根据上述分子鉴定结果和形态特征，与CCTCC-TW20622较相近的木霉种类为T.gamsii和T.neokoningii。通过比较发现（表2），CCTCC-TW20622与上述2种木霉间存在较大区别，主要表现在串珠状瓶梗、产孢簇、厚垣孢子产生方式、分生孢子形态等方面。故CCTCC-TW20622不属于T.gamsii或T.neokoningii，应为新种，命名为厚垣孢木霉（Trichodermachlamydospora）。

该木霉TrichodermachlamydosporaCCTCC-TW20622在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，其保藏编号是：CGMCCNO.11337，菌种的拉丁文名称是Trichodermachlamydospora，参据的微生物（株）：CCTCC-TW20622，保藏日期是2015年9月8日。

表2CCTCC-TW20622与系统发育关系邻近菌株的形态特征比较

。

实施例3：平板对峙培养实验

在PDA平板直径两端距中心35mm处分别接种直径5mm的木霉菌株和病原真菌（终极腐霉），以只接种病原真菌的为对照，25℃培养，记录病原真菌菌落直径，计算抑制率。

抑制率（%）=100%×（对照病原真菌直径-处理病原真菌直径）/对照病原真菌直经

多数木霉菌株在PDA平板上对终极腐霉都有一定的抑制作用，不同菌株的抑制能力不同，菌株CCTCC-TW20622对终极腐霉有强烈的抑制作用，25℃对峙培养4d，已完全覆盖终极腐霉，且终极腐霉的气生菌丝成塌陷现象，抑制率达100%（图4）。

显微镜检表明，CCTCC-TW20622可穿透终极腐霉的菌丝，终极腐霉菌丝呈裂解、破碎现象（图5）。

实施例4：平板水解酶活性检测

终极腐霉属卵菌，为低等真菌，细胞壁主要成分为纤维素和葡聚糖，故本实验主要检测木霉菌株CCTCC-TW20622的纤维素酶活性和β-1,3-葡聚糖酶活性。分别配制β-1,3-葡聚糖酶培养基和纤维素培养基，接种CCTCC-TW20622，25℃培养5d，平板用1mg/mL刚果红染色20min，用1mol/LNaCl冲洗1~2次，清水冲洗干净，观察水解圈大小。分别记录菌落直径和水解圈直径，计算酶活比值。

酶活比值=水解圈直径/菌落直径

纤维素培养基(L):葡萄糖0.5g，KH₂PO₄15g，(NH₄)₂SO₄5g，CaCl₂0.6g，MgSO₄*7H₂O0.6g，FeSO₄*7H₂O0.005g，MnSO₄*H₂O0.0016g，ZnSO₄*7H₂O0.0014g，CoCl₂*6H₂O0.0037g，CMCNa10g，琼脂15g。

β-1,3-葡聚糖酶培养基(L):葡萄糖0.5g，酵母浸出粉6.7g，茯苓粉10g，KCl0.2g，(NH₄)₂HPO₄1g，MgSO₄*7H₂O0.2g，琼脂15g。

结果表明，CCTCC-TW20622的纤维素酶和β-1,3-葡聚糖酶酶活比值分别为0.52、0.25，水解圈明显（图6）。

实施例5：厚垣孢子可湿性粉剂的工业化生产流程

（1）斜面菌种：采用固体PDA培养基，将菌株接种在试管培养基上，25℃培养2d～3d。

（2）三角瓶菌种：采用液体PDB培养基，将试管菌种接种在液体三角瓶中，置于摇床上25℃振荡培养1d～2d。

（3）液体培养：采用发酵培养基（玉米粉2%，葡萄糖0.5%，豆饼粉4%，磷酸氢二钾0.2%，磷酸二氢钾0.2%，碳酸钙0.5%，pH5.5~6.0），115℃灭菌30min，将三角瓶种接种发酵罐，接种量0.2%，25℃培养，溶氧量40%～50%，通气量1：0.6～0.8，搅拌速度为160r/min，培养24h后，添加0.4%草酸，调整发酵参数：25℃培养，溶氧量20%～30%，通气量1：0.4～0.6，搅拌速度为140r/min，继续培养24h～30h，至厚垣孢子量达到5亿/mL以上时，结束发酵。

（4）制剂制备：配方如下：

发酵液20mL

凹凸棒土（300目）78g

羧甲基纤维素钠0.8g

茯苓粉0.8g

黄原胶0.2g

SDS0.2g

实施例6：制剂对茄子猝倒病的温室防治试验

茄子品种为大红袍，北京澳硕丰农业科技有限公司，对照药剂为甲霜灵；试验设3个处理：处理1为制剂，处理2为药剂，处理3为对照CK，每处理设4个重复，随机区组排列。2周后调查成苗率，计算防治效果。

防治效果（%）=100%×(每盆成苗率-对照成苗率)/(1-对照成苗率)。

结果见表3，各处理间在p=0.01水平上存在显著性差异，制剂处理后对茄子猝倒病的防治效果达到了94.9%。

表3制剂对茄子猝倒病的温室防治效果

。

(注：数据采用SPSS10.0统计软件中的Duncan方法进行分析，结果为4次重复的平均值±标准差，以不同大写字母表示各处理间在0.01水平上存在显著性差异。)

实施例7：制剂对番茄猝倒病的小区药效试验

番茄品种为日本京宝，济南大江种子有限公司，对照药剂为72.2%霜霉威盐酸盐水剂（烟台鑫润精细化工有限公司），试验地设在山东省科学院中试基地，设5个处理，分别为：制剂25g/亩、制剂50g/亩、制剂75g/亩、霜霉威、清水对照。4次重复，共20个小区，小区面积6m²，随机排列。病原真菌用小米制备，提前7d施入土中，用量为2g/m²。试验制剂及对照药剂按使用浓度对水稀释，均匀喷灌在苗床上。4周后调查发病株数，计算病情指数和防治效果。

结果见表4，不同用量的制剂对番茄猝倒病均有显著的防治效果，与对照药剂霜霉威间在p=0.01水平上存在显著性差异，亩用量50g和75g处理组之间在p=0.01水平上无显著性差异，防治效果均达到了90%以上，效果显著，建议菌剂使用量为50g/亩左右为佳。

表4制剂对番茄猝倒病的田间药效试验

。

(注：数据采用SPSS10.0统计软件中的Duncan方法进行分析，结果为4次重复的平均值±标准差，以不同大写字母表示各处理间在0.01水平上存在显著性差异)。

SEQUENCELISTING

<110>山东省科学院中日友好生物技术研究中心

<120>一种防治植物终极腐霉病害的木霉菌株及制剂

<130>无

<160>9

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>合成

<400>1

cttggtcatttagaggaagtaa22

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>合成

<400>2

tcctccgcttattgatatgc20

<210>3

<211>613

<212>DNA

<213>Trichodermachlamydospora

<400>3

ggaagtaaaagtcgtaacaaggtctccgttggtgaaccagcggagggatcattaccgagt60

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<213>合成

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<212>DNA

<213>合成

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<213>合成

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<212>DNA

<213>合成

<400>8

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<211>1146

<212>DNA

<213>Trichodermachlamydospora

<400>9

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gctata1146。

Claims

1.一种防治植物终极腐霉病害的木霉菌株，其特征在于，该木霉菌株为厚垣孢木霉CCTCC-TW20622，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是CGMCCNO.11337，保藏日期是2015年9月8日。

2.根据权利要求1所述的一种防治植物终极腐霉病害的木霉菌株，其特征在于，该木霉在PDA平板上对终极腐霉抑制率高达100%，该木霉产生的纤维素酶和葡聚糖酶可消解终极腐霉的细胞壁，引起菌丝破裂；该木霉液体发酵厚垣孢子产量为5亿/mL。

3.根据权利要求1所述的一种防治植物终极腐霉病害的木霉菌株，其特征在于，该木霉ITS扩增引物：ITS1-F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAG

TAA-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，菌株CCTCC-TW20622的ITS序列全长为613bp，如下所示：

4.根据权利要求1所述的一种防治植物终极腐霉病害的木霉菌株，其特征在于，该木霉tef1扩增引物：EF1-728F：5’-CATCGAGAAGTTCGAG

AAGG-3’，EF200R：5’-GCCATCCTTGGAGATACCAGC-3’，菌株CCTCC-TW20622的tef1序列全长为649bp，如下所示：

5.根据权利要求1所述的一种防治植物终极腐霉病害的木霉菌株，其特征在于，该木霉rpb2扩增引物：fRPB2-5F：5’-GA(T/C)GA(T/C)

(A/C)G(A/T)GATCA(T/C)TT(T/C)GG-3’，fRPB2-7cR：5’-CCCAT(A/G)

GCTTG(T/C)TT(A/G)CCCAT-3’，菌株CCTCC-TW20622的rpb2序列全长为1146bp，如下所示：

6.如权利要求1所述木霉菌株制备的防治植物终极腐霉病害的制剂，其特征在于，由该木霉经过斜面培养、三角瓶培养、液体培养后得到的发酵液，以及凹凸棒土、羧甲基纤维素钠、茯苓粉、黄原胶、SDS组成。

7.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述的发酵液制备过程为：

8.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，步骤（3）中，发酵培养基为，玉米粉2%，葡萄糖0.5%，豆饼粉4%，磷酸氢二钾0.2%，磷酸二氢钾0.2%，碳酸钙0.5%，余量为水，pH5.5~6.0。

9.根据权利要求8所述的制剂，其特征在于，由以下成分组成：

发酵液20mL

凹凸棒土（300目）78g

羧甲基纤维素钠0.8g

茯苓粉0.8g

黄原胶0.2g

SDS0.2g。