CN104673715A - 对镉具有固定效应并能促进植物生长的肠杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明为对镉具有固定效应，并能促进植物生长的肠杆菌及其应用，解决重金属镉污染的问题及镉污染土壤中植物难以生长的问题。其拉丁文名Eterobacter sp，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年8月25日，保藏编号：CGMCC No.9539。本发明菌株对镉的吸附效应可以聚集水污染环境中镉进而去除，达到净化水体的目的；同时，本发明菌株也可以吸附固定土壤中的重金属镉，降低土壤中有效镉的含量；此外，本发明菌株具有合成分泌生长素IAA的效应，能够促进植物快速生长，在实际生产中有着广泛的应用前景。

Description

对镉具有固定效应并能促进植物生长的肠杆菌及其应用

技术领域：

本发明与土壤中筛选的微生物有关，尤其与有高固定镉性能的细菌肠杆菌及其在重金属镉污染水体及土壤的生物修复中的应用有关。

背景技术：

重金属作为一类危害很大的污染物，具有移动性，周期长，易积累，毒性大等特点，随着人类活动的加剧，越来越多的重金属污染物通过大气沉降、污水灌溉、固体废弃物排放以及农药和化肥的施用等途径进入土壤和水体，而土壤与水源都是人类赖以生存的资源。因此，如何阻止和减少重金属通过土壤、水源、食物链等途径危害人类的健康，受到社会及学界的普遍关注。

镉（Cd）是一种稀有分散的重金属，在自然界中背景值较低，广泛应用于人类活动的工业、农业生产等领域。工业上应用包括塑料稳定剂、着色剂、电镀、抗腐剂和抗摩擦剂、光敏元件和电池生产等行业；农业生产上，镉化合物有时会被添加到杀虫剂和杀菌剂中，直接施于人类赖以生存的土壤中，造成对植物和土壤、水体环境的污染。与其它重金属相比，镉的毒性更大、生物有效性更高、更容易被生物利用积累，不仅直接影响土壤和水体的生态结构，还会影响植物的生长发育，降低植物产量和品质，并通过食物链、水源危及动物和人类，诱发肝、肾、骨骼病变，还有致癌作用，是目前污染面积最大、危害最大的重金属污染物之一。我国镉污染耕地面积已达1.3×104 hm²，每年约有5.0×10⁷ kg的稻米镉含量超标。2003年农业部稻米及制品质量监督检验测试中心对我国各地稻米质量安全普查结果表明，按照我国稻米Cd含量0.2 mg·kg^-1的限量标准（GB15201—1994），镉的超标率超过10%，一些镉污染地区的稻米Cd含量高达0.4–1.0 mg·kg^-1，远远超过我国谷物中镉的最高许可量标准。

因此，寻找一种能够有效治理镉污染的方法是当前一个重要的课题。重金属污染治理，传统的方法有工程治理措施、物理化学修复、化学修复措施，包括吸附法、电化学处理法、离子交换法、萃取法和膜分离法等。但在实际应用中，工程治理措施在花费大量人力金钱的情况仍然只是治标不治本；物理化学修复方法只适合小范围的污染修复；化学修复通过对重金属的吸附作用、氧化还原作用、拮抗或沉淀作用降低重金属污染，是治理重金属污染应用较多的方法，但也可能存在化学物质二次污染的风险。

近年来，随着生物技术的发展，利用特定的生物，如植物、微生物或原生动物的吸收、转化、清除或降解作用，钝化、固定或去除环境污染物，实现环境净化、恢复生态效应的生物修复污染物的措施日益受到重视。重金属污染物的生物治理技术，是一种环境友好的、不引入二次污染的生物处理技术，能够有效地切断重金属污染的废水、土壤介质对水源和食物链的污染途径，消除重金属污染给人类健康带来的潜在威胁，具有良好的经济效益和应用前景。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种对重金属镉具有高吸附和固定作用的肠杆菌。

本发明的另一目的在于提供上述肠杆菌在去除水体镉污染、修复镉污染土壤和促进植物生长方面的应用。

本发明是这样实现的：

对镉具有固定效应，并能促进植物生长的肠杆菌，其拉丁文名Enterobacter sp.，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

保藏日期：2014年8月25日，保藏编号：CGMCC NO.9539。

所述的肠杆菌在去除水体镉污染、固定土壤中的镉，降低土壤中有效态镉的含量方面的应用。

所述的肠杆菌在促进植物生长方面的应用。

本发明提供的肠杆菌对重金属镉具有固定的效应，可以有效地吸附聚集污染水体中的镉，最终达到去除镉污染的目的；同时，本发明所述的肠杆菌可以有效地吸附固定土壤中的镉，减少土壤中有效态镉的含量，最终达到修复镉污染土壤的目的；此外，本发明肠杆菌具有生物合成和分泌植物生长素IAA的效应，生长素具有显著促进植物生长的作用。

附图说明：

图1为溶液中镉离子去除效果及pH值随时间变化曲线图。

图2为肠杆菌LY6处理不同时间后土壤中不同形态镉的含量图。

注：EC-可交换态；CC-碳酸盐结合态；FM-铁锰氧化物结合态；OF-有机质结合态；RS-残渣态。

图3为未经肠杆菌LY6处理土壤中不同形态镉的含量图。

注：EC-可交换态；CC-碳酸盐结合态；FM-铁锰氧化物结合态；OF-有机质结合态；RS-残渣态。

图4为LY6分泌IAA随着培养时间变化的情况图

具体实施方式：

实施例1：

对镉具有固定效应和对植物具有促长作用的肠杆菌，其拉丁文名Enterobacter sp.，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年8月25日，保藏编号：CGMCC NO.9539。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明肠杆菌Enterobacter sp.，自编号LY6，详细分离筛选步骤如下：

（1）样品采集：2012年10月采取四川省什邡市某磷石膏废渣附近土壤0—20cm土层样品。

（2）镉抗性菌分离：称取土样10g置于盛有100ml无菌水的250ml灭菌三角瓶中，置28℃摇床中振荡半小时得悬浮液，再用无菌水逐步将悬浮液稀释至10^-3，10^-4，10^-5三种稀释度待用，分别取0.1ml上述稀释悬浮液涂布于含100mgCd²⁺的固体有氮改良基础培养基平板，每个稀释度涂布3个平板，置28℃温箱中培养一周，长出的菌株为镉抗性菌。固体有氮改良基础培养基配方如下：蔗糖，10g；K₂HPO₄，2g；(NH4)₂SO₄，1g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；CaCO₃，0.1g；酵母膏，0.5g；NaCl，0.1g；琼脂粉18g；蒸馏水，1L，pH 7.2。

（3）划线分离：将步骤（2）中得到的9个平板上的镉抗性菌挑取不同的菌落分别在固体有氮改良基础培养基平板划线培养，直到分离到纯菌落为止，将分离到的纯菌株接种到斜面培养基上，菌长出后放4℃冰箱中待用。斜面培养基组成同固体有氮改良基础培养基。

（4）分泌IAA菌株的筛选：将步骤（3）中得到的各个镉抗性菌株分别接种于有50ml液体R2A培养基的三角瓶中，并置于28℃摇床培养，转速为150rpm，培养4d后，取其菌悬液50 μL滴置于白色陶瓷板上，同时加50 μL比色液(Salkowski 比色液:50mL35%HClO4 +1mL0.5mol/LFeCl3)于该菌悬液中。将白色陶瓷板置室温下避光放置30 min后观察其颜色变化。颜色变粉红者为阳性，表示能够分泌IAA，颜色越深表示分泌的强度越大，不变色为阴性，表示不能分泌IAA。选择菌悬液颜色最深菌株命名为LY6，LY6菌悬液显示深粉红色，表明具有显著的IAA分泌性能。本发明的R2A培养基配方如下：0.5g酵母浸粉，0. 5g胰蛋白胨，0. 5g酪蛋白氨基酸，0.5g葡萄糖，0.5g可溶性淀粉，0.3g丙酮酸钠，0.3gK₂HPO₄，0.05gMgSO₄·7H₂O，0.5 g L-色氨酸，蒸馏水定容至1000 mL，pH为7.2±0.2。

（5）菌株去除液体培养基中镉离子性质鉴定：将步骤（4）分离到的既具有镉抗性又具有较强分泌IAA能力的菌株LY6单克隆转接到盛有50ml液体有氮基础培养基的250ml三角瓶中培养至指数期作为种子液，接1%体积的的种子液到含100mg/LCd²⁺的液体有氮基础培养基的三角瓶中，28℃，150rpm恒温震荡培养5天，10000g离心去除菌体后测定上清液中镉离子含量。镉离子含量测定方法采用水中镉的测定方法GB 7475-1987 水质 铜、锌、铅、镉的测定原子吸收分光光度法。镉的去除率可达到70-75%，去除效果明显。

（6）对镉具有吸附作用和促进植物生长效应的菌株LY6具有如下特征：

菌落形态特征：菌落圆形，微黄色，表面光滑湿润，半透明，有光泽，边缘整齐。

菌株形态特征：利用电镜形态鉴定和革兰氏染色分析。特征如下：杆状，直径0.9μm～1.2μm，长2.5μm～4.0μm，革兰氏阳性。

生理生化特征：兼性厌氧，最适pH7.4～7.6。能利用柠檬酸盐和醋酸盐作为唯一碳源，发酵山梨醇、蔗糖、棉子糖、蜜二糖，不发酵肌醇。赖氨酸脱羧酶阴性，鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶均阳性，IMViC实验：-、-、+、+，尿素酶阳性，苯丙氨酸脱氨酶阴性，不产H₂S，

（7）菌株LY6的分类鉴定：利用16S rDNA鉴定，即采用细菌16S rDNA通用引物7F（CAGAGTTTGATCCTGGCT）和1540R（AGGAGGTGATCCAGCCGCA）进行PCR扩增其16S rDNA并测序，再与国际NCBI GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）核苷酸数据库比对，核苷酸同源性为99%，结合菌落、菌体形态特征鉴定为肠杆菌（Enterobacter sp.）。于2014年8月25日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏，其保藏号为CGMCC NO.9539。分类命名为：肠杆菌（Enterobacter sp.）。

实施例2：

肠杆菌LY6去除水中镉的效果。

（1）从斜面保藏管接种一环肠杆菌LY6到50 ml有氮基础培养基中，置28℃摇床中，150rpm振荡培养到指数期，作为种子液；培养基配方如下：蔗糖，10g；K₂HPO₄，2g；(NH4)₂SO₄，1g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；CaCO₃，0.1g；酵母膏，0.5g；NaCl，0.1g；蒸馏水，1L，pH 7.2。

（2）取步骤（1）中得到的种子液，以1%体积的接种量接种到1L新鲜培养基中，加入无菌CdCl₂溶液，使Cd²⁺终浓度为100mg/L，置于28℃摇床中振荡培养；

（3）每间隔6小时取步骤（2）中得到的培养液10 ml，10000g离心后测定上清液中Cd²⁺含量及培养液pH值，绘制肠杆菌去除镉离子效果曲线如图1。

从图1可以看出，经过45-70小时的处理，镉的去除率可达到70-75%，去除效果明显。实际应用中，采用本发明所提供的菌株接种镉污染水体，待菌株生长繁殖吸附镉沉淀后的清水即为净化后的水体。

实施例3：

肠杆菌LY6土壤中镉的状态变化

（1）从斜面保藏管接种一环肠杆菌LY6到50ml有氮基础培养基中，置28℃摇床中150rpm/min振荡培养到指数期，作为种子液；取种子液以1%体积的接种量接种到0.5L新鲜培养基中，置28℃摇床中150rpm/min振荡培养至指数期待用。培养基配方如下：蔗糖，10g；K₂HPO₄，2g；(NH4)₂SO₄，1g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；CaCO₃，0.1g；酵母膏，0.5g；NaCl，0.1g；蒸馏水，1L，pH 7.2。

（2）取步骤（1）中得到菌液以1%体积的接种量加入到盛有40g镉污染浓度为10mg/kg土壤的培养皿中，置28℃恒温培养箱中培养待测；

（3）每间隔7天取步骤（2）中培养皿土样测定其不同形态镉的含量。测试方法采用参考文献“刘丽娟等. 不同改良剂对污染土壤中Cd形态影响的研究。农业环境科学学报，2013，32（9）：1778-1785”中公布的方法。接种LY6菌悬液的土壤中可交换态镉（EC）、碳酸盐结合态镉（CC）、铁锰氧化物结合态镉（FM）、有机质结合态镉（OF）、残渣态镉（OF）的含量如图2所示，图3表示未接种LY6菌悬液的土壤中个相映形态的镉含量水平。

从图2与图3的比较可以看出，通过接种肠杆菌LY6经过28天（4周）的菌种繁殖，土壤中可交换态镉含量显著降低，与未接种LY6的土壤镉形态相比，接种LY6的土壤有至少50%的镉分别以碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机质结合态等非活性形态被吸附固定，大大降低了土壤中可交换态等有效态镉的含量，减少镉对植物的污染。

实施例4：

肠杆菌LY6分泌生长素IAA的效应

（1）从斜面保藏管接种一环肠杆菌LY6到50ml培养基中，置28℃摇床中150rpm/min振荡培养到指数期，作为种子液；取种子液以1%体积的接种量接种到0.5L新鲜培养基中，置28℃摇床中150rpm/min振荡培养，取不同时期的培养液测定其生长素（IAA）的含量。

培养基配方如下：0.5g酵母浸粉，0. 5g胰蛋白胨，0. 5g酪蛋白氨基酸，0.5g葡萄糖，0.5g可溶性淀粉，0.3g丙酮酸钠，0.3gK₂HPO₄，0.05gMgSO₄·7H₂O，0.5 g L-色氨酸，蒸馏水定容至1000 mL，pH为7.2±0.2。

（2）IAA的测定，取步骤（1）中不同培养时期的菌悬液5mL，分别于10,000 g离心10min，取上清液加入等体积Salkowski 比色液，避光静置30min，采用分光光度法测定其IAA的含量，具体测定方法参考文献：“姜晓宇 等，水稻种子内生细菌多样性及其分泌植物生长素能力的测定，微生物学报，2013,53(3):269-275”，测定结果见图4。

从图4中可以看出，肠杆菌LY6具有较强的分泌植物生长素（IAA）活性，随着菌种快速繁殖，IAA含量逐渐增加，在肠杆菌LY6生长3天（72小时）后达到最大IAA产出量，单位菌悬液中IAA含量达到225mg。

Claims (3)

1.对镉具有固定效应，并能促进植物生长的肠杆菌，其特征在于其拉丁文名Enterobacter sp，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年8月25日，保藏编号：CGMCC NO.9539。

2.如权利要求1所述的肠杆菌在去除水体镉污染、固定土壤中的镉，降低土壤中有效态镉的含量方面的应用。

3.如权利要求1所述的肠杆菌在促进植物生长方面的应用。