CN110616164A - 一种可活化难溶性磷、镉的阴沟肠杆菌y16及其应用 - Google Patents

一种可活化难溶性磷、镉的阴沟肠杆菌y16及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可活化难溶性磷、镉的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）Y16，所述菌株于2018年12月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCC No：60524；所述阴沟肠杆菌Y16丰富了根系促生菌的种质资源库，菌株适应能力强，在土壤中分布广泛，易于培养；同时，所述阴沟肠杆菌Y16不仅对难溶性磷和镉具有良好的溶解效果，在土壤重金属修复方面也具有极大的应用潜力。

Description

一种可活化难溶性磷、镉的阴沟肠杆菌Y16及其应用
技术领域
本发明属于土壤污染微生物处理技术领域，具体地，涉及一种可活化难溶性磷、镉的阴沟肠杆菌Y16及其应用。
背景技术
近年来，由于矿山开发、农田污水灌溉、污泥肥料的使用等人类活动，使得土壤重金属污染已成为全球主要的环境问题。其中Cd污染是最常见的重金属污染之一，镉能抑制植物的生长发育，植物中的Cd会刺激活性氧的形成而破坏光合作用机制。并且，动物会通过食物链将富有Cd污染的植物摄入体内，进一步危害动物的健康。可见，Cd是对生态系统和人类健康最有害的物质之一。
植物修复是一种很有前景的土壤重金属污染修复技术，而且越来越受到人们的广泛关注。与传统方法相比，植物修复更便宜，对人类和环境更安全，然而植物修复存在生物量小、生长缓慢的不足。为提高植物修复的效率，研究人员将其作为植物根系促生菌，利用根系促生菌与超富集植物联合修复土壤重金属污染。
国内外学者已筛选出许多具有良好促生性能的根系促生菌株，CN105408468A公开了植物促生细菌和使用方法，所述细菌培养物中含有阴沟菌株CAP12，阿氏芽孢杆菌菌株CAP53、阿氏芽孢杆菌菌株CAP56等18种菌株，用于刺激植物生长；CN1160023公开了一种治理各种电镀废水的复合功能菌，所述CB复合功能菌中含有阴沟肠杆菌CB1.129、脱硫杆菌CB1.168等5种菌种，用于治理电镀废水中的铬等金属。专利CN2018105108843公开了一株玉米根系内生阴沟肠杆菌及其应用，所述阴沟肠杆菌P1-7具有自身固氮能力、无机磷分解能力、有机磷分解能力、解钾能力和IAA能力，能够提高玉米甜度、改善菜心口感和提高菜心维生素C含量等等。
然而，上述专利中所述促生细菌或复合功能菌或由多种菌株组成，或仅公开了植物促生长功能，并未涉及微生物与植物联合修复土壤重金属Cd方面的研究。
目前尚未发现既有良好促生性能又具有良好溶磷溶镉性能的菌株用于提高植物修复土壤中Cd污染。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种可活化难溶性磷、镉的阴沟肠杆菌（Enterobacte cloacae）Y16，所述阴沟肠杆菌Y16丰富了根系促生菌的种质资源库，菌株适应能力强，在土壤中分布广泛，易于培养；同时，对难溶性磷和镉具有良好的溶解效果，在土壤重金属修复方面也具有极大的应用潜力。
本发明的第二个目的是提供上述阴沟肠杆菌Y16的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种可活化难溶性磷、镉的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）Y16，所述菌株于2018年12月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），菌种保藏号为GDMCC No：60524，分类命名号为Enterobacter cloacae Y16，保藏地址为：中国广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明所述的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）Y16菌株是从重金属污染种植的龙葵根系土壤中分离筛选获得的；在LB平板培养基上，28 ℃，培养14 h，可形成圆形或近似圆形、质地软、稍有光泽的乳白色菌落。投射电镜（TEM）下菌体细胞呈杆状，宽约0.6～1.1μm，长约1.2～3.0 μm，有鞭毛。经生理生化检测，该菌为革兰氏阴性菌。另外，该菌株的最适生长条件为：温度26～30℃，pH为6.0～7.5。
优选地，所述阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）Y16的16S rDNA基因序列如SEQID NO:1所示，通过NCBI官方网站站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的 BLAST程序与其他已登录细菌菌株16S rDNA序列进行比对，结果表明该菌株与Enterobacter cloacae相似性最高，同源率达100%。
本发明的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）Y16具有溶解难溶性磷和镉的能力。将制备好的阴沟肠杆菌Y16菌种悬液接种于含有难溶性磷和Cd的培养基中，发现阴沟肠杆菌增加了培养基中可溶性磷、镉的含量，在接种后第二天对难溶性磷和镉的溶解率达到29.53%、64.67%，而对照组难溶性磷和镉的溶解率为4.54%、11.83%；可见，本发明所述阴沟肠杆菌Y16对难溶性磷和镉有良好的溶解效果。
因此，本发明请求保护所述阴沟肠杆菌Y16在活化难溶性磷和/或镉中的应用。
基于所述阴沟肠杆菌Y16能够活化难溶性磷和/或镉，故可以将上述阴沟肠杆菌Y16制备成一种用于活化难溶性磷和/或镉的微生物菌剂。
因此，本发明还请求保护所述阴沟肠杆菌Y16在制备活化难溶性磷和/或镉的微生物菌剂中的应用。
另外，本发明还提供一种微生物菌剂，所述菌剂包含阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）Y16。
优选地，所述微生物菌剂为含有阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）Y16菌悬浮液的颗粒剂、粉剂、溶液、悬乳液或棒剂等。
将本发明所述阴沟肠杆菌Y16接种于种植有Cd污染龙葵的根系土壤中，以未接菌的种植有Cd污染龙葵的根系土壤为对照，在相同条件下进行盆栽试验，于60天后收获，发现与对照组相比，所述阴沟肠杆菌Y16显著促进了龙葵生物量（茎叶+根），增加了龙葵对土壤Cd的累积量；在60天收获时，接种阴沟肠杆菌Y16的龙葵生物量（茎叶+根）和龙葵对土壤Cd的累积量（茎叶+根）较对照组分别增加了51.45%、73.28%。由此可见，阴沟肠杆菌Y16在Cd污染的土壤修复中具有极大的应用潜力。其主要原因为，阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）Y16可活化土壤中难溶性镉，使植物可以更好的吸收活化状态的镉离子，提高植物对镉的吸收量。
因此，本发明还请求保护所述阴沟肠杆菌Y16在土壤重金属污染修复中的应用，以及阴沟肠杆菌Y16在提高超累积植物对土壤重金属污染修复能力中的应用；具体为：所述阴沟肠杆菌Y16与超累积植物联用用于提高超累积植物对土壤重金属污染修复能力。
优选地，所述重金属为镉。
优选地，所述植物为龙葵。
由于阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）Y16可充分活化难溶性磷，提高植物对磷的吸收，促进植物生长。因此，所述阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）Y16促进植物生长和/或在制备植物促生长剂中的应用亦在本发明保护范围内。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明从重金属污染土壤中分离得到了一株可活化难溶性磷、镉的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）Y16，所述菌株于2018年12月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），菌种保藏号为GDMCC No：60524。所述阴沟肠杆菌Y16丰富了根系促生菌的种质资源库，菌株适应能力强，在土壤中分布广泛，易于培养；同时，所述阴沟肠杆菌Y16不仅对难溶性磷和镉具有良好的溶解效果，在土壤重金属修复方面也具有极大的应用潜力。
附图说明
图1为阴沟肠杆菌Y16在CAS筛选培养基筛选培养2天时的生长形态特征。
图2为阴沟肠杆菌Y16的扫描电镜照片图。
图3为阴沟肠杆菌Y16的16SrRNA系统发育树图。
图4为阴沟肠杆菌Y16对难溶性磷、镉的溶解效果。
图5为阴沟肠杆菌Y16对龙葵了累积土壤镉的促进影响。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 菌株的分离与鉴定
1、菌株分离
采集种植有镉污染龙葵的根系土壤1 g，至盛有9 mL无菌水的试管中，制备成1 g/mL的土壤悬液，将其稀释为102、103、104、105倍，得到不同浓度的土壤悬液；
吸取不同浓度的悬液10 μL至CAS蓝色检测平板，涂平板后，置于28℃生化培养箱中培养48 h，当铁载体存在时，由于铁载体能与Fe3+形成更加稳定的螯合物，伴随着Fe3+从其结合的蓝色化合物转移到铁载体中而发生颜色变化，其蓝色变为橙色（见图1）；挑取具有较大橙色晕圈的单个菌落在LB培养基中纯化，接种至LB斜面培养基，于4℃冰箱中保存，菌株编号为阴沟肠杆菌（Enterobactercloacae）Y16。
将所述阴沟肠杆菌（Enterobactercloacae）Y16菌株置于LB平板培养基上于28℃，培养14 h，可形成圆形或近似圆形、质地软、稍有光泽的乳白色菌落。另外，将Y16菌株在Cd(NO3)2·4H2O浓度为100，200，300 mg·L-1的LB平板固体培养基上划线，至28℃恒温培养箱中培养24h，结果发现Y16菌可以在Cd浓度100mg·L-1的LB平板固体培养基上生长，在200，300 mg·L-1浓度下均未发现有菌的生长，因此，Y16菌最小Cd耐受浓度为200mg·L-1。
2、菌株鉴定
（1）扫描电镜观察鉴定：将纯化后的阴沟肠杆菌（Enterobactercloacae）Y16菌株接入含有10 mL的LB液体培养基培养过夜，吸取800 μL菌液经8000 rpm离心3～5 min，去上清液，加入500 μL PBS溶液洗菌3次，在收获的菌体沉淀中加入1 mL的2.5%戊二醛充分混匀，4℃静置过夜。然后再次经8000 rpm离心3～5 min，去上清液，加入500μL PBS溶液洗菌3次。随后将菌体分别在30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脱水2次，每个梯度浸泡15min，然后8000 rpm离心去上清液，最后用乙酸异戊酯置换乙醇2次，每次20 min，操作方法同上述乙醇脱水过程，经过CO2干燥后制片观察。
扫描电镜结果如图2所示，可见在扫描电镜下阴沟肠杆菌Y16菌体呈短杆状，宽约0.6～1.1 μm，长约1.2～3.0 μm。
（2）生理生化特征鉴定：阴沟肠杆菌Y16菌株的生理生化鉴定指标包括12项，具体的生理生化鉴定结果如表1所示：
表1. 阴沟肠杆菌Y16的生理生化特征鉴定
底物 阴沟肠杆菌Y16 底物 阴沟肠杆菌Y16
邻硝基苯-半乳糖苷酶 + 葡萄糖发酵 +
精氨酸双水解酶 + 甘露醇 +
赖氨酸脱羧酶 − 肌醇 −
鸟氨酸脱羧酶 + 山梨醇 +
柠檬酸盐 + 鼠李糖 +
硫化氢 − 蔗糖 +
脲素酶 + 密二糖 +
苯丙氨酸脱氨酶 + 苦杏仁苷 +
吲哚 − 阿拉伯糖 +
乙酰甲基甲醇 + 氧化酶 −
明胶
注： “＋”代表阳性；“－”代表阴性
（3）分子鉴定：提取阴沟肠杆菌Y16菌株的细菌总DNA，用细菌16S rDNA通用引物对该菌基因组进行PCR扩增，PCR产物经测序（由广州美吉生物完成测序）后，将测序结果与GenBank中已报道的其他菌株的16S rDNA序列进行同源性比对，并选取相关菌种做进化树分析（见图3）。
结果表明，阴沟肠杆菌Y16菌株与Enterobacter cloacae相似性最高，同源率达100%。
综上，结合阴沟肠杆菌Y16菌株的形态特征和生理生化指标以及分子鉴定结果发现，本发明分离获得的阴沟肠杆菌Y16菌株属于阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae），因此发明人将该菌株命名为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）Y16，并于2018年12月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），菌种保藏号为GDMCC No：60524，分类命名号为Enterobacter cloacae Y16；保藏地址为中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2 阴沟肠杆菌Y16活化难溶性磷、镉的能力测定
一、方法
S1.菌悬液的制备：将纯化后的阴沟肠杆菌Y16菌接种于含有100 mL的LB液体培养基中，于28℃摇床中培养14小时至对数生长期，经5000 rpm离心10 min收集菌体，用无菌水洗菌3次后重悬，调节OD600=0.8作为菌悬液。
S2.向100mL溶磷溶镉培养基中接种上述菌悬液2 mL，以不接菌的溶磷溶镉培养基作为阴性对照，并调节pH为7.0～7.5，每组三个重复，在28℃，150 rpm恒温摇床培养7天，2天后取样，利用原子吸收分光光度计和钼酸盐比色法分别测定培养基中的镉、磷含量。
其中，所述溶镉溶磷功能培养基配方如下：NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.53 g，MnSO4·H2O 0.02 g，KCl 0.30 g，(NH4)2SO4 0.50 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，葡萄糖 1.00 g，去离子水1000 mL，Ca3(PO4)2 2.1 mmoL·L-1（0.668 g·L-1），CdCO3 60 mg·L-1 ，pH 7.0～7.5。
二、结果
试验结果如图4所示，与对照组相比，溶磷溶镉培养基摇床培养2天后，接种该菌培养基中的水溶性磷、镉含量显著增加，未接菌培养基中磷、镉的溶解率分别为4.54%、11.83%；而接种阴沟肠杆菌Y16的培养基中磷、镉的溶解率分别达到了29.53%、64.67%。由此可见，该菌能够高效溶解培养基中的难溶性磷、镉，在镉污染土壤中的植物微生物联合修复土壤镉污染过程中，对于提高土壤中有效镉的生物有效性，促进植物吸收具有良好的应用潜力。
实施例3 阴沟肠杆菌Y16对龙葵累积土壤镉的促进效果
一、方法
S1. 供试土壤制备：土壤选自广州市天河区棠东土，去除异物后室内风干、磨碎、混匀，过4 mm筛；土壤总Cd含量为1.37 mg/kg，其中可交换态0.46 mg/kg，碳酸盐结合态0.21 mg/kg，铁锰氧化物结合态0.54 mg/kg，有机碳结合态0.08 mg/kg，残渣态0.08 mg/kg，pH为6.28；
S2. 取镉污染土1.5 kg/每盆，加入去离子水使其含水量为最大田间持水量的60%，保持2天，每盆播种龙葵10粒，10天之后生长稳定，约8厘米，4片叶子，间苗，每盆留4株苗，每隔10天每盆接上述菌悬液30 mL，接菌5次之后收获龙葵，同时以未接菌的龙葵为对照组；
S3. 将茎叶、根放置105℃烘箱内杀青30 min后，于75℃烘干至恒重，称量茎叶、根至干重，将烘干的茎叶、根粉碎，称取0.2 g茎叶和根，分别加8 mL硝酸微波消解，用石墨原子吸收分光光度计测定消解茎叶、根的Cd体积浓度。
二、结果
结果如图5所示，与未接菌对照相比，阴沟肠杆菌Y16显著促进了龙葵对土壤镉的累积效果。在接菌60天后收获的龙葵中，龙葵的生物量、对土壤镉的累积总量分别为7.81 g/盆、22.37 μg/盆。对照组未接菌的龙葵的生物量、对土壤镉的累积总量分别为5.16g/盆、12.91μg/盆。可见，阴沟肠杆菌Y16能够显著提高龙葵的生物量，促进龙葵对土壤中镉的累积，可作为土壤重金属修复的理想微生物。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一种可活化难溶性磷、镉的阴沟肠杆菌Y16及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1444
<212> DNA
<213> 阴沟肠杆菌Y16 (Enterobacter cloacae Y16)
<400> 1
catggaatac aaagtggtaa gcgccctccc gaaggttaag ctacctactt cttttgcaac 60
ccactcccat ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgtggcat 120
tctgatccac gattactagc gattccgact tcatggagtc gagttgcaga ctccaatccg 180
gactacgacg cactttatga ggtccgcttg ctctcgcgag gtcgcttctc tttgtatgcg 240
ccattgtagc acgtgtgtag ccctactcgt aagggccatg atgacttgac gtcatcccca 300
ccttcctcca gtttatcact ggcagtctcc tttgagttcc cggccggacc gctggcaaca 360
aaggataagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tttcacaaca cgagctgacg 420
acagccatgc agcacctgtc tcagagttcc cgaaggcacc aaagcatctc tgctaagttc 480
tctggatgtc aagagtaggt aaggttcttc gcgttgcatc gaattaaacc acatgctcca 540
ccgcttgtgc gggcccccgt caattcattt gagttttaac cttgcggccg tactccccag 600
gcggtcgact taacgcgtta gctccggaag ccacgcctca agggcacaac ctccaagtcg 660
acatcgttta cggcgtggac taccagggta tctaatcctg tttgctcccc acgctttcgc 720
acctgagcgt cagtctttgt ccagggggcc gccttcgcca ccggtattcc tccagatctc 780
tacgcatttc accgctacac ctggaattct acccccctct acaagactct agcctgccag 840
tttcgaatgc agttcccagg ttgagcccgg ggatttcaca tccgacttga cagaccgcct 900
gcgtgcgctt tacgcccagt aattccgatt aacgcttgca ccctccgtat taccgcggct 960
gctggcacgg agttagccgg tgcttcttct gcgggtaacg tcaatcgaca aggttattaa 1020
ccttatcgcc ttcctccccg ctgaaagtac tttacaaccc gaaggccttc ttcatacacg 1080
cggcatggct gcatcaggct tgcgcccatt gtgcaatatt ccccactgct gcctcccgta 1140
ggagtctgga ccgtgtctca gttccagtgt ggctggtcat cctctcagac cagctaggga 1200
tcgtcgccta ggtgagccgt taccccacct actagctaat cccatctggg cacatccgat 1260
ggcaagaggc ccgaaggtcc ccctctttgg tcttgcgacg ttatgcggta ttagctaccg 1320
tttccagtag ttatccccct ccatcaggca gtttcccaga cattactcac ccgtccgcca 1380
ctcgtcagcg aagcagcaag ctgcttcctg ttaccgttcg actgcatgtg tagcctgccg 1440
ccct 1444

Claims (10)

1.一种可活化难溶性磷、镉的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）Y16，其特征在于，所述菌株于2018年12月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCCNo：60524。
2.根据权利要求1所述的阴沟肠杆菌Y16，其特征在于，所述菌株的16S rDNA序列如SEQID NO：1所示。
3.权利要求1所述阴沟肠杆菌Y16在活化难溶性磷和/或镉中的应用。
4.权利要求1所述阴沟肠杆菌Y16在制备活化难溶性磷和/或镉的微生物菌剂中的应用。
5.一种微生物菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）Y16。
6.权利要求1所述阴沟肠杆菌Y16在土壤重金属污染修复中的应用。
7.权利要求1所述阴沟肠杆菌Y16在提高超累积植物对土壤重金属污染修复能力中的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述重金属为镉。
9.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述植物为龙葵。
10.权利要求1所述的阴沟肠杆菌Y16在促进植物生长中的应用。
CN201910060313.9A 2019-01-22 2019-01-22 一种可活化难溶性磷、镉的阴沟肠杆菌y16及其应用 Pending CN110616164A (zh)

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