CN113699059B - 一株耐镉促生类芽孢杆菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种耐镉促生类芽孢杆菌菌株及其应用，属于微生物技术领域。所述菌株名称为Paenibacillus silvae DHP7，保藏编号：GDMCC No：61651。该菌株与植物共生，能解决植物低磷胁迫和镉毒胁迫的技术问题。该菌株具有耐酸、耐镉、溶磷和产铁载体的特性。大豆接种该菌株能提高大豆的生物量(干重)和根部磷含量、显著降低体内镉浓度，促进大豆根生长；而且能提高大豆的耐镉毒能力，克服镉对大豆生长抑制的作用，具有很高的应用价值。

Description

一株耐镉促生类芽孢杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种耐镉促生类芽孢杆菌菌株及其应用。

背景技术

镉是一种移动性、积累性很强的高毒性重金属，是危害人畜健康和造成农作物严重减产的常见污染物之一。土壤镉积累超标是制约农业生产发展的主要因素之一。镉能够通过影响酶活系统、激素水平、细胞和细胞器结构、代谢活动和其他养分吸收等途径影响植株的正常生理生化过程。当植物体内的镉积累量达到一定浓度时，就会对植物产生毒害作用，导致生长迟缓，矮小，叶片变黄，光合作用降低，根系生长受到抑制，严重时甚至会造成植株死亡。

磷作为植物生长发育过程中必需营养元素之一，在植物整个生长发育过程中起着重要作用。由于土壤中大部分磷被土壤中的有机质或化学物质固定，世界上大部分农业生产用地中的有效磷含量都非常低。在酸性土壤中，磷主要以铝-磷和铁-磷的形式存在，石灰性土壤中主要以钙-磷的形式存在。同时，可溶性磷肥施用于土壤不久后大部分也会转化为不溶形式，很难被植物利用。因此，在土壤总磷库中，植物能够吸收利用的可溶性磷是非常少的，土壤中磷的有效性低成为制约作物生产的主要因素。

土壤微生物和植物紧密相关，植物与土壤微生物的共存能显著影响植物的生长发育。筛选具有促生及耐镉能力强的新菌株对于提高农业产量、缓解作物镉胁迫、扩大可使用耕地面积具有重要意义。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种耐镉促生类芽孢杆菌菌株。该菌株为类芽孢杆菌(Paenibacillus silvae)DHP7，该菌株与植物共生，能解决植物低磷胁迫和镉毒胁迫的技术问题。该菌株具有耐酸、耐镉、溶磷和产铁载体的特性。大豆接种该类芽孢杆菌(Paenibacillus silvae)DHP7能提高大豆的生物量(干重)和根部磷含量、显著降低体内镉浓度；而且能克服镉对大豆生长抑制的作用。

本发明的另一目的在于提供上述类芽孢杆菌(Paenibacillus silvae)DHP7在培育耐镉毒植物方面的应用。

本发明的另一目的在于提供上述类芽孢杆菌(Paenibacillus silvae)DHP7在减弱镉抑制植物生长方面的应用。

本发明的另一目的在于提供上述类芽孢杆菌(Paenibacillus silvae)DHP7在促进植物吸收磷方面的应用。

本发明的另一目的在于提供上述类芽孢杆菌(Paenibacillus silvae)DHP7在制备适用于植物的生长促进剂、抗镉毒微生物农药、或促磷吸收菌剂方面的应用。

本发明的另一目的在于提供上述类芽孢杆菌(Paenibacillus silvae)DHP7在溶解难溶性磷方面的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种耐镉促生类芽孢杆菌菌株，菌株命名为Paenibacillus silvaeDHP7，是从韶关市曲江区北约村镉污染土种植大豆巴西10号的根内分离纯化得到。

所述的Paenibacillus silvae DHP7的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号：GDMCC No：61651，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期：2021年5月11日。

所述菌株DHP7具有耐酸、耐镉、溶磷和产铁载体的特性，能显著提高大豆生物量、磷含量，且使大豆耐镉的菌株。

所述菌株DHP7形态特征如下：DHP7生长最适温度为37℃，在LB平板培养基上，形成近似圆状，光滑，突起，乳白色菌落，革兰氏染色为红色，为革兰氏阴性菌。

研究显示，该类芽孢杆菌菌株DHP7能显著促进大豆吸收磷，提高大豆耐镉的能力。因此本发明要求保护：

类芽孢杆菌菌株DHP7在培育耐镉毒植物方面的应用，尤其是用于培育耐镉毒大豆科植物，克服镉对大豆科植物生长的抑制作用。

类芽孢杆菌菌株DHP7在减弱镉抑制植物生长方面应用，尤其是在镉毒胁迫下促进大豆科植物的生物量提高，或制备能够减弱镉抑制植物生长的产品方面的应用。

类芽孢杆菌菌株DHP7在促进植物吸收磷方面的应用，尤其是促进大豆科植物吸收磷，或制备能够促进植物吸收磷的产品方面的应用。

类芽孢杆菌菌株DHP7在溶解难溶性磷方面的应用，其中，优选所述的难溶性磷为Ca₃(PO₄)₂。

类芽孢杆菌菌株DHP7在制备适用于植物的生长促进剂、抗镉毒微生物农药、或促磷吸收菌剂方面的应用。

其中，优选地，所述植物为大豆科植物。

上述应用，包括如下步骤：

利用所述的类芽孢杆菌菌株DHP7的菌悬液浇灌处理大豆苗；

具体优选地，所述处理的方式为浇灌；

更优选地，具体包括如下步骤：大豆种子育苗后，在含镉及低磷处理的栽培介质中浇灌所述的类芽孢杆菌菌株DHP7的菌悬液，然后在移苗后1、3、5天各浇灌一次；其中优选地，每次浇灌的量为80～120mL/颗苗；优选地，所述的菌悬液OD₆₀₀为0.6～1.0。

进一步的，每次浇灌的量为100mL/颗苗。

进一步的，镉的浓度为0～20mg/kg Cd，且不为0。

进一步的，低磷处理为每盆加入250mg/kg难溶性磷酸三钙。

其中，作为一种可选择的实施方案，所述的菌悬液的分散介质为低磷营养液，其配方如下：2.5mM KNO₃，2.5mM Ca(NO₃)₂·4H₂O，0.08mM Fe-Na-EDTA，0.25mM K₂SO₄，1mMMgSO₄·7H₂O，4.5×10^-3mM MnCl₂·4H₂O，0.3×10^-3mM ZnSO₄·7H₂O，0.16×10^-3mM CuSO₄·5H₂O，0.16×10^-3mM(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，20×10^-3mM H₃BO₃，50×10^-3mM KH₂PO₄。

一种生物制剂，基于上述耐镉促生类芽孢杆菌菌株制备得到。

所述的生物制剂由该耐镉促生类芽孢杆菌菌株经液体培养制备得到，优选包含以下步骤：将该耐镉促生类芽孢杆菌菌株接种至LB液体培养基中培养，即可获得生物制剂。

所述的培养指在35～40℃，pH4.5～7.0、150～200r/min下培养15～24h。

进一步的，所述的培养指在37℃，pH7.0、180r/min下培养18h。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明提供一株耐镉促生类芽孢杆菌菌株DHP7，其与植物共生，能够：

(1)促进植物生长，促进植物吸收磷含量，提高其生物量，尤其适用于大豆科植物。

(2)提高植物的耐镉毒能力，克服镉对植物的生长抑制作用，尤其是克服镉对大豆的生长抑制作用，具有很高的应用价值。

(3)该菌株具有耐酸、耐隔、溶磷和产铁载体的特性。

附图说明

图1是类芽孢杆菌菌株DHP7的溶磷圈。

图2是类芽孢杆菌菌株DHP7的耐镉曲线(OD₆₀₀-镉浓度)。

图3是类芽孢杆菌菌株DHP7的耐酸曲线(OD₆₀₀-pH)。

图4是类芽孢杆菌菌株DHP7的系统发育进化树。

图5是接种类芽孢杆菌菌株DHP7的大豆在镉毒胁迫下，其生长表现及地上部和根部干重的变化。

图6是接种类芽孢杆菌菌株DHP7的大豆在镉毒胁迫下，其地上部镉浓度和根部镉浓度的变化。

图7是接种类芽孢杆菌菌株DHP7的大豆在镉毒胁迫下，其地上部磷含量和根部磷含量的变化。

图中*:0.01<P<0.05，**:0.001<P<0.01，***:P<0.001。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1：菌株的分离纯化

1.菌株的分离及纯化

利用韶关市曲江区北约村镉污染土种植大豆巴西10号，在大豆根内分离获得菌株。称取洗净后的大豆根部组织1g左右，清洗干净后放在超声仪中去除表面杂质，然后用75％乙醇漂洗消毒，10％的次氯酸钠溶液浸泡5～10min，浸泡完成后用无菌二级水漂洗3～5次，将灭菌后的根部组织放入无菌研钵中，少量多次添加无菌二级水共5mL，研磨成匀浆，将浆液稀释至10^-1、10^-2、10^-3不同浓度梯度，每个浓度取0.1mL匀液均匀涂布于LB固体平板上，三次重复，37℃培养，每日观察菌落生长情况，挑取不同表型的单克隆，给每种菌落在培养基背面编号，防止重复挑取，并记录菌落形态和长出菌落的时间，每种类型挑取单克隆到1.5mL离心管中摇菌，在180r/min，37℃条件下培养，再经LB固体培养基划线纯化3～4次后。从长出菌落的平板上挑取形态差异的菌落进行多次纯化至菌落形态一致、加入浓度为25％灭菌甘油混匀速冻于-80℃保存待用。

实施例2：菌株筛选

2.1溶磷菌的初筛

将筛选出的菌株接种于无机磷固体培养基(PKO固体培养基)(配方为：葡萄糖10.0g/L，磷酸三钙3.0g/L(液体培养基10.0g/L)，硫酸铵0.1g/L，氯化钾0.2g/L，硫酸镁0.25g/L，酵母粉0.5g/L，琼脂15g/L，pH 7.0。)上，每个平板点接三次，28℃培养箱培养，在第7d测量菌株溶磷圈外直径(D)和菌落直径(d)的大小并拍照，有溶磷圈的即能够溶磷。然后比较(D/d)的比值，对菌株的溶磷能力进行判断。

吸取1mL具溶磷圈的菌株的菌液，接种于20mL LB液体培养基中(50mL的离心管)，24h培养后，测定OD₆₀₀为1.0左右，取1mL菌重悬液接种于20mL PKO液体培养基中(50mL的离心管)，每个菌株三次重复，CK对照组为接种等量的无菌水，放置在28℃，180r/min摇床中培养。在第7d测定PKO液体培养基的pH值，并吸取1mL上清液(1200r/min，离心5min)到25mL容量瓶待测，吸取5mL钼锑抗显色液，用二级水定容至25mL，反应30min后，使用酶标仪测定880nm处的吸光度值(为了去除培养基颜色的影响，应用880nm测定，通过换算公式，得出在标准曲线(y＝0.4833x+0.0002(R²＝0.9997)。换算得到相应的磷浓度(mg/L)。

结果：发现菌株DHP7的溶磷圈比值1.43(图1和表1)。在溶磷定量试验中，菌株DHP7表现出较强的溶磷能力，可溶解到90.89±1.80mg/L的磷。

表1

菌株编号	D(cm)	d(cm)	D/d	溶解磷浓度(mg/L)
					DHP7	0.67	0.47	1.43	90.89±1.80

2.2产铁载体能力的筛选

吸取1mL待测菌株的菌悬液，接种于MKB液体培养基(配方为：酪蛋白氨基酸5.0g/L、甘油15mL/L、磷酸二氢钾2.5g/L、七水硫酸镁2.5g/L，pH7.2)中。在28℃，180r/min下培养48h。培养液离心10min(1200r/min)，取200μL上清液(参比值(Ar)为测定时加入200μL未接种的MKB液体培养基)，按照1：1的比例与CAS检测液混合。常温反应1h后，酶标仪测定630nm下波长OD值(A)。实验中，若不产铁载体，则CAS液体培养基和对照一样呈蓝色，若菌株产铁载体，则CAS液体培养基变化为橘黄色。以A/Ar的比值表示样品中铁载体的相对含量，值越小，则表示菌株产铁载体的能力越强，以(Ar-A)/Ar的比值表示样品中铁载体的活性单位，活性单位越高，产铁载体能力越强。

结果发现，DHP7菌株在所筛选的菌株中产铁载体的活性单位较高，达到42.10％。

2.3耐镉能力筛选

用CdCl₂·5/2H₂O分别配制镉浓度为0、4、8、12、16、20mg/L的6个LB液体培养基，121℃，20min灭菌。准备2个96孔灭菌细胞培养板，吸取配制好的不同镉浓度的LB液体培养基各200μL到培养板。待测菌株活化培养24h后，每个菌株吸取5μL到不同镉浓度值的培养孔中，每个菌株4次重复，37℃，180r/min下培养48h，测定菌液在600nm下的吸光值。

结果显示：在0～8mg/L Cd浓度条件下，DHP7的生长速度有下降趋势，但差异不显著，耐镉性较强(图2)。

2.4耐酸能力筛选

分别配制pH至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的6个LB培养基，121℃，20min灭菌。准备2个96孔灭菌细胞培养板，吸取配制好的不同pH的LB液体培养基各200μL到培养板。待测菌株活化培养24h后，每个菌株吸取5μL到不同pH值的培养孔中，每个菌株4次重复，37℃，180r/min下培养48h，测定菌液在600nm下的吸光值。

结果显示，菌株DHP7在pH为4.5～7.0之间生长速度差异不大(图3)，在pH5.5时生长显著增加，说明该菌株在酸性条件下也能够生长的很好，耐酸性强。

实施例3菌株鉴定

经过多方面综合考虑，对筛选的菌株DHP7进行鉴定。

3.1菌株的形态学鉴定

将菌株DHP7接种在LB固体培养基上进行培养，并观察记录。在最适生长条件(pH7.0，温度37℃)培养5～7天后，将分离并纯化得到的菌株DHP7进行单菌落状态观察，主要包括菌落的大小、颜色、菌落表面状态和菌落边缘状态等。

在LB平板培养基上，菌株DHP7形成近似圆状，光滑，突起，乳白色菌落，革兰氏染色为红色，为革兰氏阴性菌。

3.2分子鉴定

经过多方面筛选和综合考虑，筛选菌株DHP7进行鉴定并继续研究。将菌株接种于LB培养基中37℃，180r/min培养24小时后，采用细菌总DNA提取试剂盒提取菌株的总DNA，送广州睿博生物技术有限公司进行测序，将得到的菌株DHP7的16S rDNA序列在NCBI数据库进行Blast序列比对分析，使用MEGA7.0构建系统发育进化树(图4)。根据测序及进化树结果显示，DHP7与Paenibacillus silvae strain DB13031同源性最高，因此，将该菌株DHP7命名为Paenibacillus silvae DHP7。

所述的Paenibacillus silvae DHP7的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号：GDMCC No：61651，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期：2021年5月11日。

所述的Paenibacillus silvae DHP7的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例4类芽孢杆菌菌株DHP7的回接大豆试验

4.1回接试验

本研究采用基质土盆栽试验。实验设置三种镉浓度组，采用CdCl₂·5/2H₂O分别设置镉浓度为0、10、20mg/kg Cd，接种菌株DHP7，并以不接种菌株DHP7的处理作为对照(CK)；且每盆均为低磷处理，每个处理4个重复，具体如下：

基质和蛭石的混合基质处理方法：称取无肥基质和蛭石按照3：1混合(0.5kg混合基质＝0.375kg无肥基质+0.125kg蛭石)，121℃灭菌40min，间隔24h后重复一次灭菌，放置一周后备用。取容量2L的花盆，用10％的次氯酸钠浸泡过夜后用清水充分冲洗数次，风干备用。称取定量氯化镉溶于水，配制镉浓度为0、10、20mg/kg的溶液，量取一定体积倒入混合基质中，同时每盆(0.5kg)混入125mg难溶性磷酸三钙Ca₃(PO₄)₂(相当于纯磷50mg/kg)，每盆称取混匀，静置一周待用。

种子用盐酸-次氯酸钠产生氯气灭菌4h，用粗砂：中砂＝1：2的混合砂来育苗，育苗一周后，挑选生长基本一致的大豆植株(巴西10号)，每盆移栽一株。移苗后1、3、5天浇灌菌悬液，一次100mL，合计3次。

菌悬营养液的配制：菌株接种于250mL LB培养液，在37℃摇床中，180r/min振荡培养18h左右，待菌液浑浊测定OD₆₀₀在0.6到1.0之间，离心收集菌体用低磷营养液重悬至OD₆₀₀约为1.0，得到菌重悬营养液；用灭菌枪头拨开幼苗根部表面基质，将菌重悬营养液倒入根部，菌体随营养液浇灌到基质中。

其中所述的低磷营养液的配方为：2.5mM KNO₃，2.5mM Ca(NO₃)₂·4H₂O，0.08mMFe-Na-EDTA，0.25mM K₂SO₄，1mM MgSO₄·7H₂O，4.5×10^-3mM MnCl₂·4H₂O，0.3×10^-3mMZnSO₄·7H₂O，0.16×10^-3mM CuSO₄·5H₂O，0.16×10^-3mM(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，20×10^-3mMH₃BO₃，50×10^-3mM KH₂PO₄。

4.2指标检测

培养大豆30天后收获。将作物地上部和根部分开，地上部分放入105℃烘箱杀青30min后，在烘箱烘干后，取出在室温下放置10min冷却后称量干重。根部称重，同样经过杀青后烘干，称干重。

根部浸泡在10mmol/L Na₂-EDTA溶液中5min以除去表面吸附的Cd²⁺，然后用二级水冲洗干净，75℃烘干称取干重。接着，地上部和根部测定磷浓度和镉浓度。磷浓度采用干灰化后紫外分光光度法测定，镉浓度采用干灰化后原子吸收分光光度计火焰吸收法测定。

结果如下：

(1)在20mg/kg Cd²⁺条件下，接种了菌株DHP7的大豆植株地上部和根部干重均显著高于不接菌处理(CK)，表明接种DHP7能够促进大豆生长且缓解大豆镉毒害(图5)。

(2)10mg/kg Cd²⁺条件下，对比CK不接菌，接种DHP7菌株的大豆地上部镉浓度显著降低了21.4％，在20mg/kg Cd²⁺条件下，对比CK不接菌，接菌DHP7后根部镉浓度极显著降低了34.0％，表明DHP7能够缓解大豆根部镉毒害，并且降低根部镉向地上部转运(图6)。

(3)10mg/kg Cd²⁺条件下，对比CK不接菌，DHP7处理的根部磷含量极显著增加了3.6倍，在20mg/kg Cd²⁺条件下，对比CK不接菌，接种DHP7菌株也能有效提高大豆根部磷含量(图7)，表明接种DHP7菌株能够在低磷条件下促进大豆根系对磷的吸收，从而缓解镉毒害。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一株耐镉促生类芽孢杆菌菌株及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Paenibacillus silvae DHP7的16S rDNA序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (146)..(146)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 1

cagtcgagcg gagttgangg aaagcttgct ttcctgatac ttagcggcgg acgggtgagt 60

aacacgtagg caacctgccc tcaagcttgg gacaactacc ggaaacggta gctaataccg 120

aatacttgtt ttcttcgcct gaaggnaact ggaaagacgg agcaatctgt cacttgagga 180

tgggcctgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta 240

gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300

aggcagcagt agggaatctt ccgcaatggg cgaaagcctg acggagcaat gccgcgtgag 360

tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgccaggga agaacgcttg ggagagtaac 420

tgctctcaag gtgacggtac ctgagaagaa agccccggct aactacgtgc cagcagccgc 480

ggtaatacgt agggggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg 540

tcatgtaagt ctggtgttta atcccggggc tcaaccccgg atcgcactgg aaactgcgtg 600

acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 660

ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tgggctgtaa ctgacgctga ggcgcgaaag 720

cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgaatgctag 780

gtgttagggg tttcgatacc cttggtgccg aagttaacac attaagcatt ccgcctgggg 840

agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg acccgcacaa gcagtggagt 900

atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc caactaacga 960

ggcagagatg cgttaggtgc ccttcgggga aagttgagac aggtggtgca tggttgtcgt 1020

cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tatatttagt 1080

tgccagcatt tcggatgggc actctaaata gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg 1140

ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtact acaatggccg 1200

gtacaacggg cagtgaagcc gcgaggtgga accaatccta aaaagccggt ctcagttcgg 1260

attgcaggct gcaactcgcc tgcatgaagt cggaattgct agtaatcgcg gatcagcatg 1320

ccgcggtgaa tacgttcccg ggtcttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagtttata 1380

acacccgaag tcggtggggt aaccgcaagg agccagccgc 1420

Claims (8)

1.一种耐镉促生类芽孢杆菌（Paenibacillus silvae）菌株DHP7，其特征在于：于2021年5月11日保藏于广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No：61651。

2.一种生物制剂，其特征在于：包括权利要求1所述的耐镉促生类芽孢杆菌菌株。

3.权利要求1所述的耐镉促生类芽孢杆菌菌株或权利要求2所述的生物制剂在培育耐镉毒大豆中的应用。

4.权利要求1所述的耐镉促生类芽孢杆菌菌株或权利要求2所述的生物制剂在减弱镉抑制大豆生长或制备能够减弱镉抑制大豆生长的产品中的应用。

5.权利要求1所述的耐镉促生类芽孢杆菌菌株或权利要求2所述的生物制剂在促进大豆吸收磷或制备能够促进大豆吸收磷的产品中的应用。

6.权利要求1所述的耐镉促生类芽孢杆菌菌株或权利要求2所述的生物制剂在溶解Ca₃(PO₄)₂中的应用。

7.根据权利要求3～5任一项所述的应用，其特征在于：

利用权利要求1所述的类芽孢杆菌菌株的菌悬液浇灌处理大豆苗；

且包括如下步骤：大豆种子育苗后，在含镉及低磷处理的栽培介质中浇灌所述的类芽孢杆菌菌株的菌悬液，然后在移苗后1、3、5天各浇灌一次。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：

每次浇灌的量为80～120 mL/颗苗；

所述的菌悬液OD₆₀₀为0.6～1.0。

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