CN114350559B - 一株耐盐促生的辽宁慢生根瘤菌ry6菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐盐促生的辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaoningense)RY6菌株及其应用，所述菌株于2021年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2021478。本发明所述RY6菌株具有较强的耐盐能力，是花生的高效匹配菌株，接种后可使花生高效结瘤并达到高产的特性，以不接菌对比，接种该根瘤菌能够显著提高花生的产量，产量提高86.03％以上，能广泛适用于我国南方土壤，并且能够使花生达到高产，具有较大的应用前景。

Description

一株耐盐促生的辽宁慢生根瘤菌RY6菌株及其应用

技术领域

本发明涉及功能微生物技术领域，更具体地，涉及一株适合南方花生种植的具有耐盐能力且能使花生高效结瘤、促进生长的辽宁慢生根瘤菌RY6菌株及其应用。

背景技术

氮素是植物生长最重要的营养元素之一，土壤中氮素主要由土壤矿物分解出的氮、土壤微生物所固定的氮及施用化肥的氮三部分组成。农业生产中氮肥的施用是保证高产的重要手段，但盲目的大量施用氮肥使得土壤中化肥的含量已大大超过了土壤库容和作物吸收的需要，导致化肥利用率降低，同时造成土壤板结及环境污染等生态问题。统计表明，我国氮肥的利用率极低，50％以上通过氨挥发、径流、硝化-反硝化、淋洗等途径损失。生物固氮具有高效和环境友好的特点，据统计报告估算，全球每年粮食、油料和纤维作物生长所需的氮肥价值达330 亿美元,其中豆科作物的生物固氮作用提供了约50亿美元的氮源。据计算，全世界每年收获的农产品约从土壤中带走11000万吨氮素，而现代合成氨工业所能提供的氮素仅为4500万吨，即使其利用率高达60-70％也只能提供世界农业对氮素需要的20-30％，其余的70-80％，均来自有机肥料和生物固氮。接种根瘤菌是豆科作物种植必要的栽培手段，豆科植物与根瘤共生能将大气中的N₂转化为NH⁴⁺，此过程是高效和环境友好的。据估计，全球每年生物固氮量达1.75亿吨，为世界工业氮肥产量的4.37倍，其中通过豆科植物和根瘤菌所固定的氮素约有5500 万吨。在美国、巴西等国家，接种根瘤菌面积一般都占播种面积的50％以上，既改善了土壤，保护了环境，又有利于维持氮素平衡。目前，我国共生固氮的基础研究已达到国际先进水平，但根瘤菌剂的产业化和大面积推广应用却很落后，豆科作物接种根瘤菌剂的面积仅占播种面积的1％～3％，与国外相比差距甚大。

根瘤菌与豆科植物共生受豆科植物、根瘤菌及土壤理化性状的影响，只有在特定环境下筛选出的高效根瘤菌菌株接种到相应豆科植物上才能发挥最大的固氮效率。豆科植物接种根瘤菌除有固氮作用外，还有融磷和分泌生长素等促进植物生长的作用。

花生(Arachis hypogaea Linn.)是主要的油料作物，在南方适宜的气候条件下可以1年3熟。花生接种高效根瘤菌有较强的固氮能力，实践证明，花生在播种时，采用人工接种根瘤菌，一般能增产15％左右。花生栽培接种根瘤菌技术至今已有40余年，在山东施用“富思德”，在常规施肥基础上施用固体根瘤菌肥比常规施肥处理的根瘤数、产量和效益分别增加261.97％、15.2％和50835元/hm²。在常规施肥基础上减少氮肥一半用量并分别施用固体和液体花生根瘤菌肥的两处理比常规施肥根瘤数增加247.18％、8％；产量增加8.4％、7.9％；效益增加2870.7 元/hm²、3346.8元/hm²。

在南方花生适合种植于沙壤中，而在沿海区域的沙壤含盐量都较高，故需筛选耐盐的根瘤菌株用于接种才能达到增产的目的。有的根瘤菌还能溶解难容性磷和分泌生长素，在盐胁迫下接种根瘤至少有缓解植物的营养亏缺，提高植物的耐盐能力的作用。苜蓿接种耐盐根瘤菌的研究表明：盐渍地接种耐盐根瘤菌可使紫花苜蓿干草产量提高50.0％～93.2％，根系生物量提高39.2～44.53％，结瘤量提高70.97～73.39％，第二茬的草产量提高91.6～104.7％，接种根瘤菌显著的提高了苜蓿的成苗率和生长势。例如中国专利公开了一株适合东北地区的抗逆固氮的慢生根瘤菌DBPB1，然而目前尚无适合南方花生种植具有耐盐能力且能促进生长的根瘤菌菌株和菌剂。故从我国南方种植花生不同类型土壤中筛选适合于特定区域的花生高效固氮根瘤菌有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一株适合南方花生种植的具有耐盐能力且能促进生长、根瘤固氮的辽宁慢生根瘤菌RY6菌株。

本发明的第二个目的在于提供所述辽宁慢生根瘤菌RY6菌株的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一株耐盐促生的辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaoningense)RY6菌株，所述菌株于2021年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2021478。

具体地，所述辽宁慢生根瘤菌RY6菌株其16S rDNA序列如SEQ ID NO 1 所示。

本发明RY6菌株从南方花生主要种植地采集新鲜根瘤回到实验室进行分离和纯化而来，并对菌株的16S rDNA部分序列进行测定，通过系统发育分析，确定为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaoningense)的新株系，并命名为热研6号(RY6)，并将该菌株于2021年4月 28日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO： M 2021478。本发明的辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumliaoningense)RY6菌株通过耐盐试验、实验室盆栽、回接试验证明其具有较强的耐盐能力，且接种花生后后可使花生高效结瘤并达到高产的特性，以不接菌对比，接种该根瘤菌能够显著提高花生的产量，产量提高86.03％以上，可适用于花生种植中，作为花生常规栽培的措施之一。

因此，本发明请求保护所述辽宁慢生根瘤菌RY6菌株或其发酵菌液在花生根瘤固氮促生长中或在制备花生根瘤菌菌剂中的应用。所述促生长具体表现在促进花生的整株鲜重增加、花生产量增加和根瘤数量增加。

本发明还提供一种根瘤菌菌剂，所述菌剂含有上述辽宁慢生根瘤菌RY6菌株或其发酵菌液。

优选地，所述发酵菌液的浓度为大于1×10⁹CFU/mL。

进一步优选地，还包括菌体吸附材料。

进一步优选地，所述菌体吸附材料包括但不限于草炭、蛭石、珍珠岩或椰糠中的任一一种或多种。

进一步优选地，所述发酵菌液与菌体吸附材料的比例为：10mL发酵菌液 /15～50g菌体吸附材料。混合比例优选10mL菌液/50g草炭、10mL菌液/15g蛭石或10mL菌液/15g珍珠岩。其中以50％的草炭和50％椰糠混合制备的菌剂性价比最高。

本发明还提供上述任一所述根瘤菌菌剂在花生根瘤固氮促生长中的应用。

一种促进花生根瘤固氮的方法，是将上述辽宁慢生根瘤菌RY6菌株接种于液体培养基得到发酵菌液后拌种或直接回接到花生根部，或将上述任一所述根瘤菌菌剂在花生播种前拌种或直接回接到花生根部。

优选地，所述液体培养基为YMA液体培养基。

优选地，所述拌种处理为用菌液浸泡种子8分钟～10分钟。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株适合南方花生种植的具有耐盐能力且能促进生长、根瘤固氮的辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaoningense)RY6菌株，所述菌株具有较强的耐盐能力，是花生的高效匹配菌株，接种后可使花生高效结瘤并达到高产的特性，以不接菌对比，接种该根瘤菌能够显著提高花生的产量，产量提高86.03％以上；本发明的辽宁慢生根瘤菌RY6菌株能广泛适用于我国南方土壤，并且能够使花生达到高产，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为根瘤菌RY6菌落图。

图2为根瘤菌RY6革兰氏染色图。

图3为根瘤菌RY6回接检验图。

图4为RY6琼脂糖凝胶电泳图。

图5为NCBI比对图。

图6为RY6根瘤菌聚类分析图。

图7为回接RY6花生产量变化图。

图8为回接根菌RY6后的结瘤情况。

图9为RY6生长曲线。

图10为RY6耐NaCl OD值。

图11为施用RY6草炭菌剂后产量变化图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1根瘤菌RY6的获得和培养

本发明于2019年7月20于海南省澄迈县瑞溪乡三多村花生种植地中(E110.7511111 N19.76166667 H11.9)采集到一株根瘤数量多、根瘤大、生长茂盛的花生根瘤，剪掉花生地上部分将整个根系连同根瘤一起装入保鲜袋后置于冰袋中低温保存。

(1)从冰袋中取出花生的根系在自来水下冲洗2～3遍，将根系冲洗干净，用剪刀将新鲜完整、颜色暗红的根瘤带2mm的根剪下，于培养皿中用2级水将表面冲洗干净；此过程要确保根瘤表面的完整。

(2)将冲洗干净的根瘤转移到灭菌后的培养皿中，加入95％(体积比浓度) 的酒精浸泡3分钟后，将酒精倒出，用无菌水冲洗4～5次，加入0.1％(质量体积浓度，0.1g HgCl₂/100mL水)的HgCl₂水溶液灭菌2～3分钟，迅速将HgCl₂倒出并加入无菌水，转移进超净工作台操作，用无菌水冲洗6遍以上，将无菌水倒出，选取根瘤转移至灭菌后的培养皿中(可在火焰上灭菌)，用灭菌后的的镊子和接种环将根瘤捣碎，蘸取乳白色汁液在准备好的YMA固体培养基上划线。将划好的板倒置于保鲜袋中置于培养箱(28±1℃、黑暗)中培养。

YMA培养基配方如表1，调节pH值为6。

表1 YMA(Yeast Mannitol Agar)培养基配方(L^-1)

(3)在培养的第3天开始检查培养基上是否有长出菌落，直至第15天左右，将菌落标记出来记录形态和光泽度。

在培养过程中从以下3点来确定是否为根瘤菌：

a.菌落形态：根瘤菌生长初期菌落水样的半透明或白色不透明点状物后期菌落为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐、粘质或多或少。培养2～4天菌落直径达2～4mm为快生型根瘤菌，培养5～10天菌落才1mm的为慢生型根瘤菌。

b.菌体形态：标记初步确认为根瘤菌菌落，从中挑取菌苔涂片，进行革兰氏染色，在100倍显微镜下观察。根瘤菌为(0.5～0.9)×(1.2～0.3)μm的小杆菌。内常含β-羟基丁酸，即折射强的似空洞的颗粒或使菌体呈环节状，革兰氏阴性(G-)，无芽孢，菌体单个或成对；

c.通过将分离出的根瘤菌在无菌条件下回接到花生上，能结瘤的则为根瘤菌。

根瘤菌RY6的形态特征：根瘤菌RY6为慢生根瘤菌属的一种，培养3天后沿第一笔涂布的痕迹开始有水样带状半透明的突起，到第4天以后突起开始明显并逐渐独立成为单独的菌落，第6天后最后一笔出现0.5～1.0mm的半透明、粘质较少的单菌落(图1)。

RY6的最适生长条件为：温度28℃，pH＝6，转速180r/min。能够广泛的应用碳源和氮源，在各种植物来源的综合抽提液上能很好的生长，在YMA培养基上比在蛋白胨培养基上生长好。

根瘤菌RY6的生理特性：根瘤菌RY6经革兰氏染色在显微镜下呈紫色形状为杆状体为革兰氏阴性菌(图2)。

(4)排除非根瘤菌菌落，根据上述标记的菌落将生长单菌落的时间相差3 天以上的菌落及板上生长形态、菌落大小、菌落透明度、及灯光下的折射、菌落颜色不一致的菌落挑出，在新的培养基上划板并编号。每一次对新划板的菌落都采用上述方法进行一次纯化直至同一块板上的菌落生长形态、菌落大小、菌落透明度、及灯光下的折射、菌落颜色一致为止。通过逐级纯化将纯化后的板进行镜检和回接后划入YMA斜面中保存。

(5)回接验证花生根瘤菌

a.菌液的准备

将分离纯化出来的根瘤RY6用无菌水洗入准备好的液体YMA培养基中，用封口膜封口，在摇床中180r/min摇菌3天后测定菌液的OD值，当OD大于 0.6时(即每mL菌液含菌量多于1.0×10⁹个)即得菌液，可使用。所述液体YMA 培养基是在表1的培养基中将琼脂除去，并调节pH值为6.0。

b.无菌种苗的准备

精选花生种子数粒在95％的乙醇中浸泡5分钟，取出后在0.2％的HgCl₂中处理1分钟，用无菌水冲洗5～10遍，然后排在灭过菌、放好发芽纸的培养皿中，用灭过菌的0.05mmol/L硫酸钙溶液浸湿发芽纸，放在28℃的培养箱中黑暗催芽 3天。待苗长到5厘米时候把苗移入准备好的灭过菌的沙培箱中，待用。

c回接

从沙培箱中选取壮实的苗放到培养皿中用步骤(5)a制备得到得菌液浸泡 15分钟，用镊子将种苗栽种在装满灭菌砂的小花盆中，每盆中呈菱形状栽植4 株，每棵种苗根部加入菌液5mL，保证每株种苗的接菌量达到1.0×10⁹个以上。大约四周后拔起苗查看是否结瘤，结瘤则为根瘤菌。根瘤RY6经回接检验后结瘤明显，可证明分离物为纯的根瘤菌(图3)。

实施例2根瘤菌RY6的16S rDNA序列测序及类别的确定

为了确定根瘤菌RY6的系统发育地位，对所分离得到的菌株的16S rDNA 系列进行测序。首先提取菌株的DNA，利用引物进行PCR特异性扩增。

上游引物27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；

下游引物1492R：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3。

PCR反应条件如下：

引物Primer：35fc，1492r

PCR扩增体系：

PCR扩增程序：

取扩增产物3mL在1.0％的琼脂糖凝胶电泳上检验结果如图4所示，RY6琼脂糖凝胶电泳带条送深圳微科盟科技集团有限公司进行测序，测序结果如SEQ ID NO 1所示：

ACCTACCGTGGCCGGCTGCCTCCCTTGCGGGTTAGCGCACCGTCTTCA GGTAAAACCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGA ACGTATTCACCGTGGCGTGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCAT GGGCTCGAGTTGCAGAGCCCAATCCGAACTGAGACGGCTTTTTGAGATTTG CGAAGGGTCGCCCCTTAGCATCCCATTGTCACCGCCATTGTAGCACGTGTGT AGCCCAGCCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCG CGGCTTATCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCTCAACTAAATGGTAGCAACT AAGGACGGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACA CGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTCCAGGCTCCGAAGAGAGG GTCACATCTCTGCGACCGGTCCTGGACATGTCAAGGGCTGGTAAGGTTCTG CGCGTTGCGTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGT CAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTA AAGCGTTAGCTGCGCCACTAGTGAGTAAACCCACTAACGGCTGGCATTCAT CGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTT TCGTGCCTCAGCGTCAGTATCGGGCCAGTGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGT TCTTGCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGCAGTTCCACTCACCTC TCCCGAACTCAAGATCTTCAGTATCAAAGGCAGTTCTGGAGTTGAGCTCCA GGATTTCACCCCTGACTTAAAGACCCGCCTACGCACCCTTTACGCCCAGTG ATTCCCGAGCAACGCTAGCCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAA GTTAGCCGGGGCTTATTTCTTGCGGTACCGTCATTATCTTCCCGCACAAAAG AAGCTTACAACCCTAAGGACCTTTCATCACTCACGCGGCATGATGAATCAG GTGGTCCCATGTCAATATCCCCAACTGCTGCCTCCCGGTAAGGAAGTTGGG GCCGGTGTCTCTCCAGT

将所得的序列结果在美国美国国立生物信息中心(NCBI)进行比对，发现根瘤菌菌株RY6与已知菌株(NR041785.1)Bradyrhizobium liaoningense.Strain 2281相似性达100％(图5)。再利用Mega4.0软件，采用Kimura-2参数，进行邻接法(Neighbor-Joining)分析，1000次重复，生成系统发育树(图6)，由比对结果和聚类图可知RY6为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、辽宁慢生根瘤菌 (Bradyrhizobium liaoningense)的新株系，并命名为热研6号(RY6)，2021年 4月28日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M 2021478。

实施例3根瘤菌RY6的应用实验

为了确认RY6对花生的作用，用沙培的方法将根瘤RY6回接到花生根部，每个处理4个重复(菌、砂和种苗的处理参见回接实验)，以不接种根瘤为对照 (CK)，进行回接对比。整个过程中采用低氮营养液进行浇灌。回接根瘤菌RY6 后对花生的生理指标影响见表2和图7。

由表2可以看出回接根瘤菌RY6后花生的整株鲜重、花生产量和根瘤数量都比对照(CK)大幅度增加。

在花生所有生理指标中，产量是衡量花生高产的最终指标。由表2可以看出，与对照相比，花生接种根瘤菌RY6后产量提高86.03％。由此可知根瘤菌RY6 是花生的高效匹配菌株，接种后可显著提高花生的产量。

表2根瘤菌RY6回接后对花生生理指标的影响

通过实验研究总结，本发明所述根瘤菌RY6是目前南方种植花生区域采集的样品中已知唯一一个具有较强的耐盐能力且能使花生达到高产的根瘤菌，它的特性表现在花生接种根瘤菌后浸染能力强结瘤数量多、结瘤体积大、抗逆性强，能使花生达到高产(图8)。当菌体被释放到自然环境中时，对人、动物和植物无害，不会污染环境，反而增加了土壤间根瘤菌的群体，对花生的结瘤固氮有促进的作用。

大多数能使豌豆和三叶草等豆科植物结瘤的根瘤菌对盐都很敏感，而且高浓度NaCl会降低豆科植物接菌剂中根瘤菌的数目。所以，根瘤菌的耐盐性对提高它们在土壤中的存活能力和竞争性是很重要的。根瘤菌的对数生长期是确定其生长情况的最佳时期，RY6的对数生长期为5天后(图9)。耐盐抗性实验采用添加NaCl的YMA液体培养基培养根瘤菌，5天后用分光光度计测定菌液的OD 值，OD值的大小可以反映菌生长快慢的情况。各菌株经活化后，接种于YMA 液体培养基中，置恒温振荡器中28±1℃下培养，待OD₆₀₀约为1，分别吸取50μl 菌悬液接种到NaCl浓度为0、0.20、0.40mol/L YMA液体培养基中(pH6.0、体积为50mL)，置恒温振荡器中28士1℃180rpm振荡培养，以培养液浑浊度的变化来检测菌的生长情况，培养125小时后用分光光度计测量OD₆₀₀。每个处理 4个重复。RY6在不同盐浓度中的生长情况见附图10。RY6具有较强的耐盐能力，在0.2mol/L和0.4mol/L NaCl浓度的培养基中生长都显著高于其他菌株(H2、 H3是同一批分离出来的其他花生根瘤菌菌株)。

实施例4根瘤菌RY6菌剂及应用

所述RY6菌剂可以在摇菌后进行拌种处理或以液体菌剂浇于刚种植的花生根部，也可以混合菌体吸附材料例如草炭(10mL菌液/50g草炭)、蛭石(10mL 菌液/15g蛭石)、珍珠岩(10mL菌液/15g珍珠岩)等吸附剂制成菌剂移植前混施于土壤中。

RY6草炭菌剂施用于土壤中对花生产量的影响：

如以上沙培准备无菌种子和育苗，将根瘤菌从固体培养基上吸入三角瓶中 28℃培，120小时，用无菌水洗脱菌体，并用无菌水稀释，用漩涡打旋器均匀菌体，测定OD值(λ＝600nm)，保证田间接种时每粒种子的含菌量大于10⁹个。将草炭粉碎(过2mm筛孔)后在121℃灭菌40分钟后冷却备用。在播种前将不同菌液按10mL/50g比例倒入草炭中，并充分混合让草炭吸收菌液，播种前用菌剂拌种。以不接种为对照，以接种RY6号为处理，设4个重复，随机区组设计，每小区面积为4×2.5＝10m²，起垄栽培，播种密度为20cm×10cm(行距×株距)。播种采用穴播的方式，每穴播2粒。成熟后测定产量，其结果见图11。

由图11可以看出在土壤中施用了菌剂以后，花生产量显著高于不接种根瘤菌，提高程度为23.4％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式和部分应用例，但本发明的用途并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所

<120> 一株耐盐促生的辽宁慢生根瘤菌RY6菌株及其应用

<141> 2021-12-29

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1139

<212> DNA

<213> 辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaoningense)

<400> 1

acctaccgtg gccggctgcc tcccttgcgg gttagcgcac cgtcttcagg taaaaccaac 60

tcccatggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg tggcgtgctg 120

atccacgatt actagcgatt ccaacttcat gggctcgagt tgcagagccc aatccgaact 180

gagacggctt tttgagattt gcgaagggtc gccccttagc atcccattgt caccgccatt 240

gtagcacgtg tgtagcccag cccgtaaggg ccatgaggac ttgacgtcat ccccaccttc 300

ctcgcggctt atcaccggca gtctccttag agtgctcaac taaatggtag caactaagga 360

cgggggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacagc 420

catgcagcac ctgtgttcca ggctccgaag agagggtcac atctctgcga ccggtcctgg 480

acatgtcaag ggctggtaag gttctgcgcg ttgcgtcgaa ttaaaccaca tgctccaccg 540

cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag ttttaatctt gcgaccgtac tccccaggcg 600

gaatgcttaa agcgttagct gcgccactag tgagtaaacc cactaacggc tggcattcat 660

cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgtttg ctccccacgc tttcgtgcct 720

cagcgtcagt atcgggccag tgagccgcct tcgccactgg tgttcttgcg aatatctacg 780

aatttcacct ctacactcgc agttccactc acctctcccg aactcaagat cttcagtatc 840

aaaggcagtt ctggagttga gctccaggat ttcacccctg acttaaagac ccgcctacgc 900

accctttacg cccagtgatt cccgagcaac gctagccccc ttcgtattac cgcggctgct 960

ggcacgaagt tagccggggc ttatttcttg cggtaccgtc attatcttcc cgcacaaaag 1020

aagcttacaa ccctaaggac ctttcatcac tcacgcggca tgatgaatca ggtggtccca 1080

tgtcaatatc cccaactgct gcctcccggt aaggaagttg gggccggtgt ctctccagt 1139

Claims (10)

1.一株耐盐促生的辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaoningense)RY6菌株，其特征在于，所述菌株于2021年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2021478。

2.根据权利要求1所述辽宁慢生根瘤菌RY6菌株，其特征在于，其16S rDNA序列如SEQID NO 1所示。

3.权利要求1所述辽宁慢生根瘤菌RY6菌株或其发酵菌液在花生根瘤固氮促生长中或在制备花生根瘤菌菌剂中的应用。

4.一种根瘤菌菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述辽宁慢生根瘤菌RY6菌株或其发酵菌液。

5.根据权利要求4所述根瘤菌菌剂，其特征在于，所述发酵菌液的浓度为大于1×10⁹CFU/mL。

6.根据权利要求4或5所述根瘤菌菌剂，其特征在于，还包括菌体吸附材料。

7.根据权利要求6所述根瘤菌菌剂，其特征在于，所述菌体吸附材料包括草炭、蛭石、珍珠岩或椰糠中的任一一种或多种。

8.根据权利要求6所述根瘤菌菌剂，其特征在于，所述发酵菌液与菌体吸附材料的比例为：10mL发酵菌液/15～50g菌体吸附材料。

9.权利要求4～8任一所述根瘤菌菌剂在花生根瘤固氮促生长中的应用。

10.一种促进花生根瘤固氮的方法，其特征在于，将权利要求1所述辽宁慢生根瘤菌RY6菌株接种于液体培养基得到发酵菌液后拌种或直接回接到花生根部，或将权利要求4～8任一所述根瘤菌菌剂在花生播种前拌种或直接回接到花生根部。

Images