CN116218742B - 一株拮抗掘氏疫霉菌的地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一株拮抗掘氏疫霉菌(Phytophthoradrechsleri)的地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)及其应用，所述地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)于2020年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20009。本发明通过实验表明：该菌株对黄瓜疫病具有很好的生防作用，发酵液防治效果可达66.67％，无菌上清防治效果可达86.67％。利用本发明提供的菌株及其发酵液或无菌上清对黄瓜疫病进行生物防控，可以减少化学农药对生态环境和人类健康造成的危害，减少病原菌的抗药性产生，值得大力推广。

Description

一株拮抗掘氏疫霉菌的地衣芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于植物病害的生物防治领域，具体涉及一株拮抗掘氏疫霉菌的地衣芽孢杆菌及其应用。
背景技术
黄瓜疫病是由掘氏疫霉菌(Phytophthoradrechsleri)引起的黄瓜上的主要病害，其病原菌借风、雨、灌溉水传播和再侵染，具有扩散速度快、易爆发成灾等特点。黄瓜在感染黄瓜疫霉后，发病迅速，常常会引起大片植株的死亡，严重影响黄瓜的产量和果实品质，造成严重的经济损失。
目前对黄瓜疫病的防治主要还是依赖栽培抗病品种和使用化学药剂，但是由于疫霉菌变异速度快，导致现有抗病品种抗性易丧失；而化学防治容易造成环境污染和病原菌抗药性水平上升。生物防治对环境友好，对食品无害，无病原菌抗药性产生。因此，生物防治尤其是利用生防菌及其代谢产物防治病害，受到越来越多的关注，具有广阔的应用前景和市场潜力。
地衣芽孢杆菌(Bacilluslincheniformis)是一类严格需氧或兼性厌氧的革兰氏阳性细菌，在一定条件下能产生抗逆性强的芽孢(内生孢子)。有报道称其可产生抗生素类抗菌活性物质，对多种动、植物及人类病原菌具有显著的抑制作用。目前尚没有人研究和报道地衣芽孢杆菌对于黄瓜疫病是否具备防治作用。
发明内容
发明目的：为解决现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一株能够拮抗掘氏疫霉菌的地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)CNBG-PGPR-4。
本发明还要解决的技术问题是提供了能够拮抗掘氏疫霉菌的地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)CNBG-PGPR-4制备得到的发酵液或其无菌上清或其制剂。
本发明还要解决的技术问题是提供了地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)CNBG-PGPR-4、发酵液和/或其无菌上清和/或其制剂在防治黄瓜疫病中的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供了地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)CNBG-PGPR-4在固氮方面的应用。
本发明最后要解决的技术问题是提供了所述的地衣芽孢杆菌(Bacilluslincheniformis)CNBG-PGPR-4在抑制或杀灭病原菌中的应用。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一株地衣芽孢杆菌(Bacilluslincheniformis)CNBG-PGPR-4，所述地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)CNBG-PGPR-4于2020年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20009。
本发明内容还包括所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)CNBG-PGPR-4制备得到的发酵液、菌悬液或其无菌上清或其制剂。
本发明内容还包括所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)CNBG-PGPR-4在防治黄瓜疫病中的应用。
本发明内容还包括所述的发酵液和/或菌悬液和/或其无菌上清和/或其制剂在防治黄瓜疫病中的应用。
其中，所述发酵液或菌悬液中地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)CNBG-PGPR-4的浓度为1×107CFU/mL～5×107CFU/mL。
其中，所述发酵液的制备方法如下：挑取单菌落接种于2～3mL的NB液体培养基中，28～30℃、160～220rpm振荡培养过夜。而后吸取菌液接种于100～200mL NB液体培养基中，28～30℃、160～220rpm振荡培养2～3d，即为发酵液。
其中，所述菌悬液的制备方法如下：挑取生长良好的CNBG-PGPR-4单菌落接种于NB液体培养基中，28～30℃、160～220rpm振荡培养过夜。而后吸取菌液接种于NB培养基中，28～30℃、160～220rpm培养2-3d，之后用离心管离心收菌，待菌液收取完毕后，用适当体积无菌水重悬，获得含地衣芽孢杆菌CNBG-PGPR-4的菌悬液，备用。
其中，所述无菌上清的制备方法如下：将发酵液离心得上清液，将上清液过滤除菌得到无菌上清，然后将其用蒸馏水稀释至体积分数为2％～20％。
其中，所述上清液过滤采用Ψ＝0.22μm的微孔滤膜。
本发明内容还包括所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)CNBG-PGPR-4在固氮方面的应用。
本发明内容还包括所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)CNBG-PGPR-4在提高黄瓜发芽的促生能力方面的应用。
本发明内容还包括所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)CNBG-PGPR-4在抑制或杀灭病原菌中的应用。
其中，所述病原菌包括掘氏疫霉菌。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明得到了一株对黄瓜疫病具有良好防治效果的地衣芽孢杆菌菌株，利用本发明提供的菌株及其发酵液和无菌上清能够应用于黄瓜疫病的生物防控。本发明获得的地衣芽孢杆菌，可应用于对黄瓜疫病的防治，其发酵液防治效果为66.67％，无菌上清的防治效果为86.67％。本发明能够避免化学防治造成的环境污染和病原菌抗药性水平上升等问题，具有良好的开发应用前景，值得大力推广。
附图说明
图1为菌株CNBG-PGPR-4在NB培养基中的细菌形态图。
图2为菌株CNBG-PGPR-4在NA培养基上的菌落形态图。
图3为菌株CNBG-PGPR-4的系统进化树。
图4为菌株CNBG-PGPR-4对黄瓜发芽的促生能力。
图5为菌株CNBG-PGPR-4对掘氏疫霉的抑制作用。
图6为菌株CNBG-PGPR-4无菌上清对掘氏疫霉的抑制作用。
图7为菌株CNBG-PGPR-4无菌上清对掘氏疫霉侵染的抑制作用。
具体实施方式
下面将对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 CNBG-PGPR-4的分离、纯化及鉴定
取常年种植蔬菜地土壤样品(句容，江苏)10g，与100mL无菌水混合振荡制成悬浮液，然后依次进行梯度稀释，吸取稀释不同倍数的土壤悬浮液100μL涂布于NA(NutrientAgar)培养基平板上，于30℃培养箱中培养，待长出菌落后，挑取单菌落在新的NA平板上进行分区纯化，重复纯化直至单菌落出现。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对菌株进行形态学测定。
用灭菌的牙签挑取单菌落于NB培养基中，30℃200rpm振荡培养过夜，然后用细菌基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取细菌基因组DNA，以DNA为模板，用引物27F和1492R分别进行16S rRNA基因序列扩增。PCR扩增反应体系为50μL：25μLEasyTaq Mix、2μL正向引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)、2μL反向引物1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)、1μL DNA模板、20μL无菌水。扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳无误后，再纯化送至南京擎科生物科技有限公司测序。
NB培养基配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1L，pH7.2～7.5，121℃高温高压灭菌15min。NA培养基配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15g，蒸馏水1L，pH7.2～7.5，121℃高温高压灭菌15min。
实验结果：如图1、2显示，获得的CNBG-PGPR-4菌株在NB液体培养基中30℃200rpm下培养1天后，镜检下菌体细胞呈杆状、端圆，不成链，能运动；在NA培养基平板上30℃培养2天后，菌落形态为近圆形，表面粗糙皱褶，不透明，粘着，边缘呈锯齿形。
对测序结果进行拼接处理，得到CNBG-PGPR-4菌株的16S rRNA基因近全长序列(如SEQ ID NO.1所示)，长度为1426bp。将菌株的16S rRNA基因序列在GenBank数据库(NCBI)进行同源序列检索，并利用BLAST分析找到相似度最高的菌株。结果显示，该菌株与一株地衣芽孢杆菌典型菌株(type strain)的相似度达到了99.79％。同时，利用MEGA 7软件并采用最大可能性法(Maximum Likelihood methods)构建系统进化树，发现该菌株与三株地衣芽孢杆菌(BCRC 11702、ATCC 14580、DSM 13)聚成一簇，可确定CNBG-PGPR-4菌株很可能是地衣芽孢杆菌(图3)。该CNBG-PGPR-4菌株于2020年6月2日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号是CGMCCNo.20009。
实施例2 CNBG-PGPR-4的固氮能力
将活化好的CNBG-PGPR-4菌株在NA平板上划线培养，2天后挑取生长良好的单菌落接种在Ashby无氮固体培养基上，30℃恒温培养12d，持续观察平板上是否有菌落长出，并记录时间，以此来初步判断该菌株是否有自生固氮能力。
Ashby无氮固体培养基配方：葡萄糖10g，磷酸二氢钾0.2g，七水硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，二水硫酸钙0.1g，碳酸钙5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。
经测试，经过5d即可能观察到CNBG-PGPR-4在Ashby无氮固体平板上四区均长出菌落，说明该菌株的自生固氮能力较强。
实施例3 CNBG-PGPR-4对黄瓜发芽的促生试验
将黄瓜种子用55度热水浸泡15分钟，期间不断搅拌使其受热均匀；种子捞起后清水冲洗，进行消毒处理；消毒后清水冲洗，再置于28度温水中浸种5小时。浸种结束后清水冲洗，水分沥干后将种子用纱布(或者滤纸)包好置于28度催芽。
等大部分黄瓜种子发芽后，挑取生长良好的CNBG-PGPR-4单菌落接种于3mL NB液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养过夜，用无菌水分别稀释至1×108个/mL、1×107个/mL、1×106个/mL、1×105个/mL、1×104个/mL备用。
吸取稀释好的菌液3mL于铺有2层滤纸的培养皿中，挑取发芽一致的种子于培养皿中每个浓度3皿，每皿为1个平行，每个平行10棵，以无菌水做对照。于光照培养室中培养，注意保持培养皿中湿润。处理后五到七天统计数据。
实验结果如图4显示，1×106个/mL和1×108个/mL浓度的CNBG-PGPR-4能够显著提高黄瓜幼苗的鲜重，1×107个/mL浓度的CNBG-PGPR-4能够显著提高黄瓜幼苗的下胚轴长度和鲜重(图4)。
实施例4 CNBG-PGPR-4的对掘氏疫霉的抑制作用
采用平板对峙培养法，测定该菌株对掘氏疫霉的抑制作用。挑取生长良好的CNBG-PGPR-4单菌落接种于3mL NB液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养过夜。于波长600nm下测定OD值，根据比例浓缩重悬至OD值为10备用。
将实验室保存的掘氏疫霉菌(菌株号：Phy-73)(陆家云，龚龙英，何汉兴.疫霉属(Phytophthora)真菌生物学及分类研究[J].南京农业大学学报，1984(01)：20-31.)在V8平板培养基上活化，用无菌打孔器(5mm)打孔，用无菌接种针挑取菌丝边缘的琼脂块置于V8平板培养基中央。吸取5μL上述制备好的CNBG-PGPR-4菌液，按照十字划线的方式点在距离平板中心2.5cm处，以接种NB培养基作对照，25℃培养至对照侧病原菌长至平板边缘，观察抑菌效果，计算抑菌率。同时按照上述方法分别测试了CNBG-PGPR-4对瓜类疫霉菌(Phytophthoramelonis，菌株号：BL23)、寄生疫霉菌(Phytophthoraparasitica，菌株号：PP025)等能侵染黄瓜引起疫病的病原菌的抑制作用。
抑菌率(％)＝(Rc-Rt)/Rc×100％
其中，Rc表示对照组菌丝生长半径，Rt表示处理组菌丝生长半径(靠拮抗菌一侧)。
所述V8培养基具体配制方法：每100mL的V8蔬菜汁(美国进口V8原味混合蔬菜汁饮料)中加入1g CaCO3，充分搅拌至其完全溶解后，2500rpm离心10min，上清用双层纱布过滤后用蒸馏水稀释10倍，分装后121℃高压灭菌20min。固体培养基加入的琼脂百分比为1.5％。
实验结果显示，如表1和图5，CNBG-PGPR-4对掘氏疫霉的菌丝生长有显著的抑制作用，抑制率为57.97％。对瓜类疫霉和寄生疫霉的菌丝生长抑制作用不明显，分别为27.34％和23.37％(表1)。
表1 CNBG-PGPR-4对多种疫霉的抑制作用
实施例5 CNBG-PGPR-4无菌上清对掘氏疫霉的抑制作用
将活化好的CNBG-PGPR-4菌株在NA平板上划线培养2天后，挑取生长良好的单菌落接种于2mL的NB液体培养基中，30℃200rpm振荡培养过夜。而后吸取1mL菌液接种于100mLNB液体培养基中，30℃200rpm振荡培养3d得到发酵液。取发酵液于50mL离心管中，12000rpm离心20min，得上清液，将上清液过滤(Ψ＝0.22μm的微孔滤膜)除菌得到无菌上清，-20℃保存备用。
将无菌上清与冷却至50℃的V8固体培养基按照1∶9的比例混合均匀作为处理组，同时以同等比例混合的NB和V8固体培养基为对照组，倒平板。将实验室保存的掘氏疫霉菌(菌株号：Phy-73)活化，用无菌打孔器(5mm)打孔，用无菌接种针挑取菌丝边缘的琼脂块置于对照组和处理组的平板中央，25℃培养至对照组病原菌长至平板边缘，观察抑菌效果，并计算抑菌率。
抑菌率＝(对照组病原菌生长直径-处理组病原菌生长直径)/(对照病原菌生长直径-0.5)×100％
实验结果显示，如表2和图6，CNBG-PGPR-4无菌上清对掘氏疫霉的菌丝生长有显著的抑制作用，抑制率为59.29％(表2)。
表2 CNBG-PGPR-4无菌上清对掘氏疫霉的抑制作用
实施例6 CNBG-PGPR-4无菌上清对掘氏疫霉侵染的抑制作用
选取生长一致的黄瓜叶片，先用自来水冲洗30s，然后用75％的酒精消毒30s，再用无菌水冲洗3次，平铺于铺有两层卫生纸的托盘中(卫生纸用无菌水浸湿)，叶片正面朝上。每个托盘中放6片叶，每组试验设置三个托盘。
按照实施例5的方法获取CNBG-PGPR4无菌上清，分别用蒸馏水稀释至2％、10％、20％(体积分数)，-20℃保存备用。
用小喷壶均匀的将配制好的不同浓度的CNBG-PGPR4无菌上清饱和喷雾于叶片上(每个叶片5mL)，同时将等体积的NB液体培养基喷到叶片上作为对照。2h后用无菌接种针挑取新鲜的掘氏疫霉病原菌琼脂块(5mm)倒置于上述叶片上，将托盘用保鲜膜封口进行保湿，25℃黑暗培养。2天后观察抑菌效果，统计病斑面积，并计算抑菌效果。
抑菌效果(％)＝(Ac-At)/Ac×100％
其中，Ac表示对照组病斑面积，At表示处理组病斑面积。
实验结果显示，如表3和图7，CNBG-PGPR-4无菌上清对掘氏疫霉的侵染有显著的抑制作用，当无菌上清体积分数为20％时抑菌效果最好，达到92.77％(表3)。
表3 CNBG-PGPR-4无菌上清对掘氏疫霉侵染的抑制作用
实施例7CNBG-PGPR-4对栽培黄瓜的增产效果
试验地设置在江苏句容黄瓜种植大棚，黄瓜幼苗利用穴盘播种育苗，一个月后移栽至大棚，设置6个小区，每个小区为6m×5m，每个小区移栽30棵黄瓜苗。对照组和处理组各3个小区，小区采用随机区组设计排列。大棚内土壤整体状况较为一致，管理按照当地蔬菜栽培基地常规措施进行。
挑取生长良好的CNBG-PGPR-4单菌落接种于2mL的NB液体培养基中，30℃200rpm振荡培养过夜。而后吸取2mL菌液接种于200mL的NB培养基中，30℃、200rpm培养3d得到发酵液。之后用50mL离心管，4000rpm离心10min收菌，待菌液收取完毕后，用适当体积无菌水重悬，获得菌浓度为1×107个/mL的地衣芽孢杆菌CNBG-PGPR-4菌悬液，备用。
在育苗期，移栽前10d用上述菌悬液进行灌根处理(50mL/株)，移栽后10d再次用上述菌悬液进行灌根处理(100mL/株)，移栽后30d再次用上述菌悬液进行灌根处理(200mL/株)，以清水处理为对照。黄瓜采收期，每个小区选取10株，每个处理共选取30株，按批次采集黄瓜果实，采用称重法测定单株黄瓜果实质量，直至结果期完结后，计算单株产量和每亩(667m2)产量。
实验结果(见表4)显示，CNBG-PGPR-4能提高黄瓜产量，单株产量达到3.75kg，亩产量达到2501.25kg，比对照增产23.36％(表4)。
表4 CNBG-PGPR-4对栽培黄瓜的增产效果
实施例8 CNBG-PGPR-4发酵液及无菌上清对黄瓜疫病的防治效果
将实验室保存于10％V8固体培养基上的掘氏疫霉菌(菌株号：Phy-73)用5mm的打孔器获取菌碟，并将一个菌碟接种于一个新的V8平板中央，25℃培养箱中黑暗培养3天备用，将上述培养好的病原菌平板(20个)用刀片切成0.5cm见方的菌丝小块，与5kg土混合均匀，装入栽培盆，将之前培养好的黄瓜幼苗移栽到上述盆中，每盆移栽10棵，每组3盆，放于日光温室培养。
按照实施例7的方法培养CNBG-PGPR-4得到发酵液，收取完毕后，用适当体积NB培养基重悬，分别调整菌浓度为1×107CFU/mL、2×107CFU/mL、5×107CFU/mL即得地衣芽孢杆菌CNBG-PGPR-4发酵液，备用。
同时，按照实施例5的方法获取CNBG-PGPR-4无菌上清，分别用无菌蒸馏水稀释至2％、10％、20％(体积分数)，-20℃保存备用。
移栽后第5天，将上述准备好的不同浓度的发酵液和无菌上清均匀充分浇灌于上述栽种黄瓜幼苗的盆中，同时以相同体积的NB培养基为对照。处理20天后，统计死亡率，计算防治效果。
防治效果＝(对照组死亡率-处理组死亡率)/对照组死亡率×100％
实验结果见表5。
表5 CNBG-PGPR-4对黄瓜疫病的防治效果
从表5可以看出，CNBG-PGPR-4发酵液和无菌上清对黄瓜疫病具有显著的防治效果；当其发酵液的浓度为2×107CFU/mL时的防治效果最好，为66.67％；当其无菌上清体积分数为20％时的防治效果最好，为86.67％。

Claims (9)

1.一株地衣芽孢杆菌（Bacillus lincheniformis）CNBG-PGPR-4，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌（Bacillus lincheniformis）CNBG-PGPR-4于2020年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20009。
2.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌（Bacillus lincheniformis）CNBG-PGPR-4制备得到的菌悬液或其制剂。
3.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌（Bacillus lincheniformis）CNBG-PGPR-4在防治黄瓜疫病中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括将地衣芽孢杆菌（Bacillus lincheniformis）CNBG-PGPR-4的发酵液和/或菌悬液和/或其无菌上清和/或其制剂防治黄瓜疫病。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵液或菌悬液中地衣芽孢杆菌（Bacillus lincheniformis）CNBG-PGPR-4的浓度为1×107 CFU/mL~5×107 CFU/mL。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述无菌上清的制备方法如下：将发酵液离心得上清液，将上清液过滤除菌得到无菌上清，然后将其用蒸馏水稀释至体积分数为2%~20%。
7.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌（Bacillus lincheniformis）CNBG-PGPR-4在固氮方面的应用。
8.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌（Bacillus lincheniformis）CNBG-PGPR-4在提高黄瓜发芽的促生能力方面的应用。
9.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌（Bacillus lincheniformis）CNBG-PGPR-4在抑制或杀灭病原菌中的应用，所述病原菌包括掘氏疫霉菌、瓜类疫霉菌或寄生疫霉菌中的一种或几种。
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