CN113755381A

CN113755381A - 一种防治植物病害的地衣芽孢杆菌及其应用

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Publication number: CN113755381A
Application number: CN202111125731.5A
Authority: CN
Inventors: 王丽宁; 常乃军; 代庆海; 孙春龙
Original assignee: Qingdao Lilihui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Qingdao Lilihui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-09-26
Filing date: 2021-09-26
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2041-09-26
Also published as: CN113755381B

Abstract

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体涉及一种防治植物病害的地衣芽孢杆菌。所述地衣芽孢杆菌保藏编号为CCTCC NO:M2020162，高效固氮和分泌吲哚乙酸，有效提升土壤肥力，促进作物生长，提高产量，并且对根腐病、茎基腐病、青枯病等植物病害具有很好的防治效果，应用前景广泛。

Description

一种防治植物病害的地衣芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及功能微生物的筛选与应用技术领域，具体涉及一种防治植物病害的地衣芽孢杆菌及其应用。

背景技术

生物农药是指利用生物产生的天然活性物质或生物活体本身制作的农药，有时也将天然活性物质的化学衍生物等称作生物农药。我国生物农药的类型主要有微生物农药、农用抗生素、植物源农药和动物源农药等。目前大量研究及广泛应用的生物农药主要是微生物农药（以微生物活菌制剂为主体）和农用抗生素；微生物农药按照所利用的微生物资源可分为细菌类、真菌类和病毒类等，按照功能可区分为杀虫剂、杀菌剂、除草剂等。

有些微生物对植物病原菌、害虫或杂草具有抑制或杀灭作用，因此可将其用于防治植物的病虫草害，这类微生物也常被称为生防菌。常用的生防微生物包括细菌、真菌、病毒等几个大类。用作微生物农药的细菌主要有芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属等，已有很多具有优异生防性能的细菌菌株被分离出来，在很早以前就有利用放射农杆菌K84防治植物冠瘿病的成功案例。更有许多芽孢杆菌被制作成商品制剂，例如，AgraQuest公司利用短小芽孢杆菌QST2808生产了活菌制剂SONATA，它能有效控制链格孢属及葡萄孢属等真菌引起的植物疾病；还有利用解淀粉芽孢杆菌QST713菌株制备的菌剂Serenade Opti，以及Novozymes公司的产品Taegro（含枯草芽孢杆菌，用于防治由镰刀菌属和丝核菌属引起的根腐病和枯萎病）。陈志谊等利用枯草芽孢杆菌B-916开发了生物农药“纹曲宁”用于防治水稻纹枯病及伪黑穗病等。另外，许多假单胞菌因能产生多种抗菌物质也常用作微生物农药，这些抗菌物质包块嗜铁素、硝吡咯菌素、卵菌素、绿脓菌素、1-羟基吩嗪等。Gupta等的研究表明某些铜绿假单胞菌可产生绿脓菌素，对菜豆壳球孢等土传病原菌有很强的抑制能力。

截至目前，已有大量的真菌被用于植物病害防治，不少具有优异生防性能的真菌也已经被开发为生物农药；木霉、盾壳霉、无致病力的尖孢镰刀菌是最常见的用于植物病害防治的真菌。早在20世纪30年代就发现木霉可以寄生于多种土传真菌病害，在土壤中施用某些木霉菌能有效防除一些真菌病害，已被广泛研究和应用的生防木霉主要有长枝木霉、哈茨木霉、绿色木霉等。例如，哈茨木霉T-22菌株能有效防治洋绣球立枯病和西红柿枯萎病；绿色木霉T23和TH-31菌株则可用于防治哈密瓜枯萎病和角豆褐斑病。

微生物杀虫剂通常是利用对害虫有致病作用的病原微生物制成，以防治和杀死目标害虫为目的。苏云金芽孢杆菌、假单胞菌、白僵菌等是应用最为广泛的杀虫用微生物，例如，美国应用苏云金芽孢杆菌防治玉米螟；白僵菌对多种农业及林业害虫有致死作用，也被广泛用于防治松毛虫、玉米髓虫、叶蝉等。

微生物除草剂一般由杂草病原菌繁殖体和相关辅剂构成，利用植物病原菌致目标杂草染病死亡。最常见的是利用植物病原真菌产生的孢子（也可用菌丝体片段来代替孢子）制作除草剂，如美国生产的Devine制剂就是用疫霉菌的厚垣孢子制成，它也是世界上第一个上市的真菌除草剂，能有效防除莫伦藤等杂草植物；也有将长孢状刺盘孢的孢子加工成微生物除草剂来防治皂角。另外，有许多细菌也被开发为除草剂，日本烟草公司就将杀禾黄杆菌制作成细菌除草剂Camperico，它对高尔夫球场的早熟禾防治率可达到90%以上。

尽管我国的生物农药产业近年来发展较快，也取了不少突出的成果，但与发达国家相比仍然存在较大差距，因此，仍需开发出更高效、可靠的生物农药产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型地衣芽孢杆菌及其在防治植物病害中的应用。所述地衣芽孢杆菌能有效防治草莓根腐病、大姜基腐病等植物病害，有利于提高作物产量和品质，减少农药对环境的污染，应用前景广泛。

本发明一方面提供了一种地衣芽孢杆菌LLH-6（Bacillus licheniformis LLH-6），已于2020年6月1日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2020162。

所述地衣芽孢杆菌在植物病害防治中的应用。

所述植物病害包括根腐病、茎基腐病、青枯病、炭疽病、早疫病、白粉病、灰霉病、根结线虫病、轮纹病、溃疡病、黄龙病中的任意一种。

本发明另一方面提供了一种微生物制剂，包含上述地衣芽孢杆菌LLH-6。

所述微生物制剂还包含枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、植物乳杆菌、哈茨木霉、淡紫拟青霉、沼泽红假单胞菌、乳酸菌、泾阳链霉菌、白浅灰链霉菌、克鲁斯假丝酵母、菌根真菌、棕色固氮菌、光合细菌、米曲霉、黑曲霉、绿色木霉中的任意一种或两种或多种的组合。

所述微生物制剂中地衣芽孢杆菌LLH-6的活菌量至少为10⁹ CFU/g。

本发明还提供了上述微生物制剂在制备生物肥中的应用。

本发明还提供了上述微生物制剂在植物病害防治中的应用。

所述植物病害包括草莓根腐病、姜茎基腐病、西红柿青枯病、草莓炭疽病、番茄早疫病、黄瓜白粉病、西瓜根腐病、西瓜茎基腐病、葡萄灰霉病、甜瓜根结线虫病、苹果轮纹病、柑橘溃疡病、柑橘黄龙病中的任意一种。

有益效果

本发明筛选到的地衣芽孢杆菌LLH-6具有广谱的抑菌能力，对茄链格孢菌、灰霉病菌、茄病镰刀菌、立枯丝核菌、腐霉菌、禾谷镰刀菌、白粉病菌、青枯假单胞菌、疫霉菌、藤仓赤霉菌10种病原菌均具有明显的抑制作用，其中对茄病镰刀菌、立枯丝核菌、腐霉菌、青枯假单胞菌和疫霉菌的抑菌效果较强，抑菌带宽度均超过30mm，对立枯丝核菌的抑菌效果最明显，抑制率达到91.8％。

所述地衣芽孢杆菌LLH-6具有很强的固氮能力，在第2、3、5天时固氮量均显著高于对照菌，其中第5天时固氮量高达29.63 mg/50ml，取得了意料不到的技术效果。

所述地衣芽孢杆菌LLH-6能高效分泌吲哚乙酸，在DF培养基中，其吲哚乙酸的产量为19.87±0.19mg/L，在DF+培养基中吲哚乙酸的产量为40.45±0.33mg/L。因此，该菌株有望开发成微生物肥广泛应用于农业生产中，促进作物生长。

所述地衣芽孢杆菌LLH-6能有效提升土壤肥力，促进作物生长，显著提高作物产量。喷施地衣芽孢杆菌LLH-6的处理组油菜的平均鲜重和干重比空白对照组分别提高了302.1%和281.4%，增产效果非常显著。

所述地衣芽孢杆菌LLH-6对草莓根腐病、姜茎基腐病和西红柿青枯病的防治效果非常明显，与对照组相比，施用地衣芽孢杆菌LLH-6的处理组作物发病率显著下降，防治效率分别达到85.3%、86.2%和78.3%，取得了意料不到的技术效果。此外，地衣芽孢杆菌LLH-6对草莓炭疽病、番茄早疫病、黄瓜白粉病、西瓜根腐病、西瓜茎基腐病、葡萄灰霉病、甜瓜根结线虫病，以及苹果轮纹病、柑橘溃疡病、柑橘黄龙病等多种植物病害也均有较显著的防治效果，防治效率达到60.8%-75.5%。

本发明提供的地衣芽孢杆菌LLH-6可单独，或与其他芽孢杆菌、固氮菌、解磷菌、链霉菌等进行组合，作为生物肥或生防菌剂，广泛应用于农业领域，而且对环境友好，有利于提升农作物的品质，推动传统农业向生态农业、绿色农业的转变，实现农业健康、可持续的发展。

附图说明

图1为地衣芽孢杆菌LLH-6菌落图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。本发明所选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。

实施例中使用的培养基配方如下：

PDA平板：去皮土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L；

NA培养基：蛋白胨5.0g/L，牛肉膏3.0g/L，葡萄糖2g/L，琼脂15g/L，pH7.0；

NB培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏3.0g/L，NaCl5.0g/L，pH7.0；

DF培养基：蛋白胨5.00g，酵母提取物1.50g，牛肉膏1.50g，NaCl 5.00g，蒸馏水1000mL，pH 9.0；

DF+培养基：蛋白胨5.00g，酵母提取物1.50g，牛肉膏1.50g，NaCl 5.00g，0.50g/L色氨酸，蒸馏水1000mL，pH 9.0。

实施例1 土壤中生防菌的分离与筛选

1、土壤样品：山东省青岛市莱西蔬菜种植区番茄根际土壤。

2、土壤稀释液的制备：

除去地表植物残体和表层土5cm-10cm，用多点采集的方法在每个采样点从土壤中采集10g样品，放入样品袋中。经阴干后，采用四分法将土壤样品缩分至约50g左右；然后置于含有250ml灭菌PB缓冲液的500ml三角瓶中；30℃、180rpm震荡30min，静置沉淀，取上清液；取100ml上清液，12000rpm离心10min，取沉淀；将沉淀悬浮于50ml灭菌PB缓冲液中再次12000rpm离心10min；重复两次以后，将沉淀悬浮于10ml的无菌水中，制得土壤悬浮液。

用移液枪分别吸取0.1ml土壤悬浮液至PDA平板上，涂抹均匀后放入培养箱培养，48h后记录菌量，并根据菌落形态、颜色和大小选取，在平板上进行纯化保存，共分离获得20株细菌，分别命名为H1，H2，H3，……，H20。

3、初筛：

采用对峙培养法进行病原真菌拮抗菌筛选。

将打好直径为5mm的番茄立枯丝核菌菌饼放于平板中央，然后用接菌环蘸取上述分离得到的待测细菌悬浮液等距离（距平板中央3cm）点接2～3种细菌，放于培养箱中28℃黑暗培养，4d后观察记录抑菌带的有无及大小，共重复3次。选出抑菌带宽度大于等于6mm的6个菌株进行复筛，依次为H3、H4、H6、H13、H15、H20进行复筛。

4、复筛：

将初筛获得的6株菌分别接种于NA培养基上，30℃培养2d。

取一接种环菌置入装有100ml NB培养基的三角瓶中，在30℃、200rpm条件下培养48h。将发酵液用0.22μm细菌过滤器过滤得到发酵滤液，将滤液与50℃左右的PDA培养基按1∶19混匀倒入培养皿，冷却后在平板中央放入d＝6mm的立枯丝核菌菌饼，4d后测量病菌菌落直径，以无菌水为对照。

结果显示，初筛获得的6株拮抗菌中，H15菌株发酵液对立枯丝核菌的抑菌效果最明显，抑制率达到91.8％。

实施例2 H15菌株的鉴定

1、分子生物学鉴定

挑取平板上H15菌株的单菌落于NB培养基中，30℃培养48小时，然后取500ul菌株发酵液，利用试剂盒提取该菌株的基因组。以该基因组为模板，利用通用引物序列，PCR扩增16s rDNA 序列。

1）引物序列:

H15F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；

H15R：CTACGGCTACCTTGTTACGA。

2）反应体系（50μL）

表1 16s rDNA PCR扩增体系

成分	反应体积
		10×PCR buffer	5μL
dNTPs	4μL
		A11F	2μL
A11R	2μL
		DNA	2.5μL
rTaq	0.5μL
		ddH2O	34μL

3）PCR 扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳图谱结果显示，扩增得到的16s rDNA片段的长度为1500bp左右，符合常规的16s rDNA 序列长度。

4）PCR产物测序

将扩增后的 PCR 产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。测序结果显示H15菌株的16srDNA序列为SEQ ID NO:1。将该序列在NCBI 数据库中进行BLAST比对，其与地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的相似性最高。因此，初步确定H15菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。

SEQ ID NO:1如下所示：

ttccggccggcctaatacatgcaagtcgagcaaacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtctgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcaaaagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccccggctaactacghgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcaaaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgaatctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagccctccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtgtaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagaaataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagggcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaagcatcattccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagccgccgaagggtgaacagaagattcca。

2、菌落形态

将H15菌株在NA培养基上划线接种，37℃恒温培养过夜，观察菌落形态。

结果如图1所示，H15菌株的菌落呈乳白色，扁圆形，边缘不规则；菌体呈短杆状，常成串出现，可形成椭圆形的中生芽胞，革兰氏染色呈阳性。

结合H15菌株的16srDNA比对结果和菌落形态，申请人确认H15菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），命名为地衣芽孢杆菌LLH-6（Bacillus licheniformis LLH-6）。

申请人已于2020年6月1日将上述地衣芽孢杆菌LLH-6（Bacillus licheniformis LLH-6）保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020162。

实施例3 地衣芽孢杆菌LLH-6抑菌能力评价

1、菌液制备

将地衣芽孢杆菌LLH-6进行活化，挑取活化后的地衣芽孢杆菌LLH-6接种于营养肉汤培养基中，37℃，220r/min培养24h，获得活菌量为10⁸-10⁹CFU/ml的菌液。

2、病原菌的制备

将茄链格孢菌、灰霉病菌、茄病镰刀菌、立枯丝核菌、腐霉菌、禾谷镰刀菌、白粉病菌、青枯假单胞菌、疫霉菌、藤仓赤霉菌等多种真菌性病原菌（山东省农科院植保所提供）分别接种于PDA培养基上纯化培养，30℃培养5天后备用。

3.平板抑菌试验

采用滤纸片法，在培养基中央接种直径为8mm的病原菌菌饼，将已经灭菌的滤纸片放于菌饼两侧距离培养皿中心30mm处，吸取10ul地衣芽孢杆菌LLH-6菌液点到滤纸片上；然后将培养皿放于30℃培养箱中培养，每天观察记录抑菌带的宽度，每种病原菌做三个重复，取平均值。抑菌效果详见表2。

表2地衣芽孢杆菌LLH-6对不同病原菌的抑菌效果

病原菌	抑菌带平均宽度（mm）
		茄链格孢菌	26.0±1.0
灰霉病菌	27.0±0.6
		茄病镰刀菌	30.0±0.4
立枯丝核菌	34.0±0.2
		腐霉菌	31.0±1.1
禾谷镰刀菌	27.0±1.2
		白粉病菌	23.0±1.0
青枯假单胞菌	30.0±0.5
		疫霉菌	31.0±0.8
藤仓赤霉菌	26.0±0.6

从表2的数据可知，本发明提供的地衣芽孢杆菌LLH-6对上述10种病原菌均具有明显的抑制作用，其中对茄病镰刀菌、立枯丝核菌、腐霉菌、青枯假单胞菌和疫霉菌的抑菌效果较强，抑菌带宽度均超过30mm，取得了意料不到的技术效果。

实施例4 地衣芽孢杆菌LLH-6固氮能力测定

1、氮标准曲线绘制：

将硫酸铵在105℃烘箱中烘1h；称取0.4716g硫酸铵溶于100mL水中，得到的硫酸铵溶液中氮的含量为1mg/mL，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL溶液于100mL容量瓶，定容，即为氮标准液。取标准液各1.0mL于15mL刻度试管中，每管加水1.0mL，加奈氏试剂4.0mL，摇匀，水浴加热15min，冷却后于420nm处测定吸光值。根据不同浓度含氮标准溶液吸光值可得氮标准曲线。

2、将地衣芽孢杆菌LLH-6、对照菌株(多粘芽孢杆菌、褐球固氮菌)分别接种到固氮菌液体培养基中，同时做不接菌空白对照，30℃，200r/min摇瓶培养分别在第2、3、5天取菌液。

分别吸取上述待测菌液1.0ml于50ml消化管中，加3mL硫酸，0.1g催化剂和5d双氧水消煮至清亮，冷却后加少许蒸馏水，摇匀，滴加400g/L氢氧化钠至出现沉淀，加25％酒石酸钾钠溶液去除沉淀，摇匀。过滤，吸取滤液5.0mL于15ml刻度试管中，加0.5mL氢氧化钠，0.5mL酒石酸钾钠，1.5mL奈氏试剂，摇匀，显色2～3min，于420nm处测定吸光值。计算氮含量，具体结果见表3。

W（氮含量，g/50ml）＝（x×100×50）/（V×1000）。

其中：x—标准曲线上查出的样品含氮量（μg/ml）；

V—吸取固氮液体积（ml）。

表3 地衣芽孢杆菌LLH-6的固氮效果分析

从表3的数据可知，本发明提供的地衣芽孢杆菌LLH-6在第2、3、5天时固氮量均显著高于对照菌，其中第5天时固氮量高达29.63 mg/50ml，固氮能力非常强，取得了意料不到的技术效果。

实施例5 地衣芽孢杆菌LLH-6产吲哚乙酸（IAA）能力检测

1、将活化的的地衣芽孢杆菌LLH-6种子液按2％的接种量接种于pH 9.0的DF培养基和pH 9.0的DF+培养基（DF培养基中加入0.50g/L色氨酸）中，30℃，150rpm摇瓶培养7天；7天后，将发酵液在4℃、12000rpm条件下离心5min，用Salkowkin比色法测定发酵液中吲哚乙酸IAA的含量。

检测结果显示：在DF培养基中，地衣芽孢杆菌LLH-6产吲哚乙酸的量为19.21±0.45mg/L，在DF+培养基中吲哚乙酸的产量为40.33±0.81mg/L。

2、通过HPLC分析进一步确认地衣芽孢杆菌LLH-6合成的吲哚乙酸产量。

将地衣芽孢杆菌LLH-6在30℃，150rpm条件下培养7天，将发酵液在4℃、12000rpm条件下离心5min，取上清液30mL，用两倍体积乙酸乙酯在恒温振荡器中充分萃取3次，合并萃取液，减压蒸馏，然后用5mL甲醇溶解、定容，经过0.22μm滤膜过滤。

检测仪器：waters2998高效液相色谱；色谱柱：AgilertZorbaxSB-C18250mm×4.6mm，5μm；流动相，甲醇：乙腈：0.6％冰乙酸水溶液（50：5：45，v/v/v）；进样量：20μL；流速0.8mL/min；柱温：室温；检测波长：255nm。

检测结果显示：在DF培养基中，地衣芽孢杆菌LLH-6吲哚乙酸的量为19.87±0.19mg/L，在DF+培养基中吲哚乙酸的产量为40.45±0.33mg/L。

上述结果表明，本发明提供的地衣芽孢杆菌LLH-6能高效分泌吲哚乙酸，因此，该菌株有望开发成微生物肥广泛应用于农业生产中，促进作物生长。

实施例6地衣芽孢杆菌LLH-6对油菜的增产效果实验

1、实验地点：

青岛市平度油菜种植大棚，土壤整体状况较为均匀。

2、实验过程

设置20个实验区，每个实验区为3m×3m的方形区域，且每个实验区之间保持1米的间隔。

实验共设2个组：①空白对照组：不添加任何物质；②地衣芽孢杆菌LLH-6处理组：在每个实验区中按30mL/m²的比例均匀喷施地衣芽孢杆菌LLH-6发酵菌液（活菌量为10⁸-10⁹CFU/ml），然后将表层5-10cm厚的土壤进行有效混匀。每个组随机选择10个实验区。

1）种子处理：用5％的次氯酸钠表面灭菌油菜种子10min，用蒸馏水清洗3-4次除去次氯酸钠后在常温下放置30min自然干燥；

2）播种与收获：在每个实验区均匀播种50g油菜种子，定时浇水和管理，不施加肥料。播种50天后，收获全部油菜，并分别检测每个实验区油菜的鲜重和干重，计算每个处理组油菜的平均鲜重和平均干重，进行比较。

结果显示：喷施地衣芽孢杆菌LLH-6的处理组油菜的平均鲜重和干重比空白对照组分别提高了302.1%和281.4%，增产效果非常显著。从而说明，本发明提供的地衣芽孢杆菌LLH-6能有效提升土壤肥力，促进作物生长，显著提高作物产量，取得了意料不到的技术效果。

实施例7地衣芽孢杆菌LLH-6对草莓根腐病的盆栽防治试验

实验地点：青岛市城阳区夏庄草莓种植大棚。

每个盆钵中装入约3.5kg灭菌土壤。选取长势一致的、无叶斑的健康草莓植株移栽到盆钵中。在缓苗后15天后，按50-100ml/盆将地衣芽孢杆菌LLH-6菌悬液（浓度约10⁹cfu/ml）加入各盆草莓植株根部土壤中，48h后按50ml/盆接入病原菌立枯丝核菌悬液（浓度约10⁷cfu/ml）。

对照组：只接种立枯丝核菌；

处理组1：按50ml/盆接种地衣芽孢杆菌LLH-6菌悬液，接种立枯丝核菌；

处理组2：按100ml/盆接种地衣芽孢杆菌LLH-6菌悬液，接种立枯丝核菌.

每个处理设置3个平行组，每个平行组30盆，每盆1株草莓。统一田间管理，14天后开始调查草莓根腐病的发病情况，计算其病情指数及根腐病防治效率，具体结果见表4。

根腐病病害分为6级：0 级为根系未发病；1级为根系发病率≤30％，叶片正常；2级为30％<根系发病率≤60％，叶片正常；3级为60％<根系发病率≤80％，叶片变黄；4级为根系发病率80％以上，叶片枯萎；5级为整株死亡，叶片干枯。

病情指数＝[Σ(病级株数×病害级数)/(该处理盆栽苗总和×发病最重级的代表数值)]×100。

相对防治效率＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％。

表4 地衣芽孢杆菌LLH-6对草莓根腐病的防治效果

从表4的结果可以看出，与对照组相比，施用地衣芽孢杆菌LLH-6的处理组草莓根腐病的发病率显著下降，防治效率达到85.3%。从而说明，本发明提供的地衣芽孢杆菌LLH-6对草莓根腐病的防治效果非常明显，取得了意料不到的技术效果。

实施例8 地衣芽孢杆菌LLH-6对大姜茎基腐病的防治试验

实验地点选在青岛市平度姜家管村大姜种植区，该地块连年种姜，有严重的重茬病害—茎基腐病。

选取20m×6m的区域作为一个实验区，每个实验区内种10垄姜，约500±30株。共设置12个实验区，每个实验区之间设立保护行。每个处理组随机选择3个实验区进行实验。实验设计如下：

（1）空白对照组：不撒施任何菌粉，直接在姜沟中种姜；

（2）菌粉处理组：先将地衣芽孢杆菌LLH-6菌粉（活菌量约为10亿/g）按2-6kg/亩的用量均匀撒施于姜沟内，然后在姜沟中种姜。其中：

处理组1：LLH-6菌粉用量为2 kg/亩；

处理组2：LLH-6菌粉用量为4 kg/亩；

处理组3：LLH-6菌粉用量为6 kg/亩。

在姜的生长过程中，对各实验区域均采用相同的田间管理方法。在姜收获时，统计姜茎基腐病的发病情况，计算地衣芽孢杆菌LLH-6对大姜茎基腐病的防治效率，具体结果见表5。

病害分级标准：0级，姜株健康无病；1级，母姜株局部发病，子孙姜株健康无病；2级，子孙姜株有病斑，但无枯死；3级，姜丛局部枯死（30%～50%）；4级，姜丛基本枯死或完全枯死，姜肉变色腐烂60%以下；5级，姜丛完全枯死，姜肉腐烂60%以上。

病情指数和相对防治效果计算公式分别为：

病情指数=（∑（各级发病株数×对应发病级数）/（调查总株数×最高发病级数））×100；

相对防效（%）=[（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数×100%。

表5 地衣芽孢杆菌LLH-6对大姜茎基腐病的防治效果

实验分组	病情指数	防治效率
			空白对照组	81.7	-
LLH-6菌粉处理组1	30.1	63.2%
			LLH-6菌粉处理组2	19.7	75.9%
LLH-6菌粉处理组3	11.3	86.2%

从表5的结果可知，与空白对照组相比，各处理组通过在种姜前撒施地衣芽孢杆菌LLH-6菌粉，可大幅度降低姜茎基腐病的病情指数，防治效率高达86.2%。从而说明本发明提供的地衣芽孢杆菌LLH-6对姜茎基腐病具有显著的防治效果，取得了意料不到的技术效果。

实施例9 地衣芽孢杆菌LLH-6对西红柿青枯病的防治试验

首先将供试土壤曝晒2天，消毒后装盆，每盆钵装土约5kg，然后按200mL/盆接种青枯假单胞菌液（菌液浓度约10⁸cfu/ml），搅拌均匀，保湿培养5天。

选取长势一致的4-6叶西红柿幼苗移栽到预处理过青枯假单胞菌的盆钵中，移栽时在地衣芽孢杆菌LLH-6菌悬液（菌悬液浓度约10¹⁰cfu/ml）中蘸根10min，移栽7天后，按每盆40-80ml的接种量进行地衣芽孢杆菌菌悬液灌根处理。

具体试验设计如下：

对照组：只接种青枯假单胞菌；

处理组1：接种青枯假单胞菌，按40ml/盆接种地衣芽孢杆菌LLH-6菌悬液。

处理组2：接种青枯假单胞菌，按80ml/盆接种地衣芽孢杆菌LLH-6菌悬液。

每个处理设置3个平行组，每个平行组30盆，每盆1株西红柿苗。试验期间正常水分管理。移栽20天后，记录西红柿青枯病发病情况，计算其病情指数及青枯病防治效率，具体结果见表6。

青枯病发病情况按标准划分为5级：0级：全株无病；1级：植株1/4以下叶面表现萎蔫症状；2级：植株1/4到1/2叶面表现萎蔫症状；3级：植株1/2以上叶面表现萎蔫症状：4级：全株萎蔫死亡。

表6 地衣芽孢杆菌LLH-6对西红柿青枯病的防治效果

由表6的数据可以看出，与对照组相比，灌施地衣芽孢杆菌LLH-6菌悬液的处理组西红柿，青枯病的病情指数得到显著下降，防治效率高达78.3%。从而说明，本发明提供的地衣芽孢杆菌LLH-6能显著抑制青枯假单胞菌的生长繁殖，有效防治西红柿青枯病，取得了意料不到的技术效果。

除了草莓根腐病、大姜茎基腐病、西红柿青枯病外，本发明提供的地衣芽孢杆菌LLH-6对草莓炭疽病、番茄早疫病、黄瓜白粉病、西瓜根腐病、西瓜茎基腐病、葡萄灰霉病、甜瓜根结线虫病，以及苹果轮纹病、柑橘溃疡病、柑橘黄龙病等多种植物病害均有显著的防治效果，防治效率达到60.8%-75.5%。

综上所述，本发明提供的地衣芽孢杆菌LLH-6可单独作为防治根腐病、青枯病、茎基腐病、炭疽病、灰霉病、早疫病、白粉病、根结线虫、溃疡病等植物病害的生防菌剂、生物肥等，广泛应用于农业生产领域，还可与其他芽孢杆菌、固氮菌、解磷菌、链霉菌等进行组合，用于其他常见植物病害的防治，防治效率普遍高于60%，促生增产效果达到15%以上，效果显著，应用前景广阔。

序列表

<110> 青岛力力惠生物科技股份有限公司

<120> 一种防治植物病害的地衣芽孢杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1496

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<400> 1

gtttgattct ggctcaggac gaacggtggc ggcgtgccta atacaagcaa gtcgagcgga 60

gcacttcggt gcttagcggc ggacgggtga gtaacacgta ggcaacctgc ctgtaagatc 120

gggataacta ccggaaacgg tagctaagac cggatagctg gtttccgtgc atgccggaat 180

catgaaacac ggggcaacct gtggcttacg gatgggcctg cggcgcatta gctagttggc 240

ggggtaacgg cccaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcgtccacac 300

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ggcgcaagcc tgacggagca acgccgcgtg agtgaagaag gttttcggat cgtaaagctc 420

tgttgccagg gaagaatgtc gtggagagta actgctctgc gaatgacggt acctgagaag 480

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ggaattattg ggcgtaaagc gcgcgcaggc ggtcttttaa gtctggtgtt taagcccggg 600

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tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcggctt 720

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tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aggtgttagg ggtttcgata cccttggtgc 840

cgaagtaaac acaataagca ctccgcctgg ggagtacgct cgcaagagtg aaactcaaag 900

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aaccttacca ggtcttgaca tccctctgaa agccctagag atagggtcct ccttcgggac 1020

agaggtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1080

ccgcaacgag cgcaaccctt gactttagtt gccagcattg agttgggcac tctagagtga 1140

ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac 1200

ctgggctaca cacgtactac aatggccggt acaacgggaa gcgaagtcgc gagatggagc 1260

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ggccagccgt cgaaggtggg gtagatgatt ggggtgaagt cgtaacaagg taaccg 1496

Claims

1.一种地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述胶质芽孢杆菌的保藏号为CCTCC NO：M2020162。

2.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌在植物病害防治中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的植物病害为根腐病、茎基腐病、青枯病、炭疽病、早疫病、白粉病、灰霉病、根结线虫病、轮纹病、溃疡病、黄龙病中的任意一种。

4.一种微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂包含权利要求1所述的地衣芽孢杆菌。

5.如权利要求4所述的微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂还包含枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、植物乳杆菌、哈茨木霉、淡紫拟青霉、沼泽红假单胞菌、乳酸菌、泾阳链霉菌、白浅灰链霉菌、克鲁斯假丝酵母、菌根真菌、棕色固氮菌、光合细菌、米曲霉、黑曲霉、绿色木霉中的任意一种或两种或多种的组合。

6.如权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂中地衣芽孢杆菌的活菌量至少为10亿CFU/g。

7.权利要求4-6任一所述的微生物制剂在制备生物肥中的应用。

8.权利要求4-6任一所述的微生物制剂在植物病害防治中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的植物病害为根腐病、茎基腐病、青枯病、炭疽病、早疫病、白粉病、灰霉病、根结线虫病、轮纹病、溃疡病、黄龙病中的任意一种。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物病害为草莓根腐病、姜茎基腐病、西红柿青枯病、草莓炭疽病、番茄早疫病、黄瓜白粉病、西瓜根腐病、西瓜茎基腐病、葡萄灰霉病、甜瓜根结线虫病、苹果轮纹病、柑橘溃疡病、柑橘黄龙病中的任意一种。