CN116656544B - 一种地衣芽孢杆菌及其在防治烟草叶斑病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及烟草叶斑病生物防治技术领域，特别的涉及一种高效防治烟草破烂叶斑病的地衣芽孢杆菌及其应用。本发明公开了一种地衣芽孢杆菌，所述地衣芽孢杆菌保藏于2023年04月03日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.27002。能够有效的抑制烟草破烂叶斑病菌，具有较强的生物防治能力，有良好的生物农药开发前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物生物防治技术领域，特别的涉及地衣芽孢杆菌及其代谢产物在抗烟草叶斑病中的应用，以及抗烟草叶斑病的生物制剂。
背景技术
烟草属隶属茄科（Solanaceae）烟草属（Nicotiana），是卷烟生产的主要原料，也是我国重要的经济作物之一。广西、云南位于我国西南部，地处中、南亚热带季风气候区，热量丰富，雨量充沛，是我国重要的烟草产地。烟草叶斑病是烟草上出现最多的病害，多数由真菌侵染引起，主要发生在烟叶成熟期，病菌主要通过烟叶的伤口和自然孔口侵染叶片，病菌在烟叶组织上产生大量病原子实体，通过风、雨或气流传播，引起病原菌的再次侵染，严重影响烟叶的产量与烘烤质量。根据烟叶感染叶斑病菌后的发病形态特征， 烟草叶斑病有多种类型，包括烟草赤星病、烟草野火病、烟草破烂叶斑病、靶斑病等。烟草破烂叶斑病主要为害烟叶片尤其中下部叶片和茎部。叶片染病，病斑为不规则圆形或近圆形，中心部灰色至褐色，边缘隆起，病健交界处明显，大小 2.5 厘米或更大，常相互愈合，后期病斑易破裂穿孔呈碎叶状。病斑表面具同心轮纹（因此也称为轮纹病），中部常生多个褐色至暗褐色小点,即病菌的分生孢子器。
化学农药的使用会对大气、土壤和水质等环境造成污染以及对人和动物造成危害。而且大量化学农药的使用还会造成抗药性，导致化学农药的使用量增加才能达到抑制效果，最后形成恶性循环，导致滥用农药。利用微生物作为生物农药进行生物防治已经成为了研究热点。芽孢杆菌是目前研究的比较热门的一类菌，目前已经越来越多研究发现芽孢杆菌的拮抗病原菌和植物生长促进作用，CN201110120964.6公开了枯草芽孢杆菌具有兼防烟草野火病和角斑病的能力；CN200810233500.4公开了一种具备拮抗烟草黑胫病的地衣芽孢杆菌菌剂。
发明内容
进一步筛选和研发的能够防治烟草叶斑病的微生物，对于提高烟草品质和减少化学农药的使用具有十分重要的作用。本发明经过对烟草内生拮抗菌的筛选中发现了一株新的地衣芽孢杆菌，测试发现其具有拮抗烟草破烂叶斑病的作用。
本发明的一个方案，本发明公开了地衣芽孢杆菌或其孢子在制备抗烟草叶斑病的制剂中应用，所述生物制剂中含有地衣芽孢杆菌，所述地衣芽孢杆菌分类命名为Bacilluslicheniformis XR1，保藏于2023年04月03日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.27002。
本发明的一个方案，本发明公开了地衣芽孢杆菌或其孢子在制备抗烟草叶斑病的制剂中的应用，所述生物制剂含有地衣芽孢杆菌的代谢产物，所述代谢产物来自地衣芽孢杆菌发酵培养上清，包括孢子和次级代谢产物。
本发明的一个方面，微生物制剂可以是液体、油分散体、可湿润粉剂、冻干粉剂。液体可以是地衣芽孢杆菌的发酵液，也可以是发酵液与其他的缓冲液、微生物培养基、微生物保存液的混合液；油分散体可以是油性物质与微生物菌体的混合液，在某些情况下采用油基分散对于微生物的稳定性更好，常用的分散油脂有甘油、MCT、葵花籽油等。可湿润粉剂是将原料与载体、表面活性剂、辅助剂粉碎的很细且易被水湿润并且能够在水中悬浮分散的农药。可湿粉剂具有表面活性剂、展开剂等因此其容易在作物表面附着而发挥作用。冻干粉剂，微生物易受到温度、紫外线、环境pH的影响，将微生物菌体进行冻干成为冻干粉可有效的避免微生物在不同的温度和环境条件下大幅波动，保持微生物的稳定性。
本发明的一个方案，本发明微生物制剂中还包括具有促进烟草生长的微生物、杀虫剂、杀细菌剂、植物生长调节剂。
本发明的一个方案，本发明公开了地衣芽孢杆菌或其孢子在制备抗烟草叶斑病的制剂中应用，所述生物制剂中含有地衣芽孢杆菌，所述烟草叶斑病是烟草破烂叶斑病。
本发明的一个方案，本发明中的微生物制剂的用量是107cfu/mL。
有益效果
本发明通过筛选和试验发现地衣芽孢杆菌能够对烟草叶斑病中破烂叶斑病菌产生抑制作用，在1×107 CFU/mL的浓度下能够起到比较明显的抑制效果，为烟草叶斑病菌的生物防治生物农药的研制奠定了基础。
附图说明
图1为平板对峙法验证地衣芽孢杆菌对烟草叶斑病菌的拮抗作用。
图2 为平板对峙法验证地衣芽孢杆菌对烟草靶斑病菌的拮抗作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。本发明所述技术方案，如未特别说明均为本领域的常规方式，所述试剂或材料，如未特别说明，均为常规试剂，来源于商业渠道。
实施例1 地衣芽孢杆菌对烟草破烂叶斑病病菌的拮抗作用
分离玉竹根部细菌，并在LB固体培养基上培养，挑取菌落性状差异明显的单菌落纯化、编号，4℃冰箱保存备用。LB培养基的配制：胰蛋白胨(tryptone) 10g；酵母提取物(yeast extract) 5g；氯化钠(NaCl)10g；固体培养基另加 琼脂粉 15-20g。加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH（约0.2ml）调pH至7.2，121℃灭菌30min。对各个编号的菌落进行扩大培养，并初步测试其对烟草叶斑病菌各种致病菌的拮抗能力。经测试发现一株菌对于烟草破烂叶斑病病菌具有抑制作用。
进一步的，提取细菌基因组，用16S通用引物(27F/1492R)扩增16S rDNA序列并测序，将序列在Genbank中进行Blast比对，确认具有抑制作用的菌株为地衣芽孢杆菌中的一种，并对其进行保藏，所述地衣芽孢杆菌分类命名为Bacillus licheniformis XR1，保藏于2023年04月03日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.27002。
平板对峙法验证地衣芽孢杆菌对烟草破烂叶斑病菌以及烟草靶斑病的抑制作用。在LB平板培养基中央移植烟草破烂叶斑病菌/靶斑病菌四周距离 2cm处点接待测拮抗细菌（地衣芽孢杆菌），同时另取平板，在平板中央单独接种病原真菌作对照。每种处理3次重复‚28℃恒温培养‚5ｄ后观察菌落生长情况，用毫米尺测量抑菌带宽度；挑取受抑制的烟草破烂叶斑病菌菌落制片镜检观察菌丝生长情况。参见图1，地衣芽孢杆菌对于烟草破烂叶斑致病菌的生长起到了较强的抑制作用。经计算，地衣芽孢杆菌对于烟草破烂叶斑致病菌的抑制达到了71.3%。参见图2本发明地衣芽孢杆菌对于烟草靶斑病菌的抑制能力较弱。
还将地衣芽孢杆菌菌株‚在LB培养基30℃恒温培养48ｈ‚加灭菌水稀释成含3×107cfu／ｍＬ细菌悬浮液，混合于已熔化的冷却至 40℃的LB培养基中制成含细菌培养基平板；在平板中央接种烟草破烂叶斑病病菌块。同时，以不含地衣芽孢杆菌细菌悬浮液的LB培养基为对照，重复3次置28℃恒温培养5ｄ后检查处理组和对照组的烟草破烂叶斑病菌生长情况‚并测量菌落直径。经比较，含有不含地衣芽孢杆菌的平板烟草破烂叶斑病菌不能正常生长，而未处理的平板烟草破烂叶斑病菌正常生长。
实施例2 地衣芽孢杆菌对抗烟草破烂叶斑致病菌引起的烟草叶斑病的作用
在同一片烟草试验田中对同一批次的烟草按照如下表1的分组对烟草进行处理。
| 编号 | 处理 |
| 1 | 地衣芽孢杆菌活菌液 107cfu／ｍＬ |
| 2 | 地衣芽孢杆菌发酵滤液 |
| 3 | 多菌灵800倍稀释液 |
| 4 | 双蒸水 |
| 5 | 地衣芽孢杆菌PWD-1 (河南德瑞森作物保护有限公司) |
每个组别设置3个重复，每个重复10株烟草，共30株组成一个区，各个区随机分布，每个区之间设置3行不做任何处理的植株作为保护行。地衣芽孢杆菌活菌液由挑选出来的出于生长旺盛期的菌落接种到LB培养基中，28℃、180 r/min 摇床培养 48 h 后制成活菌液，即组别1。将部分活菌液进行离心分离（8000 rpm/min 20min）取上清获得地衣芽孢杆菌发酵滤液，即组别2。将1g多菌灵用800mL双蒸水稀释，即组别3。
将烟草破烂叶斑病菌接种到PDA培养基中，培养48h后收集培养液，调整细菌的密度为105/mL，将菌液喷涂到各个区块的植株中，5天后调查各个区块的发病区块初始发病指数，然后将各个处理组的药业根据需要配置相应的浓度，喷雾于各个处理的烟草植株叶片的正反面上，每隔10 d喷施1次，共喷施药剂2次。第二次喷药10 d天进行再次发病指数调查。每株调查 10 片叶片，分别调查每叶片病情并记录调查总叶数及各级病叶数，严重度分级按照烟草病害分级调查方法（GB/T23222-2008）。
| 编号 | 处理 | 施药前病情指数 | 施药后病情指数 | 平均防效 |
| 1 | 地衣芽孢杆菌活菌液 107cfu／mL | 10.28 | 13.02 | 60.97±5.32%a |
| 2 | 地衣芽孢杆菌发酵滤液 | 11.32 | 14.23 | 58.55±3.35%b |
| 3 | 多菌灵800倍稀释液 | 10.56 | 13.05 | 64.53±4.61%a |
| 4 | 双蒸水 | 10.75 | 17.77 | / |
| 5 | 地衣芽孢杆菌PWD-1 (河南德瑞森作物保护有限公司) | 11.09 | 15.51 | 37.04±5.58%c |
同列小写字母不同表示差异显著（P<0.05），数据均为“平均值±标准差”
由表2可见，本发明地衣芽孢杆菌对于烟草叶斑病具有较强的拮抗抑制作用，在1×107cfu/mL的浓度下，即可以达到60%以上的防治效果与现有地衣芽孢杆菌存在显著的差异，可以用于烟草叶斑病的防治。
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。
Claims (6)
1.一种地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌分类命名为Bacillus licheniformis XR1，保藏于2023年04月03日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.27002。
2.根据权利要求1所述地衣芽孢杆菌在制备抗烟草破烂叶斑病的制剂中应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌的使用剂量为107cfu/mL。
4.根据权利要求3中所述的应用，其特征在于，所述制剂为液体、可湿润粉剂、冻干粉剂。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述制剂中还包括杀虫剂、杀细菌剂、植物生长调节剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述制剂为地衣芽孢杆菌液体制剂，由地衣芽孢杆菌发酵液制备而成。
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