CN109207398A - 一株施氏假单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株施氏假单胞菌及其应用，涉及生物防治植物病害领域。所述菌株为施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)YT2003，保藏编号为CGMCC No.14674。本发明还公开了一种包括所述的施氏假单胞菌菌株YT2003的生物防治制剂及其制备方法。本发明的施氏假单胞菌菌株具有生长速度快、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该施氏假单胞菌菌株制备的生物防治制剂，可以作为生物农药或生物肥料，防治多种土传植物细菌性病害，包括西瓜枯萎病等。
Description
技术领域
本发明涉及生物防治植物病害领域，具体涉及一株施氏假单胞菌及其应用。
背景技术
植物病害严重影响农林作物生长，甚至引起作物死亡，造成重大的经济损失。对于植物病害的防治，常规采用的方法包括传统的化学防治、培育抗病品种以及生物防治。抗病品种周期长，抗性单一。化学防治使用药剂时间长、使用量大，造成农药残留，环境污染；同时，化学农药的长期使用，使得病原菌对其产生抗药性，导致防效下降甚至失败。利用有益微生物防治植物病害具有广阔的前景。
假单胞菌是植物病害生防微生物的重要组成部分，可用于防治多种植物病害。假单胞菌作为生防菌防治植物病害的机制主要有：抗生作用、营养竞争、空间竞争、重寄生作用以及诱导植物产生抗性等机制，假单胞菌的生防机制主要是以产生拮抗物质抑制有害病菌的生长或杀死病原菌。这些物质绝大多数为肽类抗生素，具有高效、低残留、与环境友好等优点。
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供一株施氏假单胞菌及其应用，本发明的菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。
为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：
本发明所提供的菌株为施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri) YT2003，是从土壤中分离获得的，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.14674。其具有以下生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。
优选的，所述施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)YT2003及其制备的生物防治剂可用于防治西瓜枯萎病及其他镰刀菌引起的病害。
优选的，所述施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)菌株YT2003 的培养方法或繁殖方法包括以下步骤：
(1)普通培养保存采用LB培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH调至 7.0-7.2；
(2)实验室液体培养采用LB液体培养基，配方为：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0-7.2；
(3)大量发酵培养配方(重量百分含量)：黄豆粉3.0％，玉米粉 3.0％，轻质碳酸钙0.2％，氯化钠0.1％，其余为水，pH 7.3。
优选的，所述生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)将施氏假单胞菌菌株YT2003移植到LB液体培养基中， 28℃摇床振荡培养2～3d得到种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比3％的比例接种到大量发酵液体培养基中，28-30℃下振荡培养28-32h；
(3)将步骤(2)培养的培养物接种至大量发酵培养基，在控温 28-30℃、初始pH7.3，装液量70％，接菌量3.0％，培养时间30h，通风比1∶0.8。
优选的，所述液体培养基由采用NYBD液体培养基，且NYBD配方：牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化钠4.5g，水1000mL，pH 7.3。
优选的，所述大量发酵培养配方其重量百分含量为：黄豆粉3.0％，玉米粉3.0％，轻质碳酸钙0.2％，氯化钠0.1％，其余为水，pH 7.3。
本发明提供一株施氏假单胞菌及其应用，与现有技术相比优点在于：
本发明的施氏假单胞菌菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该施氏假单胞菌菌株制备的生物防治制剂，可以作为生物农药或生物肥料，防治多种土传植物镰刀菌病害，包括西瓜枯萎病等。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
1、施氏假单胞菌菌株YT2003的分离与纯化
本发明的施氏假单胞菌菌株YT2003是从土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：
(1)杆菌的分离：土样的采集，在全国不同地区选取种植不同作物类型的地块，采用5点取样法，分别采集地块四周和中央深度在10-20 cm范围内的土壤适量，等量混匀。标明采集地点、时间和采集人。称取1g土样于100mL无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，然后置于60℃水浴锅中孵育30min，取100μL 10-2、10-3、10-4稀释液涂布于LB培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养 2d后挑取LB培养基上的不同形态的微生物菌落于LB培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化假单胞菌菌株，分别编号保存。
(2)西瓜枯萎病高效拮抗假单胞菌的筛选
①初筛：采用对峙培养法，制备LB平板，用打孔器在假单胞菌、西瓜枯萎病边缘打取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，25℃恒温培养，逐日观察假单胞菌对病原菌的抑制作用。
②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的假单胞菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的假单胞菌菌株，进行盆栽防治试验和田间试验。
本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治多种植物病害的施氏假单胞菌菌株YT2003。实验证明，该施氏假单胞菌原粉在防治西瓜枯萎病显示出非常高效的防治效果，使得农作物显著增产。因而，本发明的施氏假单胞菌是具有广泛应用前景的施氏假单胞菌新菌株，可以用于制备防治多种植物病害的生物防治制剂。
2、菌株鉴定
(1)微生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
(2)分子生物学特性
该菌株的16s rDNA基因序列测定结果如下(SEQ-1)：
^^
TACTTCTGGAGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTG TGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGACATTCTGATTCACG ATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGA TCCGGACTACGATCGGTTTTATGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCTT GGCAACCCTTTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGC CGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGT TTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATTACGTGCTGGT AACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACA TCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCAG AGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGCATGT CAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACAT GCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAA CCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACTTAATGCGTTAGCTG CGCCACTAAGATCTCAAGGATCCCAACGGCTAGTCGACATCGTTT ACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGC TTTCGCACCTCAGTGTCAGTATTAGCCCAGGTGGTCGCCTTCGCC ACTGGTGTTCCTTCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAA ATTCCACCACCCTCTGCCATACTCTAGCTTGCCAGTTTTGGATGCA GTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGCTTTCACATTCAACTTAACAAACC ACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCAC CCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGTGCTTA TTCTGTCGGTAACGTCAAAACACTAACGTATTAGGTTAATGCCCT TCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACA CACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTC CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCA GTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGTTACGGATCGTCGCCTTG GTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATC TGATAGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTTCCTTCGAAACGTTGTCCCCCACTACCA GGCAGATTCCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTGAATCATGG AGCAAGCTCGGACTACATCCGCTCGACAGCATT
实施例2：
施氏假单胞菌菌株YT2003发酵过程
LB液体培养基：配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0-7.2。
大量发酵培养基配方(质量百分含量)：黄豆粉3.0％，玉米粉3.0％，轻质碳酸钙0.2％，氯化钠0.1％，其余为水，pH 7.3。
施氏假单胞菌菌株YT2003大量发酵过程：
①菌种种子液培养：将施氏假单胞菌菌株YT2003从试管斜面中挑取少量细菌，移至LB液体培养基中，30℃摇床振荡培养3～5d，此为种子液；
②大量固体发酵：将种子液接种比例按1:90接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(30℃和相对湿度85％以上)中发酵培养3-5d，干燥后即可得到假单胞菌原粉，500～600亿/克原粉。
实施例3：
田间药效试验
本实施例提供了施氏假单胞菌菌株YT2003原粉对西瓜枯萎病防治效果的相关实验。
1)供试药剂
施氏假单胞菌菌株YT2003原粉(实施例2中制备)；70％甲基托布津可湿性粉剂(市售)。
2)供试作物与防治对象：
供试作物为西瓜；品种为麒麟8424号；
防治对象：枯萎病。
3)试验地情况、试验设计及安排
试验地设在山东省东营市王老乡新户村西瓜地，土壤为粘土地，往年枯萎病发生较重。试验地栽培条件均匀一致。
本试验设施氏假单胞菌YT2003原粉药种比为1：200、1:400、 1:600；70％甲基托布津可湿性粉剂1:600；清水作对照共5个处理，重复4次。各小区随机区组排列。施药采用灌根，每个小区安排300株。
4)试验调查及计算方法
(1)气象条件
施药当日晴，微风，最高气温为22℃，最低气温为19℃，相对湿度为70％。
(2)药效及安全性调查
药效调查：调查总共1次，在出苗30天进行，记载300株枯萎病发病数，计算病株率及防治效果。
(3)药效计算方法
药效下式计算：
5)结果
(1)供试药剂对西瓜枯萎病的防治效果
施药后30天调查病株数，表1结果显示，清水对照的病株率高达 28.98％，各个处理的病株率均低于清水对照。施氏假单胞菌菌株YT2003原粉，原粉药种比为1：200、1:400、1:600；70％甲基托布津可湿性粉剂1:600处理后的病株率分别为5.19％、7.27％、10.08％，均低于对照药剂，70％甲基托布津可湿性粉剂的病株率为9.52％；施氏假单胞菌菌株YT2003原粉各个处理的防治效果分别为82.09％、 74.91％、65.22％，其中1:200的防治效果最好，与其他处理在P<0.05 水平上具有显著性差异，70％甲基托布津可湿性粉剂对西瓜枯萎病的防治效果为67.15％。施氏假单胞菌菌株YT2003原粉可有效控制西瓜枯萎病的危害。(同一行数据后有相同字母表示经Duncan多重比较后差异不显著(P<0.05))
表1各个处理后西瓜枯萎病的发病率及防治效果
(2)西瓜安全性调查：经观察，各药剂处理区与对照区相比，西瓜生长正常，无药害产生，说明施氏假单胞菌菌株YT2003原粉在供试浓度对西瓜安全。
因此，从发病率和防治效果来看，施氏假单胞菌菌株YT2003 对西瓜枯萎病具有较好的防治效果，药种比400和药种比200的处理，施药后防治效果可达74％以上，明显好于对照药剂，差异显著。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
<110> 宁国市百立德生物科技有限公司
<120> 一株施氏假单胞菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
<213> 施氏假单胞杆菌（pseudomonas stutzeri）
<400> 1
tacttctgga gcaacccact cccatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg 60
tattcaccgt gacattctga ttcacgatta ctagcgattc cgacttcacg cagtcgagtt 120
gcagactgcg atccggacta cgatcggttt tatgggatta gctccacctc gcggcttggc 180
aaccctttgt accgaccatt gtagcacgtg tgtagcccag gccgtaaggg ccatgatgac 240
ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag tctccttaga gtgcccacca 300
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taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcatttgagt tttaaccttg 540
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tcccaacggc tagtcgacat cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgtttg 660
ctccccacgc tttcgcacct cagtgtcagt attagcccag gtggtcgcct tcgccactgg 720
tgttccttcc tatatctacg catttcaccg ctacacagga aattccacca ccctctgcca 780
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acttaacaaa ccacctacgc gcgctttacg cccagtaatt ccgattaacg cttgcaccct 900
tcgtattacc gcggctgctg gcacgaagtt agccggtgct tattctgtcg gtaacgtcaa 960
aacactaacg tattaggtta atgcccttcc tcccaactta aagtgcttta caatccgaag 1020
accttcttca cacacgcggc atggctggat caggctttcg cccattgtcc aatattcccc 1080
actgctgcct cccgtaggag tctggaccgt gtctcagttc cagtgtgact gatcatcctc 1140
tcagaccagt tacggatcgt cgccttggtg agccattacc tcaccaacta gctaatccga 1200
cctaggctca tctgatagcg caaggcccga aggtcccctg ctttctcccg taggacgtat 1260
gcggtattag cgttccttcg aaacgttgtc ccccactacc aggcagattc ctaggcatta 1320
ctcacccgtc cgccgctgaa tcatggagca agctcggact acatccgctc gacagcatt 1379
Claims (8)
1.一株施氏假单胞菌，其特征在于，所述施氏假单胞菌菌株YT2003，其菌株的保藏编号为CGMCC No.14674。
2.根据权利要求1所述的一株施氏假单胞菌，其特征在于：所述施氏假单胞菌为杆状革兰氏阳性菌。
3.一株施氏假单胞菌的应用，其特征在于：所述施氏假单胞菌可用于防治西瓜枯萎病。
4.根据权利要求3所述的一株施氏假单胞菌的应用，其特征在于：所述西瓜枯萎病为镰刀菌西瓜枯萎病。
5.根据权利要求3所述的一株施氏假单胞菌的应用，其特征在于：所述施氏假单胞菌菌株YT2003可制备生物防治制剂防治西瓜枯萎病及其他镰刀菌引起的病害。
6.根据权利要求4所述的一株施氏假单胞菌的应用，其特征在于，所述生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)将施氏假单胞菌菌株YT2003移植到LB液体培养基中，28℃摇床振荡培养2～3d得到种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比3％的比例接种到大量发酵液体培养基中，28-30℃下振荡培养28-32h；
(3)将步骤(2)培养的培养物接种至大量发酵培养基，在控温28-30℃、初始pH7.3，装液量70％，接菌量3.0％，培养时间30h，通风比1∶0.8。
7.根据权利要求6所述的一株施氏假单胞菌的应用，其特征在于：所述步骤(2)中的液体培养基由采用NYBD液体培养基，且NYBD配方：牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化钠4.5g，水1000mL，pH 7.3。
8.根据权利要求6所述的一株施氏假单胞菌的应用，其特征在于：所述步骤(3)中的大量发酵培养配方其重量百分含量为：黄豆粉3.0％，玉米粉3.0％，轻质碳酸钙0.2％，氯化钠0.1％，其余为水，pH7.3。
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