CN113773126B - 一种防治大白菜根肿病的生物有机肥料及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物有机肥料领域，公开了一种防治大白菜根肿病的生物有机肥料及应用。申请人首次筛选了一株可抑制根肿病菌的沙氏芽孢杆菌，并且通过诱变获得了能够稳定遗传的高产菌株，保藏编号为CCTCC NO：M20211208。申请人将该菌株应用于微生物肥料领域，利用该菌株配制了复合微生物菌剂，对物料进行堆肥发酵获得大白菜抗根肿病生物有机肥。本发明能有效利用废弃大白菜等农业废弃物，可降低生产成本，降低大白菜根肿病发病率，提高大白菜产量。

Description

一种防治大白菜根肿病的生物有机肥料及应用
技术领域
本发明属于生物有机肥料领域，具体公开了一种防治大白菜根肿病的生物有机肥料及应用。
背景技术
大白菜又称结球白菜、黄芽菜等，营养丰富，有养胃生津、清热解毒等功效，是我国的原产蔬菜，全国各地均可栽培。十字花科根肿病是一种世界性土传病害，其致病菌目前尚无法人工培养，其分类地位尚存在争议，其休眠孢子在土壤中能存活10年以上。
防治根肿病的有效方法主要包括撒石灰调节土壤pH、轮作、种植抗病品种等，但由于存在土壤板结、经济效益差、不耐储运等缺点，上述措施均未大面积推广。目前尚没有特效药能够防治大白菜根肿病，对于重症地块，常规杀菌剂如多菌灵、福美双、代森锰锌等防效不明显，市场上表现最好的是日本石原株式会社的50％氟啶胺SC与10％氰霜唑SC组合，防效能达到85％，但由于抑制种子萌发及使用成本高昂(每公顷近6000元)等原因，也尚未得到大面积推广应用。
为此，有必要研究一种能防治大白菜根肿病、促进植株生长的生物有机肥料，通过对植物性原料无害化处理，制成能防治根肿病、促进生长的、改良土壤的、提高品质和产量的高效生物有机肥。油菜籽粕和废弃大白菜均为十字花科作物，符合大白菜生长的大部分养分需求，但是直接施用则有植物病原微生物感染作物的潜在安全风险。本发明以废弃大白菜作为有机肥发酵的主要原料，通过复合微生物高温堆肥进行腐熟和植物病原微生物的杀灭，生产适用于大白菜生长需求的生物有机肥。
沙氏芽孢杆菌(Bacillus shackletonii)是一种革兰氏阳性细菌，2004年才得到分离鉴定，确定为芽孢杆菌属的一个新种，目前文献报道较少。华南理工大学刘勇等(2014)筛选到一株能快速积累聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate，PHB)的沙氏芽孢杆菌K5，并进行了发酵性能研究。中国农科院则分离到了一株能快速降解黄曲霉毒素的沙氏芽孢杆菌L7，该菌株37℃下发酵72小时后能将黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2和黄曲霉毒素M1水平分别降低92.1％、84.1％和90.4％。目前未见该菌株在植物病原菌生物防治方面的公开报道，本发明是首次筛选了一株可抑制根肿病菌的沙氏芽孢杆菌，并且通过诱变获得了高产菌株，能应用于微生物肥料或生物农药领域。
发明内容
本发明的目的是提供一种防治大白菜根肿病的生物有机肥料，该有机肥利用废弃大白菜、小麦麸等工农业废弃物，不含有害细菌及虫卵，无重金属等有毒有害物质的含量，可降低生产成本，改善大白菜品质，提高产量。
本发明的另一个目的在于提供一种防治大白菜根肿病生物有机肥料的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
沙氏芽孢杆菌BS156的获得：
申请人从湖北省长阳县高山蔬菜种植地取土壤样品，从578株细菌中筛选到一株拮抗芽孢杆菌B206，对根肿病的生防潜力最大，对休眠孢子萌发的抑制率高达81.6％。通过生理生化及16S rRNA基因序列鉴定，鉴定为沙氏芽孢杆菌(Bacillus shackletonii)。利用常压室温等离子体(ARTP)诱变仪对菌种进行诱变，经过3轮筛选，获得一株高拮抗能力菌株Bacillus shackletonii BS156，抑制率可达92.1％，与出发菌株相比提高了12.9％。菌株经5代传代培养，性能稳定。该菌株于2021年9月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分类命名：沙氏芽孢杆菌(Bacillus shackletonii)BS156，保藏编号为CCTCC NO：M20211208，地址：中国武汉武汉大学。
菌株BS156特征：该菌株在LB培养基上生长良好，48h形成直径3-5mm大小的圆形菌落，白色而有光泽，表面褶皱、平坦，边缘锯齿状。革兰氏染色，油镜观察，菌株BS156菌体形态为杆状，革兰氏阳性，单个、成对或链状排列，芽孢端生。
本发明提供的沙氏芽孢杆菌(Bacillus shackletonii)BS156可用于发酵制备抗根肿病生物有机肥。
一种防治大白菜根肿病的生物有机肥，通过用复合微生物制剂对物料进行堆肥发酵，发酵结束后堆置陈化即得；
所述的物料中的组分以重量份计，包括：大白菜尾菜(即废弃大白菜)60-75、小麦麸20-25、油菜籽粕10-15、复合微生物菌剂0.3-0.5；
所述的复合微生物菌剂的有效活菌数为110-150亿CFU/g，包括：嗜热毁丝霉菌5-10亿CFU/g，枯草芽孢杆菌20-50亿CFU/g，沙氏芽孢杆菌50-100亿CFU/g，多粘类芽孢杆菌1-5亿CFU/g、米曲霉菌1-5亿CFU/g、植物乳杆菌3-5亿CFU/g；
所述的嗜热毁丝霉为：Myceliophthora thermophila MT1810，保藏编号为：CCTCCNO：M2018705；
所述的米曲霉为：米曲霉(Aspergillus oryzae)A08，保藏编号为：CCTCC NO：M2019505；
所述的植物乳杆菌为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantaLum)L16，保藏编号为：CCTCC NO：M2019502；
所述的沙氏芽孢杆菌为：沙氏芽孢杆菌(Bacillus shackletonii)BS156，保藏编号为：CCTCC NO：M20211208；
其余菌株为商品化菌株；
以上所述的生物有机肥，优选的，所述的物料中的组分以重量份计，包括：大白菜尾菜(废弃大白菜)65.5、小麦麸20、油菜籽粕14、复合微生物菌剂0.5；
以上所述的生物有机肥，优选的，所述的物料中的组分以重量份计，包括：大白菜尾菜(废弃大白菜)60、小麦麸25、油菜籽粕14.7、复合微生物菌剂0.3；
以上所述的生物有机肥，优选的，发酵温度升高到60℃以上后每天翻堆，每天1-2次；
以上所述的生物有机肥，优选的，物料的整体重量为发酵初期湿重的50％-60％，即发酵结束；
以上所述的生物有机肥，优选的，堆置陈化10-20天。
一种适用于大白菜的生物有机肥的应用，包括用于制备成抗大白菜根肿病的有机肥，或是直接制备成大白菜有机肥。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
1.本肥料的主要原料是废弃大白菜、小麦麸、油菜籽粕等工农业废弃物，而在目前的有机生物肥中，通常采用畜禽粪便等原料。畜禽粪便通常含有致病微生物、蛔虫卵、重金属和药物残留等，具有一定的安全风险。本发明的生物有机肥主要采用植物基质原料，安全可控，无上述风险。
2.本制备方法采用堆置发酵腐熟技术，利用复合微生物的代谢活动分解和转换物料中的有机质，使物料中的营养元素及有机质达到稳定和无害化，同时具有抑制大白菜根肿病的效果。
3.本生物有机肥能改良土壤，培肥地力，为农作物提供营养，还可促进土壤微生物的活动，特别适合于大白菜植株的生长使用，从而增加大白菜的产量和提高大白菜的品质。
4.本发明是首次筛选了一株可抑制根肿病菌的沙氏芽孢杆菌，并且通过诱变获得了能够稳定遗传的高产菌株，将该菌株应用于微生物肥料或生物农药领域。
具体实施方式
根据以下实施例，可以更好的理解本发明，但所述的实施例是为了更好的解释本发明，而不是对本发明的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
本发明实施例涉及到的菌株来源如下：
所述的嗜热毁丝霉为：Myceliophthora thermophila MT1810，保藏编号为：CCTCCNO：M2018705，已在CN109679856A中公开；
所述的米曲霉为：米曲霉(Aspergillus oryzae)A08，保藏编号为：CCTCC NO：M2019505，已在CN110396028A中公开；
所述的植物乳杆菌为：植物乳杆菌(lactobacillus plantaLum)L16，保藏编号为：CCTCC NO：M2019502，已在CN110396028B中公开；
所述的枯草芽孢杆菌为：Bacillus subtilis，来源于湖北华扬科技发展有限公司；
所述的多粘类芽孢杆菌为：Paenibacillus polymyxa，来源于武汉科诺生物科技有限公司；
本发明所述物料中的各组分，如未特别说明，均为其自然湿重，例如大白菜尾菜、小麦麸粉、油菜籽粕粉均为湿重。
实施例1：
沙氏芽孢杆菌BS156的筛选：
1)菌株的分离与纯化
培养基：
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH6.5，121℃灭菌30min。
LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，pH6.5，121℃灭菌30min。
从湖北省长阳县高山蔬菜种植地取土壤样品，取10g土样至90mL无菌水中，80℃水浴15min，后取0.1ml转接LB培养基固体平板，37℃培养。待菌落长出，随机挑取菌落，纯化，编号并保存。
根分泌物的搜集：大白菜山地王二号种子26℃催芽2～3d，然后用Hoagland营养液在26℃恒温培养箱内光暗交替培养，7d后收集根分泌物溶液，且用细菌过滤器(滤膜孔径0.2μm)除菌后于4℃保存备用。
拮抗微生物培养液的制备:将斜面保存的微生物菌株活化后接入LB液体培养基中的摇床中180r/min振荡培养48h，制成含菌数量108cfu/mL的拮抗菌培养液。
拮抗微生物的筛选：
将拮抗菌培养液和根肿病菌休眠孢子悬浮液各0.5mL以无菌操作方式同时加入已灭菌的装有5mL过滤除菌根分泌物的三角瓶中，以加入无菌水代替拮抗菌培养液为对照，pH6.3，24℃黑暗培养，5d后镜检休眠孢子的萌发情况，3次重复。
休眠孢子萌发的判定采用地衣红法，1％地衣红染液的配制:45mL醋酸，55mL蒸馏水混合，加热，缓慢加入地衣红粉末1g，搅拌溶解后缓缓煮沸2h，过滤储存在棕色瓶中备用。染色3min后，普通光学显微镜下观察，着色的是未萌发的休眠孢子，未着色的是萌发的休眠孢子。
休眠孢子萌发率＝处理后孢子萌发率－处理前孢子萌发率
休眠孢子萌发抑制率＝[(对照孢子萌发率－处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率]×100％
从578株细菌中筛选到一株拮抗芽孢杆菌B206，对根肿病的生防潜力最大，对休眠孢子萌发的抑制率高达81.6％。通过生理生化及16S rRNA基因序列鉴定，该菌株16S rRNA基因与沙氏芽孢杆菌相似性为100％，鉴定为沙氏芽孢杆菌(Bacillus shackletonii)。
2)常压室温等离子体诱变选育沙氏芽孢杆菌B206：
利用常压室温等离子体(ARTP)诱变仪对菌种进行诱变。诱变时的工作气体为氦气。按照处理功率100W，氦气流量12L/min，样品与等离子体发生器出口距离2mm，操作温度在25～35℃，每个金属载片上均匀涂布10μL的孢子菌悬液，分别按30、60、90、120、150、180、210、240、270s不同的诱变照射时间来处理芽孢悬浮液，诱变后将金属载片置于装有1mL无菌生理盐水的EP管中，振荡悬浮，每个处理时间分别做10-1、10-2、10-3三个稀释度进行涂板，每个稀释度涂3个平板，37℃培养2d后进行计数，通过菌落形成单位(colony-formingunits，CFU)来计算致死率、正突变率。对曲线数据进行分析，以正突变率最高的时间点作为最佳诱变时间点进行后续诱变处理，测定根肿病休眠孢子抑制率。
经过3轮筛选，获得一株高拮抗能力菌株Bacillus shackletonii BS156，抑制率可达92.1％，与出发菌株相比提高了12.9％。菌株经5代传代培养，性能稳定。该菌株于2021年9月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分类命名：沙氏芽孢杆菌(Bacillusshackletonii)BS156，保藏号为CCTCC NO：M20211208，地址：中国武汉武汉大学。
菌株BS156特征：该菌株在LB培养基上生长良好，48h形成直径3-5mm大小的圆形菌落，白色而有光泽，表面褶皱、平坦，边缘锯齿状。革兰氏染色，油镜观察，菌株BS156菌体形态为杆状，革兰氏阳性，单个、成对或链状排列，芽孢端生。
实施例2：
沙氏芽孢杆菌BS156抑菌谱的测定
BS156对真菌的抑制效果测定：用直径0.6cm的打孔器在PDA平板上打取培养好的病原菌菌片，转接于另一个PDA平板中央，用接种针将活化的沙氏芽孢杆菌BS156分别对称接种在距病原菌3cm(指距平板中央病原菌菌落边缘3cm)处,对照只接病原菌，之后28℃恒温培养。待对照长满平板时,测量病原菌的平均菌落直径和芽孢杆菌的平均抑菌带宽,计算抑菌率,以沙氏芽孢杆菌的平均抑菌率大小和平均抑菌带宽来衡量拮抗作用的强弱。
表1沙氏芽孢杆菌对病原真菌的抑制效果
Figure BDA0003282727560000061
BS156对细菌的抑制效果测定：分别将指示菌接种于营养肉汤培养基中，37℃培养20h备用。将沙氏芽孢杆菌BS156接种于LB液体培养基，37℃培养20h备用。用乳酸调LB培养基pH值使其与BS156发酵液pH值相同，将其作为对照。将0.1mL指示菌培养液均匀涂抹在固体LB培养基上，待平板干后放置牛津杯，孔径为6.0±0.1mm，在各牛津杯中分别加入沙氏芽孢杆菌发酵液和对照液，先于4℃冰箱放置6h，后置于37℃培养箱18h，观察有无抑菌环并测定对照与沙氏芽孢杆菌发酵液的抑菌直径。
表2沙氏芽孢杆菌对病原真菌的抑制效果
病原 大肠杆菌(mm) 金黄色葡萄球菌(mm) 枯草芽孢杆菌(mm)
BS156 11.26 8.00 8.00
CK 8.00 8.00 8.00
由上表1、表2可知，沙氏芽孢杆菌BS156对供试的植物病原真菌均表现最好的拮抗效果，对刺盘孢菌的平板抑制率为50％，对茄链格孢菌抑制率为48.57％，对尖孢镰刀菌抑制率为42.86％(表1)。但沙氏芽孢杆菌BS156对供试细菌的拮抗效果较差，仅对大肠杆菌(Escherichia coli)有部分抑制，对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)没有抑制。总体来说，该菌株对植物病原真菌表现出了良好的防治效果。
实施例3：
沙氏芽孢杆菌BS156在制备植物根肿病生防菌剂中的应用：
盆栽防效试验：盆土取自田间，121℃湿热灭菌2h。将收集保存的根肿病肿根清洗后用粉碎机磨碎，通过粗纱布过滤后用Neubauer血球计数板计数，与无菌土按一定比例混，使孢子数量为106个/g土。
在塑料钵(25.5cm×18.5cm×20.5cm)的下层装无菌土，上层装混合好的菌土，使菌土的厚度至少达到6cm。大白菜种子撒播于盆土中。对沙氏芽孢杆菌BS156菌株进行室内盆栽防治大白菜根肿病试验。
分别在播种前7d、播种期、播种后15d、播种后25d，采用灌根法将沙氏芽孢杆菌BS156培养液(有效菌浓度为5亿cfu/mL)浇于植株的根部，每个处理3盆，每盆5株，每盆每次浇培养液200mL。设置清水对照。每个处理定期浇Hoagland营养液，所有用于浇灌的水和营养液的pH值调至6.0-6.5。种植期35d。
盆栽病害分级标准：0级，无任何肿瘤；1级，主根肿大，其直径小于2倍茎基，或须根有小肿瘤；3级，主根肿大，其直径为茎基的2-3倍；5级，主根肿大，其直径为茎基的3-4倍；7级，主根肿大，其直径为茎基的4倍以上，死亡植株按7级计算。
病株率＝发病株数/总株数×100％
病情指数＝∑(发病级代表值×各级病株数)×100/(调查总株数×最高级发病代表值)
防治效果＝[(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数]×100％
表3沙氏芽孢杆菌BS156对根肿病的盆栽防治效果
病原 病株率(％) 病情指数 防治效果
BS156 6.7 10.5 89.2％
CK 93.3 97.5 --
由表3可知，沙氏芽孢杆菌BS156对大白菜根肿病具有良好的防治效果，防治效果可达89.2％。
实施例4：
一种防治大白菜根肿病的生物有机肥料，通过下述步骤获得：
实验组：
大白菜尾菜(废弃大白菜)切割粉碎至1-3cm大小；
将655kg大白菜尾菜、200kg小麦麸粉、140kg油菜籽粕粉，调整水分到55％，接种5kg复合微生物菌剂混合均匀，发酵温度升高到60℃以上后每天翻堆，每天2-3次，发酵周期21天，物料的整体重量为发酵初期湿重的50％，实验组的环境温度为20-35℃。
所述的复合微生物菌剂的总菌数为170亿CFU/g，包括：嗜热毁丝霉菌10亿CFU/g，枯草芽孢杆菌100亿CFU/g，沙氏芽孢杆菌50亿CFU/g，多粘类芽孢杆菌2亿CFU/g、米曲霉菌数为3亿CFU/g、植物乳杆菌5亿CFU/g。
发酵完成后堆置陈化20天后即可得到成品。
对照组(即不添加实验组中的沙氏芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌多加了50亿CFU/g)：
大白菜尾菜(废弃大白菜)切割粉碎至1-3cm大小；
将655kg大白菜尾菜、200kg小麦麸粉、140kg油菜籽粕粉，调整水分到55％，接种5kg复合微生物菌剂混合均匀，发酵温度升高到60℃以上后每天翻堆，每天2-3次，发酵周期21天，物料的整体重量为发酵初期湿重的50％。本实施例的环境温度为20-35℃。
所述的复合微生物菌剂的总菌数为170亿CFU/g，包括：嗜热毁丝霉菌10亿CFU/g，枯草芽孢杆菌150亿CFU/g，多粘类芽孢杆菌2亿CFU/g、米曲霉菌数为3亿CFU/g、植物乳杆菌5亿CFU/g。
发酵完成后堆置陈化20天后即可得到成品。
实施例5：
一种防治大白菜根肿病的生物有机肥料，通过下述步骤获得：
将600kg大白菜尾菜、250kg小麦麸粉、147kg油菜籽粕粉，调整水分到55％，接种3kg复合微生物菌剂混合均匀，发酵温度升高到60℃以上后每天翻堆，每天1-2次，发酵周期28天，物料的整体重量为发酵初期湿重的60％。本实施例的环境温度为10-20℃。
所用的复合微生物菌剂同实施例4实验组；
发酵完成后堆置陈化20天后即可得到成品。
实施例6：
制得的有机肥的理化指标：
参照NY884-2012生物有机肥行业标准所规定的指标和方法，对实施例4和实施例5制得的生物有机肥进行检测，结果如下表4所示，两个实施例中制备的有机肥的有效活菌数分别为10.2亿/g和13.6亿/g，远高于行业标准0.20亿/g。其他技术指标也全部符合NY884-2012的要求。
表4生物有机肥检测结果
Figure BDA0003282727560000081
Figure BDA0003282727560000091
对实施例4制得的生物有机肥进行根肿菌孢子检测，结果如下表5所示，有经过高温堆肥发酵后，实验组有机肥中的根肿菌孢子被全部杀灭，发酵后检测不到，而未添加沙氏芽孢杆菌的对照组中仍有零星孢子存在。因此本技术生产的生物有机肥可以安全用于大白菜作物施肥。
表5生物有机肥中根肿菌检测结果
项目名称 发酵前实验组 发酵前对照组 发酵后实验组 发酵后对照组
根肿菌孢子数，个/kg 65 63 未检出 5
实施例7：
将实施例4实验组制得的生物有机肥用于大白菜种植试验，以验证生物有机肥对大白菜生长和根肿病防治的作用。
试验共设两个处理：
实验组：实施例2生产的生物有机肥(有效活性菌10.20亿/g)150kg、45％复合肥(N∶P∶K＝15∶15∶15)120kg。
对照组：普通有机肥(NPK≥5％，有机质≥45％)150kg，45％复合肥(N∶P∶K＝15∶15∶15)120kg。
试验按随机区组排列，三次重复，每个小区面积667m2。试验大白菜品种为山地王二号，种植密度为3800株/667m2，试验在湖北省长阳县贺家坪镇进行。
试验结果如表6所示，生物有机肥处理组比空白对照组相比，大白菜成熟期根肿病发病率降低78.8％，产量提高15.7％。
发病率＝发病株数/总株数×100％
表6生物有机肥对大白菜根肿病和产量的影响
Figure BDA0003282727560000092
Figure BDA0003282727560000101
本发明中，沙氏芽孢杆菌Bacillus shackletonii BS156对大白菜根肿病病原菌有良好的拮抗和抑制作用，能有效降低根肿病的发病率。同时，微生物在发酵过程中能产生大量的热量，从而能使发酵基质混合物中的水分挥发出去，达到脱水的效果，所产生的热量能有效彻底杀灭有害细菌及虫卵。

Claims (5)

1.保藏编号为CCTCC NO：M20211208的沙氏芽孢杆菌Bacillus shackletonii 菌株BS156在发酵制备抗根肿病生物有机肥中的应用，该沙氏芽孢杆菌菌株于2021年9月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉市武汉大学。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的应用中的抗根肿病生物有机肥是通过用复合微生物菌剂对物料进行堆肥发酵，发酵结束后堆置陈化即得；所述的复合微生物菌剂的有效活菌数为110-150亿CFU/g，包括：嗜热毁丝霉菌5-10亿CFU/g，枯草芽孢杆菌20-50亿CFU/g，沙氏芽孢杆菌50-100亿CFU/g，多粘类芽孢杆菌1-5亿CFU/g、米曲霉菌1-5亿CFU/g、植物乳杆菌3-5亿CFU/g；
所述的嗜热毁丝霉为：Myceliophthora thermophila MT1810，保藏编号为：CCTCC NO：M2018705；
所述的米曲霉为：米曲霉(Aspergillus oryzae) A08，保藏编号为：CCTCC NO：M2019505；
所述的植物乳杆菌为：植物乳杆菌（Lactobacillus plantaLum）L16，保藏编号为：CCTCC NO：M2019502；
所述的沙氏芽孢杆菌为：沙氏芽孢杆菌（Bacillus shackletonii）BS156，保藏编号为：CCTCC NO：M20211208。
3.根据权利要求2所述的应用，所述的物料中的组分以重量份计，包括：大白菜尾菜60-75、小麦麸20-25、油菜籽粕10-15、复合微生物菌剂0.3-0.5。
4.根据权利要求2所述的应用，其制备的抗根肿病生物有机肥用于制备成抗大白菜根肿病的有机肥。
5.根据权利要求2所述的应用，其制备的抗根肿病生物有机肥用于制备成大白菜有机肥。
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