CN110295129A - 一种用于防治黄瓜灰霉病和白粉病的生防菌及应用 - Google Patents

一种用于防治黄瓜灰霉病和白粉病的生防菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于防治黄瓜灰霉病和白粉病的生防菌及应用，属于生物防治技术领域。本发明首次分离获得一株生防菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F17062，经研究证实，其能有效在黄瓜等农作物表面定殖，改善农作物微生态环境，室内盆栽药效结果表明，生防菌F17062菌剂对黄瓜灰霉病防效为87.69％，对黄瓜白粉病防效为75.92％，从而有效防治黄瓜灰霉病和白粉病。本发明生防菌F17062对黄瓜灰霉病和白粉病防治效果好，且不易产生抗药性；另外，本发明生防菌剂对环境友好，制备简单，使用安全、方便，易于推广，具有良好的实际应用之价值。

Description

一种用于防治黄瓜灰霉病和白粉病的生防菌及应用
技术领域
本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一种用于防治黄瓜灰霉病和白粉病的生防菌及应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
灰霉病是由灰葡萄孢菌引起的一种世界性病害，在世界十大病原真菌病害中位居第二。灰霉病菌对温室大棚中作物的危害尤为严重，持续高湿、光照不足、通风不及时等均会引起灰霉病的发生，严重时可使蔬菜减产50％甚至绝收，目前灰霉病已成为影响我国保护地蔬菜经济的严重障碍。
白粉病又称白毛病，是一种广泛发生的世界性病害。白粉病是由葫芦科白粉菌或单丝壳白粉菌引起的，病原菌主要通过气流传播，具有潜育期短、再侵染频繁、流行性强等特点。在我国，夏秋露地和春保护地蔬菜每年都因白粉病的发生造成大量减产。
现阶段，防治灰霉病和白粉病最主要的手段还是施用化学农药。但由于化学农药长时间、高剂量的施用，病菌在药剂的选择压力下极易产生抗药性，甚至出现了适用药很多但又无药可治的窘境。而微生物农药与化学农药相比，具有选择性强、无污染、不易产生抗药性、不破坏生态环境等特点，业已成为研究热点。
芽孢杆菌(Bacillus sp.)具有分布广泛、抗逆性强、易于培养等优良特征，因此生防芽孢杆菌及其制剂在植物病害绿色防控中具有广阔的应用前景。
目前，用于防治黄瓜灰霉病和白粉病的芽孢杆菌有解淀粉芽孢杆菌SW17(CN201710612011.9)、海洋芽孢杆菌B-9987(CN 201810754148.2)、枯草芽孢杆菌LVLE14(CN201610756959.7)、解淀粉芽孢杆菌HW05(CN 201810578016.9)等，然而由于单一菌株的局限性和致病菌的同步进化等原因，还需要寻找新的菌株用于黄瓜灰霉病和白粉病的防治。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供一种用于防治黄瓜灰霉病和白粉病的生防菌及应用，经研究发现，本发明提供的生防菌F17062能够同时有效防治黄瓜灰霉病和白粉病，从而为进一步丰富灰霉病和白粉病等抗菌资源库提供基础。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明的第一个方面，提供一株生防菌F17062，所述生防菌F17062分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，于2019年4月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.17610。
含有所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F17062的菌剂也属于本发明的保护范围。
所述菌剂可以是下述1)-3)中任一的菌剂：
1)用于防治黄瓜灰霉病的菌剂；
2)用于防治黄瓜白粉病的菌剂；
3)用于防治黄瓜灰霉病和白粉病的菌剂。
本发明的第二个方面，提供上述菌剂的制备方法，所述制备方法包括：发酵上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F17062，得到发酵产物，即得到菌剂。
进一步的，发酵培养液为LB培养液，所述LB培养液成分为：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L。
进一步的，所述发酵的条件如下：发酵培养液pH值为7.0-7.2，培养温度为28-30℃，摇床震荡速率为180-200rpm，培养时间72h。
由上述方法制备得到的菌剂，所述菌剂的活菌总浓度具体为5×108-1×1010CFU/ml。
其中，所述菌剂的活性成份可为所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F17062，也可还含其他物质，如其他防治黄瓜灰霉病和/或黄瓜白粉病的菌剂或菌株。
所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。
所述固体载体为矿物材料、生物材料或高分子化合物；所述矿物材料为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石、草炭土和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述高分子化合物为聚乙烯醇和/或聚二醇。
所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂为癸烷和/或十二烷。
所述菌剂中，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F17062可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。
所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
本发明的第三个方面，含有所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F17062或所述菌剂的生物有机肥也属于本发明的保护范围。
本发明的第四个方面，提供所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F17062或所述菌剂或所述生物有机肥在防治黄瓜灰霉病和/或黄瓜白粉病中的应用。
本发明的第五个方面，提供一种防治黄瓜灰霉病和/或黄瓜白粉病的方法，所述方法包括向黄瓜植株表面及周围土壤中喷施所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F17062或所述菌剂或所述生物有机肥。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果是：
本发明首次分离获得一株生防菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F17062，经研究证实，其能有效在黄瓜等农作物表面定殖，改善农作物微生态环境，室内盆栽药效结果表明，生防菌F17062菌剂对黄瓜灰霉病防效为87.69％，对黄瓜白粉病防效为75.92％，从而有效防治黄瓜灰霉病和白粉病。这表明其在减少化学农药使用量，提高农产品品质以及在食品安全生产等方面极具前景，具有良好的实际应用之价值。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如前所述，由于单一菌株的局限性和致病菌的同步进化等原因，还需要寻找新的菌株用于黄瓜灰霉病和白粉病的防治。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一株用于防治黄瓜灰霉病和黄瓜白粉病的生防菌F17062，所述生防菌F17062为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，2019年4月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.17610。
本发明的另一具体实施方式中，提供一种生防菌F17062菌剂，所述生防菌F17062菌剂的制备方法，包括：
将4℃保存的生防菌F17062在LB平板培养基上活化，用接种环挑取活化菌株F17062接种于LB培养液中培养成种子液，然后按5％接种量接种到发酵培养液中发酵即可获得生防菌发酵液，即菌剂。
其中，所述LB平板培养基成分为：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，琼脂粉16g/L，pH值为7。
所述制作LB平板培养基pH值优选7.0-7.2，培养温度优选28-30℃，培养时间24h。
所述LB培养液成分为：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，pH值为7。
所述制作种子液的LB培养液pH值优选7.0-7.2，培养温度优选28-30℃，摇床震荡速率为180-200rpm，培养时间24h。
所述发酵培养液成分为：葡萄糖20g/L，氯化钠2g/L，磷酸氢二钠0.05g/L，可溶淀粉10g/L，牛肉膏1g/L，酵母浸粉4g/L，pH值为7。
所述发酵培养液pH值优选7.0-7.2，培养温度优选28-30℃，摇床震荡速率为180-200rpm，培养时间72h。
本发明的另一具体实施方式中，提供一种生物有机肥，所述生物有机肥包含上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F17062或所述菌剂。
本发明的另一具体实施方式中，提供上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)F17062或所述菌剂或所述生物有机肥在防治黄瓜灰霉病和/或黄瓜白粉病中的应用。
本发明的另一具体实施方式中，提供一种防治黄瓜灰霉病和/或黄瓜白粉病的方法，所述方法包括向黄瓜植株表面及周围土壤中喷施所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)F17062或所述菌剂或所述生物有机肥。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
1、菌种来源及菌种鉴定
所述生防菌F17062为贝莱斯芽孢杆菌，分离于辽宁省朝阳市林下土壤中。通过分子生物学鉴定获知其16S rDNA全长为1485bp，序列如SEQ ID NO.1所示，经形态学、生理生化指标及16S rDNA的鉴定，确定本发明的生防菌F17062为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。
2、菌种的保藏
本发明所述生防菌株F17062，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体保藏信息如下：
保藏说明
菌种名称：贝莱斯芽孢杆菌
拉丁名：Bacillus velezensis
菌株编号：F17062
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2019年4月22日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17610
3、生防菌剂的制备
将4℃保存的生防菌F17062在LB平板培养基上活化，28℃下培养24h即可得到活化菌株。用接种环挑取活化菌株F17062接种于100mL的LB培养液中，28℃、180rpm下培养24h，制备种子液。按照5％接种量将种子液接种到发酵培养液中，28℃、180rpm下培养72h即可获得生防菌发酵液，即为生防菌菌剂，发酵所得菌剂的活菌总浓度为5×108-1×1010CFU/ml。
4、生防菌F17062菌剂对黄瓜灰霉病的盆栽防效
将生防菌F17062发酵液制备成5×108CFU/ml的菌剂，备用。以未接种子液的发酵培养液为空白对照，同等操作条件下获得空白对照液。试验用药前一天选择子叶期长势一致盆栽黄瓜苗，用喷雾法将待测生防菌剂和空白对照液喷洒于瓜苗叶片上，喷好药后将试材在温室中晾干24h后备用。向已长满孢子的黄瓜灰霉培养皿中加入纯净水，轻轻刮取表面孢子，用纱布过滤，制成孢子悬浮液(约1×105个孢子/mL)。然后用喷枪将孢子悬浮液均匀喷洒在叶面上，接种后立即移至恒温保湿箱中保温保湿培养，4天后对发病情况进行调查。
病情分级方法为：
0级：无病斑；
1级：病斑占整个叶面积的5％以下；
3级：病斑占整个叶面积的5％-15％；
5级：病斑占整个叶面积的15％-25％；
7级：病斑占整个叶面积的25％-50％；
9级：病斑占整个叶面积的50％以上。
根据分级标准分别计算病情指数及防治效果。
黄瓜灰霉病防效结果见表1。
表1生防菌F17062菌剂对黄瓜灰霉病的盆栽防效
处理 病情指数 防效(％)
空白对照 72.2 -
生防菌剂 8.89 87.69
5、生防菌F17062菌剂对黄瓜白粉病的盆栽防效
将生防菌F17062发酵液制备成5×108CFU/ml的菌剂，备用。以未接种子液的发酵培养液为空白对照，同等操作条件下获得空白对照液。试验用药前一天选择真叶期长势一致盆栽黄瓜苗，用喷雾法将待测生防菌悬浊液和空白对照液喷洒于瓜苗叶片上，喷好药后将试材在温室中晾干24h后备用。用加有少量表面活性剂吐温-80的纯净水，洗取长满白粉病黄瓜叶片上的新鲜孢子，用双层纱布过滤，制成孢子悬浮液(约1×105个孢子/mL)。然后用喷枪将孢子悬浮液均匀喷洒在叶面上，自然风干，然后移至恒温室(25℃)中，7天后对发病情况进行调查。
病情分级方法为：
0级：无病斑；
1级：病斑占整个叶面积的5％以下；
3级：病斑占整个叶面积的5％-15％；
5级：病斑占整个叶面积的15％-25％；
7级：病斑占整个叶面积的25％-50％；
9级：病斑占整个叶面积的50％-75％；
11级：病斑占整个叶面积的75％以上。
根据分级标准分别计算病情指数及防治效果。
黄瓜白粉病防效结果见表2。
表2生防菌F17062菌剂对黄瓜白粉病的盆栽防效
处理 病情指数 防效(％)
空白对照 68.73 -
生防菌剂 16.55 75.92
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农药科学研究院
<120> 一种用于防治黄瓜灰霉病和白粉病的生防菌及应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1485
<212> DNA
<213> 贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）F17062 16S rDNA
<400> 1
acttcacccc aatcatctgt cccaccttcg gcggctggct ccataaaggt tacctcaccg 60
acttcgggtg ttacaaactc tcgtggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt 120
attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac tagcgattcc agcttcacgc agtcgagttg 180
cagactgcga tccgaactga gaacagattt gtgggattgg cttaacctcg cggtttcgct 240
gccctttgtt ctgtccattg tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg catgatgatt 300
tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt caccttagag tgcccaactg 360
aatgctggca actaagatca agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg 420
acacgagctg acgacaacca tgcaccacct gtcactctgc ccccgaaggg gacgtcctat 480
ctctaggatt gtcagaggat gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa 540
accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc agtcttgcga 600
ccgtactccc caggcggagt gcttaatgcg ttagctgcag cactaagggg cggaaacccc 660
ctaacactta gcactcatcg tttacggcgt ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct 720
ccccacgctt tcgctcctca gcgtcagtta cagaccagag agtcgccttc gccactggtg 780
ttcctccaca tctctacgca tttcaccgct acacgtggaa ttccactctc ctcttctgca 840
ctcaagttcc ccagtttcca atgaccctcc ccggttgagc cgggggcttt cacatcagac 900
ttaagaaacc gcctgcgagc cctttacgcc caataattcc ggacaacgct tgccacctac 960
gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag ccgtggcttt ctggttaggt accgtcaagg 1020
tgccgcccta tttgaacggc acttgttctt ccctaacaac agagctttac gatccgaaaa 1080
ccttcatcac tcacgcggcg ttgctccgtc agactttcgt ccattgcgga agattcccta 1140
ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct 1200
caggtcggct acgcatcgtc gccttggtga gccgttacct caccaactag ctaatgcgcc 1260
gcgggtccat ctgtaagtgg tagccgaagc caccttttat gtctgaacca tgcggttcaa 1320
acaaccatcc ggtattagcc ccggtttccc ggagttatcc cagtcttaca ggcaggttac 1380
ccacgtgtta ctcacccgtc cgccgctaac atcagggagc aagctcccat ctgtccgctc 1440
gacttgcatg tattaggcac gccgccagcg ttcgtcctga gccag 1485

Claims (10)

1.一株生防菌F17062，其特征在于，所述生防菌F17062分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，于2019年4月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17610。
2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂活性成份为所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)F17062。
3.如权利要求2所述菌剂，其特征在于，所述菌剂是下述1)-3)中任一的菌剂：
1)用于防治黄瓜灰霉病的菌剂；
2)用于防治黄瓜白粉病的菌剂；
3)用于防治黄瓜灰霉病和白粉病的菌剂。
4.权利要求2或3所述菌剂的制备方法，其特征在于，制备方法包括：发酵所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F17062，得到发酵产物，即得到菌剂。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，发酵培养液为LB培养液；
优选的，所述发酵的条件如下：发酵培养液pH值为7.0-7.2，培养温度为28-30℃，摇床震荡速率为180-200rpm，培养时间72h。
6.如权利要求2或3所述菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成份还包括其他防治黄瓜灰霉病和/或黄瓜白粉病的菌剂或菌株。
7.如权利要求2或3所述菌剂，其特征在于，所述菌剂还可包括载体；所述载体为固体载体或液体载体。
8.一种生物有机肥，其特征在于，所述生物有机肥权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F17062或权利要求2或3所述菌剂。
9.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F17062或权利要求2或3所述菌剂或权利要求8所述生物有机肥在防治黄瓜灰霉病和/或黄瓜白粉病中的应用。
10.一种防治黄瓜灰霉病和/或黄瓜白粉病的方法，其特征在于，所述方法包括向黄瓜植株表面及周围土壤中喷施权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)F17062或权利要求2或3所述菌剂或权利要求8所述生物有机肥。
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