CN105018395A - 一株短小芽孢杆菌及其在防治苹果斑点落叶病中的应用 - Google Patents
一株短小芽孢杆菌及其在防治苹果斑点落叶病中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株短小芽孢杆菌及其在防治苹果斑点落叶病中的应用。该菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus？pumilus)菌株QZ-002H，保藏编号为CGMCC？No.11050。本发明还公开了一种包括所述的短小芽孢杆菌菌株QZ-002H的生物防治制剂及其制备方法。实验表明，本发明的短小芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该短小芽孢杆菌制备的生物防治制剂，可以有效防治苹果斑点落叶病。
Description
技术领域
本发明属于生物防治植物病害领域。具体而言，本发明涉及一株能够高效防治植物病害的短小芽孢杆菌及其用途，以及采用该短小芽孢杆菌制备的生物防治制剂。
背景技术
植物病害严重影响农林作物生长，甚至引起作物死亡，造成重大的经济损失。对于植物病害的防治，常规采用的方法包括传统的化学防治、培育抗病品种以及生物防治。抗病品种周期长，抗性单一。化学防治使用药剂时间长、使用量大，造成农药残留，环境污染；同时，化学农药的长期使用，使得病原菌对其产生抗药性，导致防效下降甚至失败。利用有益微生物防治植物病害具有广阔的前景。
芽孢杆菌是一种广泛分布于各种不同生活环境中的腐生细菌，是一群好氧兼厌氧的产芽孢革兰氏阳性杆菌的总称，可以产生内生耐热抗逆的芽孢。芽孢不仅对热有抗逆性，还对紫外线、电磁辐射及一些化学药品有很强的抗逆性，它可以忍受各种不良环境。由于具有如此强的抗逆性，使得它有利于生防菌剂的生产和剂型加工，也利于其在环境中的存活、定殖与繁殖。由于它们生长快、营养简单、能够形成具有较强抗逆性能力的芽孢，在产品开发中较非芽孢杆菌有效活菌数量高、性能稳定等优势而备受瞩目。芽孢杆菌是植物病害生防微生物的重要组成部分，可用于防治多种植物病害。芽孢杆菌作为生防菌防治植物病害的机制主要有：抗生作用、营养竞争、空间竞争、重寄生作用以及诱导植物产生抗性等机制，芽孢杆菌的生防机制主要是以产生拮抗物质抑制有害病菌的生长或杀死病原菌。这些物质绝大多数为肽类抗生素，具有高效、低残留、与环境友好等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于高效防治苹果斑点落叶病的新的细菌——短小芽孢杆菌菌株QZ-002H。本发明的短小芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：本发明所提供的菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株QZ-002H，是从青岛市胶州湾的海泥中分离获得的，已于2015年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.11050。其具有以下生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)，经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
本发明短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株QZ-002H的培养方法或繁殖方法包括：
(1)普通培养保存采用LB培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0-7.2；
(2)实验室液体培养采用LB液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0-7.2；
(3)固体培养基配方：固料和无机盐溶液，按质量比1：1.8的比例配制。其中固料由质量比为60：40的玉米粉和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液的组分及含量为：3.5％磷酸二氢钾，0.04％硫酸镁，4％硫酸铵，剩余为水。
(4)大量发酵培养基配方：同(3)中固体培养基配方。
本发明还提供一种包括所述的短小芽孢杆菌菌株QZ-002H的生物防治制剂。
本发明所述的生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)制备所述短小芽孢杆菌菌株QZ-002H的种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，28-30℃下恒温培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28-30℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。
其中，步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶液的质量比为1：1.8；其中固料由质量比为60：40的玉米粉和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液的组分及含量为：3.5％磷酸二氢钾，0.04％硫酸镁，4％硫酸铵，剩余为水。
并且，步骤(3)中的大量发酵培养基同固体培养基。
在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将所述短小芽孢杆菌菌株QZ-002H的孢子移植到LB液体培养基中，28-30℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，28-30℃下振荡培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至发酵培养基，室温28℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9d。
本发明还提供了上述短小芽孢杆菌菌株QZ-002H或者上述生物防治制剂在防治苹果斑点落叶病中的用途。
本发明还提供了一种用于防治苹果斑点落叶病的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有苹果斑点落叶病的植物施用上述短小芽孢杆菌菌株QZ-002H或者上述生物防治制剂。
实验表明，本发明的短小芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该短小芽孢杆菌制备的生物防治制剂，可以有效防治苹果斑点落叶病。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
1、短小芽孢杆菌菌株QZ-002H的分离与纯化
本发明的短小芽孢杆菌菌株QZ-002H是从青岛胶州湾的海泥中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：
⑴芽孢杆菌的分离：海泥的采集，在青岛胶州湾不同区域选取不同质地海泥，采用随机取样法，分别采集地块四周和中央深度在10-20cm范围内的海泥适量，等量混匀。标明采集地点、时间和采集人。称取1g海泥样品于100mL无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，然后置于60℃水浴锅中孵育30min，取100μL 10-2、10-3、10-4稀释液涂布于LB培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养2d后挑取LB培养基上的不同形态的微生物菌落于LB培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，分别编号保存。
⑵苹果斑点落叶病高效拮抗芽孢杆菌的筛选
①初筛：采用对峙培养法，制备PDA平板，用打孔器在芽孢杆菌、苹果斑点落叶病边缘打取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，25℃恒温培养，逐日观察芽孢杆菌对病原菌的抑制作用。
②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的芽孢杆菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的芽孢杆菌菌株，进行室内生长抑制试验。
本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治多种植物病害的短小芽孢杆菌(B.pumilus)QZ-002H。实验证明，该短小芽孢杆菌原粉在防治苹果斑点落叶病显示出非常高效的防治效果，使得农作物显著增产。因而，本发明的短小芽孢杆菌是具有广泛应用前景的短小芽孢杆菌新菌株，可以用于制备防治苹果斑点落叶病的生物防治制剂。
2、菌株鉴定
(1)微生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
(2)分子生物学特性
该菌株的16s rDNA基因序列测定结果(SEQ-1)如下：
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGACTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGATGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTCGGGCAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA
实施例2
1、芽孢杆菌菌株QZ-002H发酵过程
LB液体培养基：配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0-7.2。
大量固体发酵培养基配方(质量百分含量)：固料：玉米粉60％，麸皮40％；无机盐溶液：磷酸二氢钾3.5％，硫酸镁0.04％，硫酸铵4％，剩余为水；固液比为1:1.8(质量比)。
短小芽孢杆菌菌株QZ-002H大量固体发酵过程：
①菌种种子液培养：将短小芽孢杆菌菌株QZ-002H从试管斜面中挑取少量细菌，移至LB液体培养基中，30℃摇床振荡培养3～5d，此为种子液。
②固体生产菌种的培养：将种子液按10％的比例接种到固体培养基(500mL三角瓶)中，30℃恒温培养3～5d，中间多次振荡。
③大量固体发酵：将②中固体培养的培养物用无菌水按1:15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，出去粗渣，即为生产菌液，接种比例按1:6接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(30℃和相对湿度85％以上)中发酵培养8～9d，发酵液干燥后即可得到短小芽孢杆菌原粉，菌活为400-500亿/克。
④短小芽孢杆菌菌株QZ-002H可湿性粉剂：短小芽孢杆菌原粉1-30、白炭黑1-60，葡萄糖0.5-60，淀粉0.5-30，湿润剂1004 0.5-30，分散剂NNO 0.5-20，CMC(羧甲基纤维素钠)0.02-10。
实施例3田间试验
近几年来，苹果斑点落叶病成为又一重大病害，有的造成7，8月份严重落叶，削弱树势，影响果品的产量和质量。本发明对短小芽孢杆菌菌株QZ-002H可湿性粉剂防治苹果斑点落叶病病菌效果作室内毒力测定。
1试验对象与来源
试验对象为苹果斑点落叶病由苹果轮斑病的强毒菌系所致，以菌丝体在被害叶和枝条上越冬。翌年春季产生分生孢子器，放出分生孢子。分生孢子随气流传播，侵染春梢嫩叶。于2013年7月自济南市历城区绣川艾家村“大国光”苹果分离苹果斑点落叶病菌，菌株代号为JL-02。调查得知，该果园常年杀菌剂以代森锰锌为主，其它农药品种有多抗霉素、退菌特等，近几年有使用多氧霉素的，其它杀菌剂很少使用。
1.2供试药剂
a.短小芽孢杆菌菌株QZ-002H可湿性粉剂(实施例2制备)；
b.0.3％多抗霉素可湿性粉剂(山东泰诺药业有限公司，提供)。
1.3试验处理
试验共设6个处理
(1)30亿/克短小芽孢杆菌菌株QZ-002H可湿性粉剂；
(2)40亿/克短小芽孢杆菌菌株QZ-002H可湿性粉剂；
(3)50亿/克短小芽孢杆菌菌株QZ-002H可湿性粉剂；
(4)60亿/克短小芽孢杆菌菌株QZ-002H可湿性粉剂；
(5)0.3％多抗霉素可湿性粉剂；
(6)空白对照(清水)。
2培养基(PDA)
去皮马铃薯200g煮沸10min，去渣滤液加入葡萄糖5g，琼脂17-20g，加水至1000mL，pH为6.5；使用前每100mL培养基加10000单位氯霉素5mL，防止细菌污染。
3生物测定
先将药剂进行灭菌处理，按不同的浓度梯度混在融化的培养基中，待培养基凝固后，在中央接一直径为6mm的待测新鲜菌苔JL-02的琼脂块，于72h测量菌落直径，每次均交叉测两次，然后取平均值，每处理重复4次。
4计算方法
对菌落直径垂直测量两次，取其平均值，然后计算不同浓度下药剂对病原菌的生长抑制率：
苹果斑点落叶病病原菌菌株BL-02的生长抑制率(％)＝(Do－Dx)/(Do-6)×100
Dx：药剂处理后的菌落直径平均值；
Do：空白对照菌落直径平均值。
5结果分析
短小芽孢菌株QZ-002H可湿性粉剂30亿/克、40亿/克、50亿/克和60亿/克对苹果斑点落叶病病原菌菌株JL-02的生长抑制率分别为80.3％、89.39％、95.45％和89.36％。与对照药剂0.3％多抗霉素可湿性粉剂(抑制率为83.33％)相比，40亿/克、50亿/克和60亿/克短小芽孢菌株QZ-002H可湿性粉剂与0.3％多抗霉素可湿性粉剂有显著差异。
表1短小芽孢菌株QZ-002H可湿性粉剂对苹果斑点落叶病室内生长抑制试验数据
6结论
短小芽孢杆菌菌株QZ-002H可湿性粉剂对苹果斑点落叶病病原菌菌株的生长抑制率较好，可以在生产中推广应用。建议使用量为短小芽孢杆菌菌株QZ-002H为40-50亿/克。
Claims (7)
1.短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株QZ-002H，所述菌株的保藏编号为CGMCCNo.11050。
2.权利要求1所述的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株QZ-002H在防治苹果斑点落叶病中的用途。
3.一种包括权利要求1所述的短小芽孢杆菌菌株QZ-002H的生物防治制剂。
4.权利要求3所述的生物防治制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)制备短小芽孢杆菌菌株QZ-002H的种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，28-30℃下恒温培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28-30℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养；
其中，步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶液的质量比为1：1.8；其中固料由质量比为60：40的玉米粉和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液的组分及含量为：3.5％磷酸二氢钾，0.04％硫酸镁，4％硫酸铵，剩余为水；
并且，步骤(3)中的大量发酵培养基同固体培养基。
5.如权利要求4所述的生物防治制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)将短小芽孢杆菌菌株QZ-002H的孢子移植到LB液体培养基中，28-30℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，28-30℃下振荡培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至发酵培养基，室温28-30℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9d。
6.权利要求3所述的生物防治制剂在防治苹果斑点落叶病中的用途。
7.一种用于防治苹果斑点落叶病的生物防治方法，其特征是，向具有苹果斑点落叶病的植物施用权利要求1所述的短小芽孢杆菌菌株QZ-002H或者权利要求3所述的生物防治制剂。
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