CN103173397A - 广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensNCPSJ7，还涉及该菌株在植物病害防治、果蔬采前采后病害的防治，以及食源性致病菌和腐败菌的预防中的应用。该菌种于2013年3月22日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCCNO：M2013098，命名为Bacillusamyloliquefaciens NCPSJ7。本发明菌株的菌体及发酵液具有拮抗桃根霉腐烂病、黄瓜枯萎病、番茄灰霉病、枣炭疽病、梨黑斑病、梨青霉病、苹果褐腐病、苹果斑点落叶病、西瓜枯萎病等植物病原真菌引起的植物病害及果蔬采后病害以及拮抗金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌、酵母等食源性致病菌和腐败菌的作用，广谱抗菌并且效果稳定持久，具有从中开发出新型、高效、天然的生物防治及生物防腐保鲜制剂的巨大潜力。

Description

广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NCPSJ7，还涉及该菌株在植物病害防治、果蔬采前采后病害的防治，以及食源性致病菌和腐败菌的预防中的应用。 

背景技术

植物病害、果蔬采前采后病害以及食源性致病菌和腐败菌引起食源性疾病是全球性的问题，造成了巨大的经济损失和身体伤害。联合国粮农组织（FAO）的统计数据表明，植物病害平均每年引起的减产损失约为总产量的10%-15%，其中由真菌引起的植物病害约占80%。同时，食源性疾病也严重影响人类健康，甚至出现群体性的食源性中毒事件。目前主要使用化学杀菌剂和防腐剂来控制植物采前采后病害以及食源性致病菌腐败菌，虽然化学杀菌剂或防腐剂能有效地减免植物病害、预防食源性疾病，但化学杀菌剂和防腐剂亦造成负面影响。化学药剂的残留威胁着人畜的健康，危害着环境。因此研究开发可替代化学杀菌剂和化学防腐剂的新方法来控制植物病害和食源性腐败菌和致病菌是目前研究的一个重要方面。 

随着人们环保意识的不断增强以及高新技术在农业及农产品流通领域中的应用，利用有益生物来控制植物病害，预防食源性疾病越来越得到广泛重视。我国对生物防治的研究始于50年代初期，科研工作者筛选出的有效菌株，大多将其拮抗代谢产物应用于生产实践。截至目前为止，国外已对部分抑菌物质完成实验室研究并已研发出生物制剂投入到实际生产应用当中，如我国目前允许添加到食品的乳酸链球菌素、纳他霉素等。由于生物防治高效、环保，且不会引起病原物抗药性等特点，因此研究者越来越重视利用生物防治和生物防腐这一高效方法来控制植物病害和进行农产品防腐保鲜，生物防治和生物防腐保鲜制剂的研制和开发具有广阔空间。 

芽孢杆菌是土壤微生物系统中的优势生物种群，能够产生耐热、耐旱、抗紫外、抗有机溶剂的孢子，因此可以作为理想的生防菌株。目前研究者已将部分优良的拮抗芽孢杆菌应用于植物病害的生物防治中，并取得显著的成效。因此研究开发安全的广谱拮抗芽孢杆菌具有广阔的应用空间。 

发明内容

本发明的目的是提供一种具有广谱抗菌活性的解淀粉芽孢杆菌及其应用，其菌体和发酵液具有较强的广谱抗植物病原真菌、食源性致病菌和腐败菌的预防中的应用。 

本发明涉及解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NCPSJ7应用于植物病害和果蔬采前采后病害的防治，以及食源性致病菌和腐败菌的预防，具体的说是一种具有拮抗桃根霉腐烂病、黄瓜枯萎病、番茄灰霉病、枣炭疽病、、梨黑斑病、梨青霉病、苹果褐腐病、苹果斑点落叶病、西瓜枯萎病等植物病原真菌和金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌、酵母等食源性致病菌和腐败菌的解淀粉芽孢杆菌。 

一种广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌，系从中国山东省莱芜市生姜大田中采集的土壤中分离得到，保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：武汉市武汉大学；保藏日期为2013年3月22日；保藏编号：CCTCC NO：M 2013098，该菌命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NCPSJ7。 

本发明的解淀粉芽孢杆菌培养条件简单，在大多数培养基上生长良好，于牛肉膏蛋白胨琼脂平板生长时为菌落直径0.5-1.0mm、圆形、凸起、边缘整齐、表面光滑有光泽、乳白色、不透明的酪样菌落。通过显微镜观察，该菌大小为（0.66-0.95）μm ×（2.34-2.89）μm，革兰氏阳性杆菌，单个或成对排列，有芽孢，芽孢中生，椭圆形。营养肉汤液体静置培养表面产生菌膜，液体澄清无浑浊无沉淀，为严格好氧菌，厌氧条件不能生长。发酵葡萄糖产酸，淀粉水解和接触酶阳性，能耐受2%和5%的盐，在氯化钠浓度7%和10%的培养基上不生长。 

通过16S rDNA同源性分析，以该菌株的基因组DNA为模版扩增其16S rDNA序列，PCR产物为单一条带，回收纯化后，进行DNA测序。该菌株的16S rDNA序列长度为1400bp，将该菌株的16S rDNA序列提交到GenBank数据库，获得序列号GenBank NO. KC790453。同时将该菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库收录的代表菌株的16S rDNA基因核苷酸序列进行同源性比对。结果与NC 016784.1等解淀粉芽孢杆菌的同源性高达99%。下表为与GenBank数据库中部分解淀粉芽孢杆菌16S rDNA的相似性比对结果： 

表1 与GenBank数据库中部分解淀粉芽孢杆菌16S rDNA的相似性比对结果

菌株Bacillus amyloliquefaciens NCPSJ7的应用中，所述菌体的发酵液其发酵条件为：于发酵培养基中按体积接种量2-5%接种解淀粉芽孢杆菌菌株，发酵培养基装液量为80-150mL/250mL三角瓶，离心转速120-200转/min，培养温度30-37℃，培养3-8天；

发酵培养基配方为：葡萄糖3-8份，酵母浸膏5-10份，蛋白胨5-10份，(NH₄)₂SO₄ 3-10份，NaCl 2-9份，水：900-1200份，pH5-8，以上所述的份数均为重量份数。

菌株Bacillus amyloliquefaciens NCPSJ7的发酵条件还可以为，于发酵培养基中按体积接种量3%接种菌株，发酵培养基装液量为100mL/250mL三角瓶，转速150转/min，培养温度34℃，培养5-6天。 

优选的，菌株Bacillus amyloliquefaciens NCPSJ7的应用中，所述菌体的发酵液其发酵条件为：于发酵培养基中按体积接种量4%接种解淀粉芽孢杆菌菌株，发酵培养基装液量为100mL/250mL三角瓶，离心转速150转/min，培养温度37℃，培养6天； 

发酵培养基配方为：葡萄糖5份，酵母浸膏7.5份，蛋白胨7.5份，(NH₄)₂SO₄ 5份，NaCl 5份，水：1000份，pH7.0，以上所述的份数均为重量份数。

本发明的解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7的菌体和发酵液抗菌活性：采用牛津杯法测定。本发明所述的解淀粉芽孢杆菌，其菌体和发酵液对供试的桃根霉腐烂病、黄瓜枯萎病、番茄灰霉病、枣炭疽病、、梨黑斑病、梨青霉病、苹果褐腐病、苹果斑点落叶病、西瓜枯萎病病原真菌和包括金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌、酵母在内的食源性致病菌和腐败菌具有很好的拮抗作用。 

本发明的解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7发酵液中抗菌物质的热稳定性良好，以-20℃、4℃、40℃、60℃、80℃、100℃与121℃处理30min，其抗菌物质的拮抗能力保留在80%以上。并且对胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶具有较好的稳定性。抗菌物质在pH 7-10范围内非常稳定，pH<6时，抗菌物质的抗菌性能随着pH的降低而降低。抗菌物质对SDS、EDTA、氯仿、乙腈等化学试剂比较稳定，但在尿素、乙酸乙酯中拮抗作用下降明显。 

本发明的解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7的菌体和发酵液均具有较强的广谱抗菌活性，且抗菌效果持久、稳定，具备从中开发出新型、高效、广谱生物防治及生物防腐保鲜制剂的巨大潜力。 

附图说明

图1 解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7的菌落形态； 

图2解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7的个体形态；

图3解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7发酵液（除菌）的抗菌结果，1：西瓜枯萎病菌；2：枣炭疽病菌；3：苹果斑点落叶病菌；4：梨黑斑病菌；5：梨青霉病菌；6：黄瓜枯萎病菌；7：苹果褐腐病菌；8：番茄灰霉病菌；9：桃根霉腐烂病菌；10：金黄色葡萄球菌；11：甲型副伤寒沙门氏菌；12：副溶血性弧菌；13：酵母菌；

图4 解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7的热稳定性分析图；

图5解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7的蛋白酶稳定性分析图；

图6 解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7的pH稳定性分析图；

图7 解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7的化学试剂稳定性分析图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作更进一步的说明，以便本领域内的技术人员了解本发明。 

     实施例1 

解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7的分离和鉴定

中国山东省莱芜市生姜种植地块土壤样品，在实验室按下列条件培养和鉴定，即可获得本发明的广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7：

菌株NCPSJ7的分离和纯化：将土壤样品采用梯度稀释法，于牛肉膏蛋白胨培养基上培养。挑取单菌落，采用分区划线法接种于牛肉膏蛋白胨培养基，37℃恒温培养1-2天，挑取单菌落保存。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7是依据其菌落形态和个体形态学特征、生理生化特征及16S rDNA基因序列的系统进化分析进行鉴定。该菌的16S rDNA基因序列长度为1400bp，具体序列如序列表1所示。 

该菌株的个体形态与菌落特征如下：于37℃培养1天的NCPSJ7菌体大小为(0.66-0.95)μm×(2.34-2.89)μm，革兰氏染色阳性，单个或成对排列，能形成芽孢且芽孢中生，椭圆形。在牛肉膏蛋白胨平板上的菌落呈现为直径0.5-1.0mm、圆形、凸起、边缘整齐、表面光滑且有光泽、乳白色、不透明、酪样。其形态特征如附图1和附图2所示。 

将解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7接入牛肉膏蛋白胨液体培养基静置培养，培养基表面产生菌膜，液体澄清无浑浊无沉淀。部分生理生化鉴定结果见下表： 

表2生理生化鉴定结果

实施例2

本发明所述的培养和发酵条件

（1）斜面培养条件：牛肉膏蛋白胨培养基：于水溶液中，按重量比加入牛肉膏0.3%，蛋白胨 1%，NaCl 0.5%，琼脂 2%，pH 7.0-7.2。121℃，0.1MPa蒸汽灭菌20分钟；培养温度37℃，培养时间2-4天。

（2） 种子培养条件：种子培养基：于水溶液中，按重量比加入葡萄糖 0.5%，酵母浸膏 0.75%，蛋白胨 0.75%，(NH₄)₂SO₄ 0.5%，NaCl 0.5%，pH 7.0。121℃，0.1MPa蒸汽灭菌20分钟；取新鲜菌种斜面一支，将菌种从斜面用接种环取一环，转接到装有种子培养基的摇瓶中，37℃摇床培养24小时。 

（3） 发酵培养条件：发酵培养基：于水溶液中，按重量比加入葡萄糖 0.5%，酵母浸膏 0.75%，蛋白胨 0.75%，(NH₄)₂SO₄ 0.5%，NaCl 0.5%，pH 7.0。121℃，0.1MPa蒸汽灭菌20分钟；将培养好的种子培养物以3%的接种量，接种于发酵培养基，发酵培养基装液量为100mL/250mL三角瓶，转速150转/min，培养温度34℃，培养6天，得到发酵液。 

本发明的解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7产生的发酵液经4500转离心10min，取沉淀即为具有抗菌活性的菌体，取上清液即为具有抗菌活性的发酵液。 

实施例3 

本发明的解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7产生的广谱抗菌性菌体和发酵液的抗菌活性分析

将指示菌的菌悬液涂布在合适的培养基上，其中桃根霉腐烂病、黄瓜枯萎病、番茄灰霉病、枣炭疽病、、梨黑斑病、梨青霉病、苹果褐腐病、苹果斑点落叶病、西瓜枯萎病病原真菌和酵母涂布在土豆培养基上，金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门氏菌涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上，副溶血性弧菌涂布在改良牛肉膏蛋白胨培养基上（氯化钠含量3%），放置牛津杯。

本发明的解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7产生的发酵液经4500转离心10min，取菌体复悬液或发酵上清液200uL滴加在牛津杯中，适宜温度培养(细菌在37 ℃培养，真菌在28 ℃培养)，观察抑菌圈的大小。下表为解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7对不同植物病原真菌和食品腐败菌、致病菌的抑菌效果： 

表 3  解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7的抑菌效果

附图3所示为解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7的发酵液（除菌）抗菌结果， 1：西瓜枯萎病菌；2：枣炭疽病菌；3：苹果斑点落叶病菌；4：梨黑斑病菌；5：梨青霉病菌；6：黄瓜枯萎病菌；7：苹果褐腐病菌；8：番茄灰霉病菌；9：桃根霉腐烂病菌；10：金黄色葡萄球菌；11：甲型副伤寒沙门氏菌；12：副溶血性弧菌；13：酵母菌，从附图中的结果可以看出，本发明的解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7对以上的病菌均有抵抗或抑制作用。

实施例4 

本发明的解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7产生的广谱抗菌物质的稳定性分析

热稳定性分析：将解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7的抑菌物质粗提液分别经-20℃、4℃、40℃、60℃、80℃、100℃与121℃处理30min，以室温条件下未做处理的抑菌物质粗提液作为对照组。以西瓜枯萎病菌作为病原指示菌，采用牛津杯法，28℃培养2-3天，以抑菌圈的大小作为抑菌性能的衡量指标。附图4为试验结果：以-20℃、4℃、40℃、60℃、80℃、100℃与121℃处理30min，其抗菌物质的拮抗能力保留在80%以上。

蛋白酶稳定性分析：于解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7的抑菌物质粗提液中分别添加胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶与蛋白酶K，使其终浓度均为1mg/mL。以不添加蛋白酶的抑菌物质粗提液为对照组，将实验组与对照组于37℃处理90min，100℃水浴10min使蛋白酶灭活。以西瓜枯萎病菌作为病原指示菌，采用牛津杯法，28℃培养2-3天，以抑菌圈的大小作为抑菌性能的衡量指标。附图5为试验结果：对胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶具有较好的稳定性。 

pH稳定性分析：测定解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7的抑菌物质粗提液的初始pH值，将其作为对照组。分别用1mol/mL的HCl与NaOH将解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7的抑菌物质粗提液调至pH 4、5、6、7、8、9、10，室温下放置3h，再将各组调回初始pH值。以西瓜枯萎病菌作为病原指示菌，采用牛津杯法，28℃培养2-3天，以抑菌圈的大小作为抑菌性能的衡量指标。附图6为试验结果：pH 7-10范围内非常稳定，pH<6时，抗菌物质的抗菌性能随着pH的降低而降低。 

化学试剂稳定性：在解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7的抑菌物质粗提液中分别添加1%的尿素、SDS、EDTA、氯仿、乙酸乙酯与乙腈，以未添加任何有机溶剂的抑菌物质粗提液作为对照组，37℃处理4h。以西瓜枯萎病菌为病原指示菌，采用牛津杯法，28℃培养2-3天，以抑菌圈的大小作为抑菌性能的衡量指标。附图7为试验结果：对SDS、EDTA、氯仿、乙腈等化学试剂比较稳定，但在尿素、乙酸乙酯中拮抗作用下降明显。 

  

Claims (7)

1.一种广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌，该菌种于2013年3月22日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 2013098，命名为Bacillus amyloliquefaciens  NCPSJ7。

2.如权利要求1所述的广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens  NCPSJ7，该菌株在大多数培养基上生长良好，于牛肉膏蛋白胨琼脂平板生长时为菌落直径0.5-1.0mm、圆形、凸起、边缘整齐、表面光滑有光泽、乳白色、不透明的酪样菌落；显微镜观察下，该菌大小为（0.66-0.95）μm ×（2.34-2.89）μm，革兰氏阳性杆菌，单个或成对排列，有芽孢，芽孢中生，椭圆形；营养肉汤液体静置培养表面产生菌膜，液体澄清无浑浊无沉淀，为严格好氧菌，厌氧条件不能生长；发酵葡萄糖产酸，淀粉水解和接触酶阳性，耐受2%和5%的盐，在氯化钠浓度7%和10%的培养基上不生长。

3.如权利要求1所述的广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens  NCPSJ7，其16S rDNA序列是序列表SEQNO.1的序列。

4.如权利要求1所述的广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens  NCPSJ7的应用，其特征在于：所述菌株Bacillus amyloliquefaciens NCPSJ7的菌体及菌体的发酵液对抗桃根霉腐烂病、黄瓜枯萎病、番茄灰霉病、枣炭疽病、梨黑斑病、梨青霉病、苹果褐腐病、苹果斑点落叶病、西瓜枯萎病等由植物病原真菌引起的植物病害和果蔬采前采后病害以及用于抑制金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌、酵母等食源性致病菌和腐败菌中的应用。

5.根据权利要求4所述的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens  NCPSJ7的应用，其特征在于，所述菌株Bacillus amyloliquefaciens NCPSJ7的应用中，所述菌体的发酵液其发酵条件为：于发酵培养基中按体积接种量2-5%接种解淀粉芽孢杆菌菌株，发酵培养基装液量为80-150mL/250mL三角瓶，离心转速120-200转/min，培养温度30-37℃，培养3-8天；

所述发酵培养基配方为：葡萄糖3-8份，酵母浸膏5-10份，蛋白胨5-10份，(NH₄)₂SO₄ 3-10份，NaCl 2-9份，水：900-1200份，pH5-8，以上所述的份数均为重量份数。

6.根据权利要求4所述的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens  NCPSJ7的应用，其特征在于：所述菌株Bacillus amyloliquefaciens NCPSJ7的发酵条件为，于发酵培养基中按体积接种量3%接种菌株，发酵培养基装液量为100mL/250mL三角瓶，转速150转/min，培养温度34℃，培养5-6天。

7.根据权利要求4所述的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens  NCPSJ7的应用，其特征在于，所述菌株Bacillus amyloliquefaciens NCPSJ7的应用中，所述菌体的发酵液其发酵条件为：于发酵培养基中按体积接种量4%接种解淀粉芽孢杆菌菌株，发酵培养基装液量为100mL/250mL三角瓶，离心转速150转/min，培养温度37℃，培养6天；

发酵培养基配方为：葡萄糖5份，酵母浸膏7.5份，蛋白胨7.5份，(NH₄)₂SO₄ 5份，NaCl 5份，水：1000份，pH7.0，以上所述的份数均为重量份数。

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