CN104430834A - 解淀粉芽孢杆菌菌株b014在果蔬采后保鲜中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了解淀粉芽孢杆菌菌株B014在果蔬采后保鲜中的应用，其包括以下步骤：按5.0％的体积比将菌株B014种子液接种到大量发酵培养基中，180rpm发酵培养；发酵完成后将发酵物离心、收集沉淀；将沉淀重悬后得到生物保鲜菌剂；将生物保鲜菌剂喷洒到采摘后的果蔬上，实现保鲜。本发明的生物保鲜运用了菌株B014产生ACC脱氨酶的特性，拓宽了微生物资源在生物保鲜剂开发中的应用，为克服化学保鲜剂品种少、具有潜在毒性的缺陷提供新途径。本发明方法的保鲜效果显著，可使采后果蔬在常温下的保鲜期延长1.5倍以上。

Description

解淀粉芽孢杆菌菌株B014在果蔬采后保鲜中的应用

技术领域

本发明属于食品保鲜领域，具体涉及解淀粉芽孢杆菌B014在果蔬采后保鲜中的应用。 

背景技术

在果蔬采后生理性衰腐中，乙烯扮演着重要角色，它诱导果实的后熟，加速果实软化进程，降低果蔬的储存时间。据美国农业部估计，果蔬采后损失约30％是乙烯作用所造成。因此，抑制内源乙烯的合成和阻止乙烯作用的研究已成为果蔬采后延衰保鲜技术研究的重要内容。 

基于乙烯调控的果蔬采后保鲜主要包括如下2条途径：1)物理方法，如低温、气调等；2)外源施用可阻止果蔬内源乙烯合成和阻止乙烯作用的化学药剂，如含银化合物硫代硫酸银、1-甲基环丙烯(1-MCP)等。尽管乙烯调控在果蔬采后保鲜中意义重大，但目前该类技术仍存在一些缺陷，如物理方法受设备场地的限制，化学合成的乙烯调控剂具有潜在的毒性和环境污染问题。此外，由于采后乙烯的合成是一个持续的过程，因而化学保鲜剂仍需辅以物理方法。 

实现果蔬采后“完全无害保鲜”是国际社会果蔬保鲜发展的必然趋势。有益微生物及其代谢产物具有来源广、易于培养、生产周期短、在植物内由于能增殖而能持续发挥作用等特点，在果蔬生物保鲜研究领域备受关注。 

尽管利用有益微生物对果蔬采后保鲜已有大量研究，但目前研究主要见于利用菌株的抗菌物质对果蔬采后病害的抑制。利用微生物调控果蔬采后生理以延缓其生理性衰腐相关研究极少。 

1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)是植物体内乙烯合成的前体。1-氨基-环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACC脱氨酶)能够将ACC分解为α-丁酮酸和氨,从而抑制乙烯合成，该酶目前在植物体内尚未发现。一些植物内生细菌能够分泌ACC脱氨酶，研究表明，苗期回接产ACC脱氨酶的细菌可提高植物抗旱、涝、盐、抗病和抗重金 属等能力。 

在果蔬采后保鲜方面，已有研究者尝试利用转ACC脱氨酶基因于农作物中以延长果蔬采后保鲜时间，该类技术现仅处于试验室研究阶段。 

ACC脱氨酶产生菌直接用于果蔬采后保鲜不仅可克服化学保鲜剂品种少、具有潜在毒性的缺陷，也可避免基因工程生物保鲜过程中标记抗生素在果蔬中的存在所带来的健康、环境不利影响，可为实现果蔬采后“完全无害保鲜”提供新的途径。目前ACC脱氨酶产生菌直接用于果蔬采后保鲜国内外尚无相关研究报导。 

发明内容

针对目前延缓果蔬采后自身生理性衰腐单纯依赖于物理方法或化学保鲜剂的缺陷，本发明利用解淀粉芽孢杆菌菌株B014能合成ACC脱氨酶的特性，将其应用到果蔬采后保鲜中，克服了现有技术的缺陷。 

解淀粉芽孢杆菌菌株B014能够在以ACC为唯一碳源的培养基中稳定传代，其菌体中ACC脱氨酶酶比活力高达32.8μmolα-丁酮酸量/g菌体·h。将菌株B014的发酵液喷洒到采后果蔬上，可降低供试果蔬中ACC含量及乙烯含量，且明显延长内源乙烯合成的峰值出现时间，提高了果蔬的保质期。 

本发明的目的通过下述技术方案实现： 

解淀粉芽孢杆菌菌株B014在果蔬采后保鲜中的应用； 

具体地，包括以下步骤： 

(1)制备生物保鲜菌剂：将解淀粉芽孢杆菌菌株B014接种于LB液体培养基中，30℃摇床振荡培养18h，得到种子液；按5.0％的体积比将菌株B014种子液接种到大量发酵培养基中，180rpm发酵培养；发酵完成后将发酵物5000×g离心30min，收集沉淀；将沉淀用无菌水重悬并用无菌水稀释～10000倍，即得到生物保鲜菌剂； 

所述的大量发酵培养基组成为黄豆粉2％(W/V)、麦麸2％(W/V)、玉米粉1％(W/V)、葡萄糖0.2％(W/V)、磷酸二氢钾0.1％(W/V)、氯化钙0.1％(W/V)、硫酸镁0.05％(W/V)，余量为水，初始pH值7.2； 

所述的发酵培养，培养温度为30±2℃，培养时间为30±5h； 

(2)将生物保鲜菌剂喷洒到采摘后的果蔬上，喷施量以果蔬表面完全湿润即可，实现保鲜； 

采摘后果蔬的后熟是由乙烯诱导的，这已是公知常识；本发明的菌株B014能够合成ACC脱氨酶，那么其自然可以应用于所有果蔬的采后保鲜，不因本发明实施例个数的限制而缩小了适用果蔬的范围；本发明实施例重点证明了用解淀粉芽孢杆菌B014制成的生物保鲜菌剂处理香蕉、青椒、荔枝等果蔬后，可使其在常温下的保鲜期明显延长。 

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果： 

1、本发明的生物保鲜运用了菌株B014产生ACC脱氨酶的特性，这是有益微生物应用于生物保鲜领域的一种新机理，本发明可拓宽微生物资源在生物保鲜剂开发中的应用，为克服化学保鲜剂品种少、具有潜在毒性的缺陷提供新途径。将产生ACC脱氨酶的菌株直接用于果蔬保鲜也可避免基因工程生物保鲜过程中标记抗生素在果蔬中的存在所带来的健康、环境不利影响。 

2、本发明方法的保鲜效果显著，可使采后果蔬在常温下的保鲜期延长1.5倍以上。 

3、解淀粉芽孢杆菌是一种公认的非致病菌，已被农业部批准为饲料添加剂允许使用的益生菌。因此，由解淀粉芽孢杆菌所研发的生物保鲜产品具有生物安全性，其制备简单，不含有毒、有害添加，使用具有无毒、无污染、无残留的优点，符合我国生产绿色食品的要求。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 

实施例1 

解淀粉芽孢杆菌B014ACC脱氨酶分泌能力的测定 

解淀粉芽孢杆菌菌株B014是本申请发明人从植物中分离的一株植物内生细菌，于2014年12月10日在中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)进行了保藏，保藏地址为：湖北武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC  NO：M 2014640，分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens  B014。 

此外，发明人在先发表的文章(Li Shu-Bin,Fang Mao,Zhou Ren-Chao,et al.Characterization and evaluation of the endophyte Bacillus B014as a potential biocontrol agent for the control of Xanthomonas axonopodis pv.dieffenbachiae-Induced blight of Anthurium[J].Biological Control 63(2012):9-16.)也已经公开了该菌株，但是该文章并未涉及该菌株有ACC脱氨酶能力的记载。 

配制无氮培养基(DF培养基，其每L含：磷酸二氢钾4g，磷酸氢二钠6g，七水硫酸镁0.2g，葡萄糖2g，柠檬酸2g，葡萄糖酸钠2g，琼脂20g，余量为水，pH值为7.2)，121℃灭菌20min后，向培养基中添加过滤除菌后的ACC，使其终浓度为3mmol/L，倒入灭菌的平皿中，制成以ACC为唯一碳源的平板，将菌株B014点接于该平板上，30℃培养，待长出菌苔后，在同样的平板上连续传代3次以上仍能生长，证明该菌株为ACC脱氨酶产生阳性菌株。 

把菌株B014接种到DF液体培养基中，30℃，180rpm培养30h后，离心收集菌体，菌体于含有ACC(终浓度为3mmol/L)的DF液体培养基中30℃诱导培养30h，离心收集菌体，用灭菌的Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)洗涤菌体2次，记录菌体重量。收集的菌体转入到灭菌研钵，加入1mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值8.5)，液氮条件下研磨，上清即为粗酶液，取粗酶液200μL加入20μL底物ACC(0.5mol/L)，混匀，置于30℃水浴反应15min，加入1mL0.56mol/L HCl终止反应，12000rpm离心5min，取上清测定产物α-丁酮酸的形成量，其方法为取上清1mL，加入800μL 0.56mol/L HCl和300μL 0.2％2,4-二硝基苯肼溶液(2mol/L HCl)中，30℃保温30min后，加入2mL 2mol/L NaOH混匀，测定540nm处吸光值，制备同样条件下α-丁酮酸标准曲线，从其求得α-丁酮酸的形成量。 

通过上述步骤得到菌体1.168g，用所得的菌体制成1mL粗酶液，取0.2mL反应0.25h后，测得580nm光吸收值为0.967，从α-丁酮酸标准曲线【y＝0.694x+0.006，其中，y为光吸收值,x为所用α-丁酮酸量(μmol)】求得该反应体系α-丁酮酸量生成量，通过与总酶体积、反应时间以及菌体量的换算，解淀粉芽孢杆菌菌体ACC脱氨酶比活为32.8μmolα-丁酮酸量/g菌体·h。据报道，当ACC脱氨酶酶活不低于20μmolα-丁酮酸/(g·h)时,就可以促进植物在逆境胁迫下的 生长。由此可见，菌株B014具有高的ACC脱氨酶产生能力。 

实施例2 

菌株B014施于果蔬后果蔬中ACC和乙烯含量的测定 

将解淀粉芽孢杆菌B014接种于LB液体培养基中，30℃摇床振荡培养30h，得到发酵物，然后将发酵物5000×g离心30min，收集沉淀，将沉淀用与原发酵培养基体积相当的无菌水重悬，得到解淀粉芽孢杆菌B014菌悬液。 

供试果蔬：香蕉，成熟、无机械伤口，采收后无保鲜处理、外观整齐、大小均一、无病斑。 

将上述制备的解淀粉芽孢杆菌B014菌悬液充分摇匀后，均匀喷洒到待处理香蕉果，喷施量以香蕉表面完全湿润为宜，将果品装入普通的保鲜袋中，于25-30℃洁净处储存。从处理后的0天开始，每2天测定处理供试果蔬中乙烯含量和ACC含量，结果如表1： 

乙烯含量的测定方法为：取2g果肉置青霉素小瓶中,密封，每隔0.5h测定一次乙烯释放量,连续测定3h,每个样品设置3次重复。从青霉素小瓶中抽取100μL气体,用岛津GC-7AG气相色谱仪分析。 

ACC含量的测定方法为：取2g果肉加入80％乙醇10mL，匀浆后于4000rpm离心20min，上清液经55℃真空浓缩后加入1mL氯仿和5mL蒸馏水，振荡，再浓缩，然后用蒸馏水溶解，成为ACC待测液。取0.5mL ACC待测液于标定体积的三角瓶中,加入0.1mL 25nM HgCl₂溶液和0.1mL蒸馏水，用橡皮塞密封,用注射器注入0.5mL 5％NaOH与饱和NaOCl溶液的混合液(v/v),于冰浴下振荡10min,取1mL气样测定乙烯,根据乙烯释放量换算成ACC含量。 

表1 

经解淀粉芽孢杆菌B014处理的香蕉在储藏中ACC和乙烯含量明显低于同样 储存条件下的对照组香蕉，与对照组相比，其ACC和乙烯含量峰值分别降低了83.7％、79.1％，且峰值出现的时间分别延长了4～6天，说明解淀粉芽孢杆菌B014能通过分解供试材料中乙烯合成直接前体ACC，从而减少果实中乙烯的合成量。 

实施例3 

用解淀粉芽孢杆菌B014制备生物保鲜菌剂 

将解淀粉芽孢杆菌菌株B014接种于LB液体培养基中，30℃摇床振荡培养18h，得到种子液；按5.0％的体积比将培养好的种子液接种到大量发酵培养基，180rpm发酵培养，发酵完成后将发酵物5000×g离心30min，收集沉淀，将沉淀用无菌水重悬并用无菌水稀释～10000倍，即得到生物保鲜菌剂，即为生物保鲜菌剂，其中所述的大量发酵培养基组成为黄豆粉2％(W/V)、麦麸2％(W/V)、玉米粉1％(W/V)、葡萄糖0.2％(W/V)、磷酸二氢钾0.1％(W/V)、氯化钙0.1％(W/V)、硫酸镁0.05％(W/V)，余量为水，初始pH值7.2；发酵培养温度为30℃，培养时间为30h。 

实施例4 

生物保鲜菌剂对香蕉的采后保鲜效果 

从栽培地采收成熟、无机械伤口、采收后无保鲜处理、大小均一、无病斑的香蕉，将实施例3制备的生物保鲜菌剂充分摇匀后，均匀喷洒到待处理水果表面，喷施量以表面完全湿润为宜，处理后将果品装入普通的保鲜袋中，同时设置喷同样体积的灭菌水作为对照组，处理组与对照组于同样条件下(25-30℃)储存，定期观察果品的新鲜度，按照下列标准对其进行新鲜度分级，计算不同时间点的保鲜率(所有果品的新鲜度平均值/最高新鲜度级数)，结果如表2： 

香蕉新鲜度分级标准：0级：严重腐烂；1级：严重塌腐，甚至拿不起来；2级：开始腐熟(果皮黄色面积>50％)，用手就能捏得动，果皮皱缩；3级：局部转黄变软，果实手感硬；4级：局部转黄(果皮黄色面积<50％)，颜色不均匀；5级：基本正常，果皮稍黄(黄色面积<10％)；6级：果实青绿，质地硬，无病斑，果肉切口白净。 

表2 

经处理的香蕉在25-30℃下储存，第16天内其新鲜度平均等级仍接近于最高新鲜度级数，即16天内保鲜率达到95％以上，而未处理的香蕉在同样的储存条件下，第4天后其保鲜率即降到90％以下，说明处理的香蕉其保鲜时间延长了3倍以上。 

实施例5 

生物保鲜菌剂对青椒的采后保鲜效果 

从栽培地采收成熟、无机械伤口、采收后无保鲜处理、外观整齐、大小均一、无病斑的青椒，将实施例3制备的生物保鲜剂充分摇匀后，均匀喷洒到待处理青椒表面，喷施量以表面完全湿润为宜，处理后装入普通的保鲜袋中，同时设置喷同样体积的灭菌水作为对照组，处理组与对照组于同样的条件下(25-30℃)储存，定期观察供试材料的新鲜度，按照下列标准对其进行新鲜度分级，计算不同时间点的保鲜率(所有果品的新鲜度平均值/最高新鲜度级数)，结果如表3： 

青椒新鲜度分级标准：0级：严重腐烂；1级：果实严重失水，转红(失水率≥80％，转红面积≥80％)；2级：果实失水，转红(失水率50-80％或/和转红面积50-80％)；3级：果实失水，干枯，转红(失水率30-50％或/和转红面积30-50％)；4级：果实失水(失水率10-20％)，果尖转红；5级：果实有轻度失水和皱缩(面积低于10％)，局部褪绿(面积<10％)；6级：整果新鲜如初，饱满圆润、无失 水皱缩及褪绿，无霉斑。 

表3 

经处理的青椒在25-30℃下储存，第20天其新鲜度平均等级仍接近于最高新鲜度级数，即20天内保鲜率达到95％以上，而未处理的青椒在同样的储存条件下，第8天后其保鲜率即降到71.8％，说明处理的青椒其保鲜时间延长了1.5倍以上。 

实施例6 

生物保鲜剂对荔枝的采后保鲜效果 

从栽培地采收成熟、无机械伤口、采收后无保鲜处理、外观整齐、大小均一、无病斑的荔枝，将实施例3制备的生物保鲜剂充分摇匀后，均匀喷洒到待处理荔枝表面，喷施量以表面完全湿润为宜，处理后装入普通的保鲜袋中，同时设置喷同样体积的灭菌水作为对照组，处理组与对照组于同样的条件下(25-30℃)储存，定期观察供试材料的新鲜度，按照下列标准对其进行新鲜度分级，计算不同时间点的保鲜率(所有果品的新鲜度平均值/最高新鲜度级数)，结果如表4： 

荔枝新鲜度分级标准：0级：严重腐烂；1级：果实严重失水，变黑(失水率≥80％或/和褐化面积≥80％)；2级：果实失水率50-80％或/和褐化面积50-80％；3级：失水率30-50％或/和褐化面积30-50％)；4级：果实失水率10-20％或/和褐化面积10-20％果实失水；5级：果实有轻度失水(面积低于10％)，局部褐化(面积<10％)；6级：整果新鲜如初，饱满圆润、无失水皱缩及褐化，果肉洁白。 

表4 

经处理的荔枝在25-30℃下储存，第12天其新鲜度平均等级仍接近于最高新鲜度级数，12天内其保鲜率达到95％以上，而未处理的荔枝在同样的储存条件下，第4天后其保鲜率即降到71.8％，说明处理的荔枝其保鲜时间延长了2倍以上。 

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (3)

1.解淀粉芽孢杆菌菌株B014在果蔬采后保鲜中的应用。

2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株B014在果蔬采后保鲜中的应用，其特征在于包括以下步骤：

(1)制备生物保鲜菌剂：将解淀粉芽孢杆菌菌株B014接种于LB液体培养基中，30℃摇床振荡培养18h，得到种子液；按5.0％的体积比将培养好的种子液接种到大量发酵培养基，180rpm发酵培养，发酵完成后将发酵物5000×g离心30min，收集沉淀，将沉淀用无菌水重悬并用无菌水稀释～10000倍，即得到生物保鲜菌剂，即为生物保鲜菌剂；

其中所述的大量发酵培养基组成为黄豆粉2％(W/V)、麦麸2％(W/V)、玉米粉1％(W/V)、葡萄糖0.2％(W/V)、磷酸二氢钾0.1％(W/V)、氯化钙0.1％(W/V)、硫酸镁0.05％(W/V)，余量为水，初始pH值7.2；

(2)将生物保鲜菌剂喷洒到采摘后的果蔬上，喷施量以果蔬表面完全湿润即可，实现保鲜。

3.根据权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌菌株B014在果蔬采后保鲜中的应用，其特征在于：所述的发酵培养，培养温度为30±2℃，培养时间为30±5h。