CN103621621A - 一种复配生物防腐保鲜剂及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复配生物防腐保鲜剂，其组分及含量为：每1L组分A中添加0.1~5g组分B，组分A为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarum）BGP20菌株的发酵液，组分B为纳他霉素。该复配生物防腐保鲜剂用于防控贮藏期果蔬病害，特别能用于同时防治贮藏期果蔬细菌性软腐病和各类霉菌病害（例如疫霉病、根霉软腐病、腐霉病等），可以避免或降低化学农药及农用抗生素残留，维持贮藏期果蔬品质，具有良好的经济和社会效益。

Description

一种复配生物防腐保鲜剂及其使用方法

技术领域

本发明属于农产品贮藏保鲜技术领域，具体地，涉及一种由解淀粉芽孢杆菌BGP20和纳他霉素组成的复合生物防腐保鲜剂及其用途，专用于贮藏期果蔬细菌性软腐病和霉菌病害的无公害生物防治。

背景技术

病原微生物的侵染是导致采后果蔬腐败变质的主要原因，在发展中国家，其引起的损失一般占果蔬产量的20%~25%，严重时高达50%以上。各种弱寄生或附生的霉菌，例如根霉（Rhizopus sp.）、青霉（Penicillium sp.）、腐霉（Pythium sp.）、疫霉（Phytophthorasp.）等，是引起采后果蔬腐败的主要病原真菌。胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwiniacarotovora）引起的细菌性软腐是造成贮藏期果蔬腐败变质的另一个主要原因，其对十字花科蔬菜、茄科果蔬、瓜类、芋头等的危害尤为严重。在对十字花科蔬菜、茄科果蔬、瓜类、芋头等的贮藏过程中，通常是细菌性软腐病和霉菌病害混合发生，相互促进，从而导致果蔬迅速腐烂变质，危害消费者身体健康，使其丧失食用功能及商品价值。

目前，采后果蔬病害的防治主要依靠化学杀菌剂和农用抗生素。化学农药和抗生素对环境条件没有严格要求，短期内可以快速杀死病原菌，见效快，效率高，成本低，例如多菌灵、甲基硫菌灵、抑霉唑、代森铵、呋喃西林、农用链霉素等。但是，化学农药和抗生素在贮藏果蔬上应用面临以下三个问题：首先，采后果蔬杀菌剂的应用标准较高，可以应用的杀菌剂种类和使用剂量受到严格限制，一些登记于大田的农药在采后果蔬上泛滥使用，农药和有机化合物的残留严重超标；另外，采后病原菌的抗药性日益增强，开发符合当前市场标准的新型高效杀菌剂成本高昂，可供选择的替代杀菌剂种类不多；最后，随着环境和食品安全意识的日益增强，人们认为化学杀菌剂和抗生素伤害人类健康，威胁环境安全，这种负面认识促使政府出台更加严厉的农药使用标准，并通过该途径来设定国际贸易壁垒，保护本国的果蔬产业。

基于微生物的生物防控技术被认为是未来控制采后果蔬病害的主要发展方向之一，例如芽孢杆菌、酵母等。但是，一般一种拮抗菌的抗菌谱比较单一，对采后果蔬病害的防治效果一般，与化学杀菌剂相比具有一定差距，如何实现基于微生物的生物防控，且又不会伤害人类健康，威胁环境安全，是目前生物防控技术中面临的普遍问题。

发明内容

针对现有技术的主要问题，本发明的目的之一在于提供一种能够用于防治采后果蔬病害的复配生物防腐保鲜剂，该复配生物防腐保鲜剂特别能用于同时防治贮藏期果蔬细菌性软腐病和霉菌病害，例如疫霉病、根霉软腐病、腐霉病等，同时不会对人类健康和环境安全造成不良影响。

为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：一种复配生物防腐保鲜剂，其特征在于，包含解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum）BGP20和纳他霉素（Natamycin），所述解淀粉芽孢杆菌BGP20，是本研究室从菜园土壤中分离获得，该菌株已于2013年9月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），菌种保藏编号为CGMCC No.8288，分类命名为：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

进一步地，所述复配生物防腐保鲜剂的配比为：每1L解淀粉芽孢杆菌BGP20菌株的发酵液（菌体密度约为10⁹ cfu/mL）中含有0.1~5 g的纳他霉素。

本发明所述的复配生物防腐保鲜剂活菌数高，芽孢存活率高，兼容性好，剂型稳定，安全性高，对采后果蔬细菌性软腐病、疫霉病、根霉软腐病等均具有较高的生防效果。

本申请的发明人经过试验研究表明，纳他霉素能够显著提高解淀粉芽孢杆菌BGP20对细菌性软腐病的生防效果，增强解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液的稳定性，扩大其防病谱。纳他霉素与解淀粉芽孢杆菌BGP20混合使用，对疫霉病和根霉软腐病的防治具有明显增效作用。且纳他霉素是一种由链霉菌发酵产生的天然抗真菌化合物，属于多烯大环内酯类，不能被人体肠胃吸收，解淀粉芽孢杆菌BGP20和纳他霉素混合施用，扩大防病谱，提高对采后果蔬病害的综合控制效果的同时，也保证了人类健康和环境安全。

本发明目的之二在于提供一种所述的复配生物防腐保鲜剂的制备方法：包括解淀粉芽孢杆菌BGP20菌株发酵液的制备及纳他霉素的添加，具体工艺方法如下：

A.菌种培养

1）活化培养：取解淀粉芽孢杆菌BGP20甘油保存菌种，划线接种至新鲜2YT固体平板上，在25~32℃条件下活化培养24~36 h;

2）种子液制备：利用灭菌牙签 挑取一个单菌落接种到一个含有50 mL 2YT液体培养基的250 mL锥形瓶中，25~32℃下振荡培养36~48 h，振荡频率为100~200 r/min。

B.发酵液的制备

将上述步骤2）所得的种子液以1%~5%（v/v）的比列接种于发酵培养基中进行发酵，发酵温度为25~32℃，以通气比0.2:1到2.5:1之间进行发酵通气，搅拌速度为75~180 r/min，发酵时间为36~48 h。其中通气比：指每分钟通过发酵液的空气体积与发酵液体积之比。镜检芽孢的形成情况，当大部分菌体转化成芽孢后，终止发酵。

C.纳他霉素的添加

发酵终止后，添加纳他霉素，使其终浓度为0.1~5 g/L，充分搅拌，使纳他霉素与发酵液均匀混合。然后无菌灌装，室温保存。

进一步地，所述2YT固体培养基，其成分为：胰蛋白胨 17 g，酵母浸膏10 g，NaCl 5 g，琼脂 15 g，蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0，121℃条件下灭菌20 min。

进一步地，所述发酵培养基，其配比为：豆粕16.03 g/L、玉米淀粉6.30 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.75 g/L、NaCl 1.25 g/L、KH₂PO₄ 0.75 g/L、微量元素15 mL/L，蒸馏水定容至1000 mL，pH 6.8~7.5，121℃条件下灭菌20 min。所述微量元素为FeSO₄·7H₂O 0.16 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 0.16 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.16 mg/L，MnSO₄ 5 mg/L。

本发明目的之三在于提供了上述复配生物防腐保鲜剂在防治贮藏期果蔬细菌性软腐病及霉菌病害中的应用方法：将复配生物防腐保鲜剂稀释1~5倍，在果蔬采收前均匀喷洒，晾干后采收贮藏；或将复配生物防腐保鲜剂稀释1~5倍，利用喷洒或浸泡的方式处理采后果蔬，晾干后按照果蔬的常规贮藏方法进行保存。

本发明提供的复配生物防腐保鲜剂是一种全新的复配生物防腐保鲜剂，具有高效、广谱的抗菌防病效果，尤其对细菌性软腐病和多种霉菌病害的联合防控。该复配生物防腐保鲜剂制备工艺简单，成本低廉，便于贮存、施用方便。具有减少果蔬在贮藏、运输及销售过程中的腐烂、发霉，维持果蔬品质，并且安全、高效、无农药残留等特点。

附图说明

图1：本发明复配生物防腐保鲜剂的制备工艺流程图。

图2：纳他霉素对解淀粉芽孢杆菌BGP20生长的影响。

图3：纳他霉素对BGP20芽孢萌发率的影响。

图4：纳他霉素对BGP20生防菌剂稳定性的影响。

图5：纳他霉素对BGP20生防菌剂中芽孢存活的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。

本发明所涉及的解淀粉芽孢杆菌BGP20是通过平板拮抗筛选试验从菜园土壤中分离获得，已于2013年9月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC No. 8288。本发明所用的胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwiniacarotovora）是本研究室从贮藏期发病大白菜上分离、鉴定获得；芋疫霉病原菌（Phytophthora colocasiae）是本研究室从贮藏期发病芋头上分离、鉴定获得；匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）是本研究室从贮藏期发病樱桃番茄上分离、鉴定获得。其他单位或个人可以向本研究室索取以上三种病原菌。

以下实施例用于说明本发明，但并不限定于本发明。本领域的技术人员从本发明公开的内容直接或间接导出的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。若无特别说明，下述实施例中所用技术方法均为常规方法；若无特别说明，下述实施例中所用实验材料，均为常规化学试剂。

以下所述的2YT培养基为：胰蛋白胨 17 g，酵母浸膏10 g，NaCl 5 g，琼脂 15 g，蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0，121℃条件下灭菌20 min。

发酵培养基：豆粕16.03 g/L、玉米淀粉6.30 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.75 g/L、NaCl 1.25 g/L、KH₂PO₄ 0.75 g/L、微量元素 15 mL/L，蒸馏水定容至1000 mL，pH 6.8~7.5，121℃条件下灭菌20 min。所述微量元素为FeSO₄·7H₂O 0.16 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 0.16 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.16 mg/L，MnSO₄ 5 mg/L。

实施例1、纳他霉素对解淀粉芽孢杆菌BGP20生长的影响

1）种子液的准备：取解淀粉芽孢杆菌BGP20的甘油保存菌种，划线接种至2YT固体平板上，在30℃条件下活化培养36 h，利用灭菌牙签挑取单菌落于含有25 mL 2YT液体培养基的100 mL锥形瓶中，在振荡频率为150 r/min、30℃条件下培养36 h，作为种子液。

2）含纳他霉素2YT液体培养基的配置：利用灭菌水配置含5%纳他霉素的混合液，作为母液，85℃条件下灭菌20 min。将灭菌的纳他霉素母液添加到含有25 mL 灭菌的2YT液体培养基的100 mL锥形瓶中，纳他霉素的终浓度分别为0.05%（m/v）、0.1%（m/v）、0.5%（m/v）。

3）生长测定：将种子菌液分别以1%（v/v）比例接种到不同纳他霉素浓度的2YT培养基中，以不含纳他霉素的2YT培养基为对照，每个处理3个重复。将接种好的培养基在30℃、150 r/min条件下培养36 h。然后，将培养液梯度稀释涂布2YT平板，在30℃条件下培养24~36 h，统计单菌落数量。

4）结果分析：如图2所示，结果发现，纳他霉素对解淀粉芽孢杆菌BGP20的生长没有明显影响，即使其浓度高达0.5%（m/v）。

实施例2、纳他霉素对BGP20芽孢萌发率的影响

以1%（v/v）的比例转接BGP20种子菌液到2YT培养基中，在30℃、150 r/min条件培养72 h。向液态的2YT琼脂培养基中添加纳他霉素，纳他霉素的终浓度分别为0.1%（m/L）、0.5%（m/L）和1.0%（m/L），倒平板备用。将发酵菌液在80℃条件水浴20 min，利用灭菌蒸馏水梯度稀释，涂布在含不同浓度纳他霉素的2YT平板上。不含纳他霉素的2YT琼脂平板为对照。然后在30℃条件下倒置培养24 h，调查每个平板菌落数。每个浓度梯度涂布3个平板，相同的实验进行了两次。

如图3所示，从结果可知，纳他霉素对BGP20芽孢的萌发率没有影响，即使纳他霉素的浓度高达1.0%。

实施例3、纳他霉素对BGP20发酵液生防菌剂稳定性的影响

以1%（v/v）的比例转接BGP20种子菌液到发酵培养基中，在30℃、150 r/min条件培养72 h。向BGP20发酵培养液中添加纳他霉素，使其终浓度分别为0.1%（m/v）、0.5%（m/v），不加纳他霉素的BGP20发酵液为对照。将各处理菌液放置在室温保存，分别于处理后0 d、30 d、60 d调查各处理培养菌液的活菌体数，利用梯度稀释平板涂布的方法进行菌落计数。另外，每个处理菌液分装3个灭菌试管，每个试管分装10 mL菌液，室温静置，连续观察菌体沉降，并于第60 d拍照记录。

    BGP20的发酵菌液在室温条件下静置60 d仍然表现出较好的稳定性，没有沉淀或分层现象，如图4所示。分别向BGP20发酵结束的菌液中添加0.1%和0.5%的纳他霉素，发酵液的稳定性没有受到影响，与对照相比，在外观上没有差异，如图4所示。另外，随着贮藏时间的增加，各处理的活性芽孢数量没有显著下降（P > 0.05），如图5所示。以上结果表明，纳他霉素与BGP20生防菌液具有很好的兼容性。

实施列4、纳他霉素对解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液对胡萝卜软腐欧文氏的拮抗活性的提高

将解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液原液或稀释液与不同质量比例的纳他霉素混合，采用平板抑菌圈法测定不同配比药剂对胡萝卜软腐欧文氏菌的拮抗活性。

平板拮抗实验发现，纳他霉素在含有胡萝卜软腐欧文氏菌的2YT平板没有产生明显的拮抗圈，但是，添加纳他霉素能够显著提高解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液对胡萝卜软腐欧文氏的拮抗活性，如表1所示。

表1、纳他霉素和解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液对胡萝卜软腐欧文氏菌的平板拮抗测定

药剂	拮抗圈直径（mm）
		BGP20发酵液稀释1倍	13.41±0.27 c
BGP20发酵液稀释5倍	12.34±0.21 d
		0.05%纳他霉素	0 f
0.5%纳他霉素	0 f
		BGP20发酵液稀释1倍＋0.05%纳他霉素	14.84±0.22 a
BGP20发酵液稀释1倍＋0.1%纳他霉素	15.14±0.31 a
		BGP20发酵液稀释1倍＋0.5%纳他霉素	15.09±0.24 a
BGP20发酵液稀释5倍＋0.05%纳他霉素	14.07±0.19 b
		BGP20发酵液稀释5倍＋0.1%纳他霉素	14.29±0.33 b
BGP20发酵液稀释5倍＋0.5%纳他霉素	14.44±0.23 b

注：BGP20发酵液菌体密度在10⁹ cfu/mL左右，纳他霉素的含量为质量/体积比。

实施例5、毒力测定和增效系数测定：

毒力测定和增效系数测定是将解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液原液或稀释液与不同质量比例的纳他霉素混合，其中解淀粉芽孢杆菌BGP20的量以每克含有10¹⁰个芽孢的数量计算。采用平板菌丝生长抑制法测定不同配比药剂对匍枝根霉菌丝的抑制作用，然后计算EC₅₀值和增效系数（SR），如表2所示，本发明所述的配比，增效系数（SR）均≥1.5。

表2、防治匍枝根霉病菌的配方筛选

注：解淀粉芽孢杆菌BGP20的量以每克含有10¹⁰个芽孢的数量计算，括号内比值为两种组分的质量比。

实施例6、毒力测定和增效系数测定：

毒力测定和增效系数测定是将解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液原液或稀释液与不同质量比例的纳他霉素混合，其中解淀粉芽孢杆菌BGP20的量以每克含有10¹⁰个芽孢的数量计算。采用平板菌丝生长抑制法测定不同配比药剂对芋疫霉病菌菌丝的抑制作用，然后计算EC₅₀值和增效系数（SR），如表3所示，本发明所述的配比，增效系数（SR）均≥1.5。

表3、防治芋疫霉病菌的配方筛选

注：解淀粉芽孢杆菌BGP20的量以每克含有10¹⁰个芽孢的数量计算，括号内比值为两种组分的质量比。

实施例7、所述的复配生物防腐保鲜剂的制备方法，如图1所示，包括以下步骤

A.菌种培养

1）活化培养：取解淀粉芽孢杆菌BGP20甘油保存菌种，划线接种至新鲜2YT固体平板上，在25~32℃条件下活化培养24~36 h;

2）种子液制备：利用灭菌牙签 挑取一个单菌落接种到一个含有50 mL 2YT液体培养基的250 mL锥形瓶中，25~32℃下振荡培养36~48 h，振荡频率为100~200 r/min；

B.发酵液的制备

将上述步骤2）所得的种子液以1%~5%（v/v）的比列接种于发酵培养基中进行发酵，发酵温度为25~32℃，以通气比0.2:1到2.5:1之间进行发酵通气，搅拌速度为75~180 r/min，发酵时间为36~48 h。其中通气比：指每分钟通过发酵液的空气体积与发酵液体积之比。镜检芽孢的形成情况，当大部分菌体转化成芽孢后，终止发酵。

C.纳他霉素的添加

发酵终止后，添加纳他霉素，使其终浓度为0.1~5 g/L，充分搅拌，使纳他霉素与发酵液均匀混合。然后无菌灌装，室温保存。

 

实施列8、纳他霉素与解淀粉芽孢杆菌BGP20复配对大白菜细菌性软腐病的生防效果

将BGP20种子菌液按照1%（v/v）的比例接种发酵培养基，在30℃、150 r/min条件培养36 h，将发酵液稀释5倍，备用。然后分别向BGP20发酵液（活芽孢浓度为10⁸ cfu/mL）中添加5%的纳他霉素母液，配制纳他霉素终浓度分别为0.01%（m/v）、0.05%（m/v）、0.25%（m/v）、0.5%（m/v）的BGP20发酵菌液，备用。将胡萝卜软腐欧文氏菌（Ecc）种子菌液按照1%（v/v）的比例接种2YT培养基，在30℃、150 r/min条件培养12 h，利用灭菌蒸馏水稀释50倍，备用。利用灭菌手术刀在鲜嫩大白菜叶片的外表面划长约3 cm，深约1 mm的伤口。共计8个处理：1）伤口仅接种50 μL灭菌水作为空白对照处理；2）伤口仅接种10 μL Ecc菌液的对照处理（CK）；3）接种BGP20发酵液50 μL，室温风干后接种10 μL Ecc菌液；4）接种含0.01%纳他霉素的BGP20发酵液50 μL，室温风干后接种10 μL Ecc菌液，5）接种含0.05%纳他霉素的BGP20发酵液50 μL，室温风干后接种10 μL Ecc菌液，6）接种含0.25%纳他霉素的BGP20发酵液50 μL，室温风干后接种10 μL Ecc菌液，7）接种含0.5%纳他霉素的BGP20发酵液50 μL，室温风干后接种10 μL Ecc菌液，8）利用含0.5%纳他霉素的发酵培养基50 μL处理伤口，室温风干后接种10 μL Ecc菌液。将处理好的大白菜叶片放置在塑料保鲜箱内，22℃条件下孵育。每天观察病斑的发展情况，孵育72 h后调查病斑面积。每个处理包含三个独立的重复，每个重复10个大白菜叶片。根据病斑面积计算防效。

防效＝100×（CK病斑面积－处理病斑面积）/CK病斑面积。

表4、纳他霉素与解淀粉芽孢杆菌BGP20复配对大白菜细菌性软腐病的生防效果

编号	处理	病斑面积（cm2）	防效（%）
				1）	清水对照	0.00 a	/
2）	Ecc (CK)	19.67 d	/
				3）	BGP20+Ecc	5.11 c	74.02 b
4）	0.01%纳他霉素+BGP20+Ecc	3.19 b	83.78 a
				5）	0.05%纳他霉素+BGP20+Ecc	2.61 b	86.73 a
6）	0.25%纳他霉素+BGP20+Ecc	2.34 b	88.10 a
				7）	0.5%纳他霉素+BGP20+Ecc	2.93 b	85.10 a
8）	0.5%纳他霉素+Ecc	15.44 d	21.50 c

注：表中病斑面积（cm²）和防效（%）列数值后面不同的小写字母表示差异显著（P＜0.05）。

从表4结果可知，与仅接种病原菌Ecc的处理相比，纳他霉素对大白菜细菌性软腐病没有明显防效；但是，纳他霉素与BGP20发酵液混合施用，能够显著提高BGP20发酵液对大白菜细菌性软腐病的生防效果，且各纳他霉素浓度处理之间差异不显著。

    实施例9、复配生物防腐保鲜剂对樱桃番茄的贮藏保鲜效果

一种水剂型复配生物防腐保鲜剂，该复配生物防腐保鲜剂由纳他霉素∶解淀粉芽孢杆菌BGP20＝1∶50的重量比混合，即将2g纳他霉素添加到1L解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液（活芽孢浓度为10⁹ cfu/mL，以每克含有10¹⁰个芽孢的数量计算单位）中制备而成，此生物防腐保鲜剂以下简称10亿BGP20·0.2%纳他霉素。选择采后匍枝根霉软腐病多发的樱桃番茄温室大棚，在樱桃番茄采收前1~2 d，分别利用10亿BGP20·0.2%纳他霉素的5倍（折合有效成分为20.4 g/L）和20倍（折合有效成分为5.1 g/L）的灭菌水稀释液喷洒樱桃番茄。对照药剂为解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液（活芽孢浓度为10⁹ cfu/mL）5倍稀释液和0.5%的纳他霉素水溶液。待樱桃番茄表面晾干后采收，将采收的番茄放置在室温（17~26℃）保存。喷洒清水作为对照处理（CK），每个处理包含3个重复，每个重复100个樱桃番茄。20天后调查樱桃番茄的发病情况，统计发病率，并根据发病率计算防治效果。

发病率（%）＝发病的果实数/式样所用的果实总数；

防效＝100×（CK发病率－处理发病率）/CK发病率。

防治效果见表5。10亿BGP20·0.2%纳他霉素 5.1 g/L和20.4 g/L对樱桃番茄匍枝根霉软腐病防治效果分别为74.78%和83.48%。本发明显著优于对照药剂解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液5倍稀释液（折合有效成分为20 g/L）和对照药剂0.5%纳他霉素溶液（有效剂量为5 g/L）的防效（P＜0.05）。

表5、 10亿BGP20·0.2%纳他霉素（实施例9）防治匍枝根霉引起的樱桃番茄软腐病效果

注：表中防效（%）列数值后面不同的小写字母表示差异显著（P＜0.05）。

实施例10、复配生物防腐保鲜剂对樱桃番茄的贮藏保鲜效果

一种水剂型复配生物防腐保鲜剂，该复配生物防腐保鲜剂由纳他霉素∶解淀粉芽孢杆菌BGP20＝1∶100的重量比混合，即将1g纳他霉素添加到1L解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液（活芽孢浓度为10⁹ cfu/mL，以每克含有10¹⁰个芽孢的数量计算单位）中制备而成，此生物防腐保鲜剂以下简称10亿BGP20·0.1%纳他霉素。选择采后匍枝根霉软腐病多发的樱桃番茄温室大棚，在樱桃番茄即将采收前1~2天，分别利用10亿BGP20·0.1%纳他霉素的5倍（折合有效成分为20.2 g/L）和20倍（折合有效成分为5.05 g/L）的灭菌水稀释液喷洒樱桃番茄。对照药剂为解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液（活芽孢浓度为10⁹ cfu/mL）5倍稀释液和0.5%的纳他霉素水溶液。待樱桃番茄表面晾干后采收，将采收的番茄放置在室温（17~26℃）保存。喷洒清水作为对照处理（CK），每个处理包含3个重复，每个重复100个樱桃番茄。20天后调查樱桃番茄的发病情况，统计发病率，并根据发病率计算防治效果。

发病率（%）＝发病的果实数/式样所用的果实总数；

防效＝100×（CK发病率－处理发病率）/CK发病率。

防治效果见表6。10亿BGP20·0.1%纳他霉素 5.05 g/L和20.2 g/L对樱桃番茄匍枝根霉软腐病防治效果分别为72.17%和81.74%。本发明显著优于对照药剂解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液5倍稀释液（折合有效成分为20 g/L）和对照药剂0.5%纳他霉素溶液（有效剂量为5 g/L）的防效（P＜0.05）。

表6、 10亿BGP20·0.1%纳他霉素（实施例10）防治匍枝根霉引起的樱桃番茄软腐病效果

注：表中防效（%）列数值后面不同的小写字母表示差异显著（P＜0.05）。

实施例11、复配生物防腐保鲜剂对贮藏期芋头疫霉病害的控制效果

一种水剂型复配生物防腐保鲜剂，该复配生物防腐保鲜剂由纳他霉素∶解淀粉芽孢杆菌BGP20＝1∶50的重量比混合，即将2g纳他霉素添加到1L解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液（活芽孢浓度为10⁹ cfu/mL，以每克含有10¹⁰个芽孢的数量计算单位）中制备而成，此生物防腐保鲜剂以下简称10亿BGP20·0.2%纳他霉素。将上述复配生物防腐保鲜剂利用灭菌水分别稀释5倍（折合有效成分为20.4 g/L）和20倍（折合有效成分为5.1 g/L），将采收的新鲜芋头分别在5倍或20倍的复配生物防腐保鲜剂稀释液中浸泡2~3 min，捞出晾干。对照药剂为解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液（活芽孢浓度为10⁹ cfu/mL）5倍稀释液和0.5%的纳他霉素水溶液，以清水处理为空白对照（CK）。晾干后喷雾接种含有芋疫霉孢子（约10⁴ CFU/mL）的悬浮液，再晾干。然后按照常规方法进行贮藏。每个处理包含三个重复，每个重复100芋头。于处理后45 d调查芋头的发病情况，统计发病率，并根据发病率计算防治效果。

发病率（%）＝发病的果实数/式样所用的果实总数；

防效＝100×（CK发病率－处理发病率）/CK发病率。

防治效果见表7。10亿BGP20·0.2%纳他霉素 5.1 g/L和20.4 g/L对芋头疫霉病的防治效果分别为74.39%和81.71%。本发明显著优于对照药剂解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液5倍稀释液（折合有效成分为20 g/L）和对照药剂0.5%纳他霉素溶液（有效剂量为5 g/L）的防效（P＜0.05）。

表7、 10亿BGP20·0.2%纳他霉素（实施例11）防治芋头疫霉病的效果

注：表中防效（%）列数值后面不同的小写字母表示差异显著（P＜0.05）。

实施例12、复配生物防腐保鲜剂对贮藏期芋头疫霉病害的控制效果

一种水剂型复配生物防腐保鲜剂，该复配生物防腐保鲜剂由纳他霉素∶解淀粉芽孢杆菌BGP20＝1∶100的重量比混合，即将1g纳他霉素添加到1L解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液（活芽孢浓度为10⁹ cfu/mL，以每克含有10¹⁰个芽孢的数量计算单位）中制备而成，此生物防腐保鲜剂以下简称10亿BGP20·0.1%纳他霉素。将上述复配生物防腐保鲜剂利用灭菌水分别稀释5倍（折合有效成分为20.2 g/L）和20倍（折合有效成分为5.05 g/L），将采收的新鲜芋头分别在5倍或20倍的复配生物防腐保鲜剂稀释液中浸泡2~3 min，捞出晾干。对照药剂为解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液（活芽孢浓度为10⁹ cfu/mL）5倍稀释液和0.5%的纳他霉素水溶液，以清水处理为空白对照（CK）。晾干后喷雾接种含有芋疫霉孢子（约10⁴ CFU/mL）的悬浮液，再晾干。然后按照常规方法进行贮藏。每个处理包含三个重复，每个重复100芋头。于处理后45 d调查芋头的发病情况，统计发病率，并根据发病率计算防治效果。

发病率（%）＝发病的果实数/式样所用的果实总数；

防效＝100×（CK发病率－处理发病率）/CK发病率。

防治效果见表8。10亿BGP20·0.1%纳他霉素 5.05 g/L和20.2 g/L对芋头疫霉病的防治效果分别为69.51%和78.66%。本发明显著优于对照药剂解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液5倍稀释液（折合有效成分为20 g/L）和对照药剂0.5%纳他霉素溶液（有效剂量为5 g/L）的防效（P＜0.05）。

表8、10亿BGP20·0.1%纳他霉素（实施例12）防治芋头疫霉病的效果

注：表中防效（%）列数值后面不同的小写字母表示差异显著（P＜0.05）。

实施例13、复配生物防腐保鲜剂对贮藏期芋头疫霉病害和细菌性软腐病的综合防治效果

一种水剂型复配生物防腐保鲜剂，该复配生物防腐保鲜剂由纳他霉素∶解淀粉芽孢杆菌BGP20＝1∶50的重量比混合，即将2g纳他霉素添加到1L解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液（活芽孢浓度为10⁹ cfu/mL，以每克含有10¹⁰个芽孢的数量计算单位）中制备而成，此生物防腐保鲜剂以下简称10亿BGP20·0.2%纳他霉素。将上述复配生物防腐保鲜剂利用灭菌水分别稀释5倍（折合有效成分为20.4 g/L）和20倍（折合有效成分为5.1 g/L），将采收的新鲜芋头分别在5倍或20倍的复配生物防腐保鲜剂稀释液中浸泡2~3 min，捞出晾干。对照药剂为解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液（活芽孢浓度为10⁹ cfu/mL）5倍稀释液和0.5%的纳他霉素水溶液，以清水处理为空白对照（CK）。晾干后喷雾接种含有芋疫霉孢子（约10⁴ CFU/mL）和胡萝卜软腐欧文氏菌（约10⁶ CFU/mL）的病菌悬浮液，再晾干。然后按照常规方法进行贮藏。每个处理包含三个重复，每个重复100芋头。于处理后45 d调查芋头的发病情况，统计发病率，并根据发病率计算防治效果。

发病率（%）＝发病的果实数/式样所用的果实总数；

防效＝100×（CK发病率－处理发病率）/CK发病率。

防治效果见表9。10亿BGP20·0.2%纳他霉素 5.1 g/L和20.4 g/L对贮藏期芋头疫霉病害和细菌性软腐病的综合防治效果分别为68.04%和77.84%。本发明显著优于对照药剂解淀粉芽孢杆菌BGP20发酵液5倍稀释液（折合有效成分为20 g/L）和对照药剂0.5%纳他霉素溶液（有效剂量为5 g/L）的防效（P＜0.05）。

表9、10亿BGP20·0.2%纳他霉素（实施例13）防治芋头疫霉病和细菌性软腐病的效果

注：表中防效（%）列数值后面不同的小写字母表示差异显著（P＜0.05）。

上述实施例说明本发明涉及的复配生物防腐保鲜剂具有良好的产品稳定性，对采后果蔬细菌性软腐病和霉菌病害具有较好的控制效果，能够显著减少贮藏期果蔬的损失，降低化学农药残留，维持果蔬的品质及商品性。

Claims (8)

1.一种复配生物防腐保鲜剂，其特征在于，包含解淀粉芽孢杆菌BGP20和纳他霉素，所述解淀粉芽孢杆菌BGP20，其保藏编号为CGMCC No.8288。

2.根据权利要求1所述的复配生物防腐保鲜剂，其特征在于，所述复配生物防腐保鲜剂的配比为：每1L解淀粉芽孢杆菌BGP20菌株的发酵液中含有0.1~5 g的纳他霉素。

3.一种权利要求1或2所述的复配生物防腐保鲜剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.菌种培养

1）活化培养：取解淀粉芽孢杆菌BGP20甘油保存菌种，划线接种至新鲜2YT固体平板上，在25~32℃条件下活化培养24~36 h;

2）种子液制备：利用灭菌牙签 挑取一个单菌落接种到一个含有50 mL 2YT液体培养基的250 mL锥形瓶中，25~32℃下振荡培养36~48 h，振荡频率为100~200 r/min；

B.发酵液的制备

将上述步骤2）所得的种子液以1%~5%（v/v）的比列接种于发酵培养基中进行发酵，发酵温度为25~32℃，以通气比0.2:1到2.5:1之间进行发酵通气，搅拌速度为75~180 r/min，发酵时间为36~48 h；

C.纳他霉素的添加

发酵终止后，添加纳他霉素，使其终浓度为0.1~5 g/L，充分搅拌，使纳他霉素与发酵液均匀混合，然后无菌灌装，室温保存。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的2YT固体培养基，其配比为：胰蛋白胨 17 g，酵母浸膏10 g，NaCl 5 g，琼脂 15 g，蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0，121℃条件下灭菌20 min。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养基，其配比为：豆粕16.03 g/L、玉米淀粉6.30 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.75 g/L、NaCl 1.25 g/L、KH₂PO₄ 0.75 g/L、微量元素 15 mL/L，蒸馏水定容至1000 mL，pH 6.8~7.5，121℃条件下灭菌20 min。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述微量元素为FeSO₄·7H₂O 0.16 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 0.16 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.16 mg/L，MnSO₄ 5 mg/L。

7.一种权利要求1或2所述的复配生物防腐保鲜剂的使用方法，其特征在于，将复配生物防腐保鲜剂稀释1~5倍，在果蔬采收前均匀喷洒，晾干后采收贮藏。

8.一种权利要求1或2所述的复配生物防腐保鲜剂的使用方法，其特征在于，将复配生物防腐保鲜剂稀释1~5倍，利用喷洒或浸泡的方式处理采后果蔬，晾干后按照果蔬的常规贮藏方法进行保存。

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