CN103602607A

CN103602607A - 一株淡紫灰链霉菌x33及其应用

Info

Publication number: CN103602607A
Application number: CN201310327536.XA
Authority: CN
Inventors: 吴晓玉; 张宇坤; 段栓成; 陈金
Original assignee: Jiangxi Agricultural University
Current assignee: Jiangxi Agricultural University
Priority date: 2013-07-31
Filing date: 2013-07-31
Publication date: 2014-02-26
Anticipated expiration: 2033-07-31
Also published as: CN103602607B

Abstract

本发明公开一株淡紫灰链霉菌X33（Streptomyces lavendulaeX33），其保藏编号为CCTCCNO.M2013163。该菌株及其发酵液可用于防治果蔬的绿霉病、青霉病和酸腐病，防治葡萄座腔菌(Botryosphaeriaspp.)引起树木的溃疡病和枯梢病病害。本发明的优点在于：无毒、无副作用，可同时防治多种植物病害且防治效果显著，制备工艺简单、成本低，使用方法简便。

Description

一株淡紫灰链霉菌X33及其应用

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一株淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)X33及其应用。

背景技术

随着人们对无污染、无公害绿色食品和环境保护呼声日益提高, 生物防治已成为继农业化学防治之后的又一重要防治方法, 许多生物杀菌剂已相继问世, 并广泛应用于生产, 取得了显著效果。链霉菌可以产生多种次生代谢物质，在植物保护方面发挥了巨大作用，其产生的抗生素种类多，而且大多数已在农业生产中广泛应用，可防治真菌、细菌、线虫病及一些重要的害虫，有的还有除草活性。淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)是一种重要的抗生素产生菌。应用淡紫灰链霉菌防治植物病害的报道有很多，有研究表明用淡紫灰链霉菌来防治番茄灰霉病、番茄叶霉病、葡萄白腐病、西瓜枯萎病和苹果轮纹病等植物病害，均起到了显著的效果。但迄今为止，还未见淡紫灰链霉菌应用于果蔬青绿霉病、酸腐病、树木溃疡病和枯梢病的报道。

发明内容

本发明的目的旨在探寻果蔬保鲜剂和生物农药的新来源，利用土壤微生物资源而开发的一株可用于植物真菌病害防治的广谱、高效、可产业化生产的淡紫灰链霉菌。

本发明还有一个目的是提供菌株X33及其发酵液在防治果蔬的绿霉病、青霉病和酸腐病以及防治葡萄座腔菌(Botryosphaeria spp.)引起树木的溃疡病和枯梢病病害中的应用。

本发明的技术方案为：一株淡紫灰链霉菌X33（Streptomyces lavendulae X33），其保藏编号为CCTCC M 2013163。利用培养基培养所述淡紫灰链霉菌X33产生的发酵液及其菌体应用于防治果蔬病害和树木病害。生产该霉菌时所述培养基含一种或一种以上的碳源物质、一种或一种以上的氮源物质及无机或有机盐类物质，其中碳源物质含量为2%-10%，氮源物质含量为2%-10%，盐类物质含量为0.01%-0.1%，其余为组份水，所述的微生物培养在需氧条件下进行，发酵初始pH值为5.0- 10.0，发酵中后期调节pH值为6.0- 9.0，培养温度为20- 35℃。碳源物质包括淀粉、糖蜜、脂肪、有机酸、脂肪酸、纤维二糖、氨基酸、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖、肌醇、半乳糖、海藻糖、木糖、甘露醇、鼠李糖和阿拉伯糖。氮源物质包括玉米浆、豆粉、蛹粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、铵盐、硝酸盐。无机或有机盐类物质包括磷酸盐、钠盐、钾盐、镁盐、铁盐。应用于果蔬保鲜剂，果蔬保鲜剂用于防治果蔬的绿霉病、青霉病和酸腐病。应用于生物农药，生物农药用于防治葡萄座腔菌引起的树木的溃疡病和枯梢病病害。

本发明提供的淡紫灰链霉菌X33属淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)，并已于2013年4月28日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO.M 2013163，保藏单位地址：中国武汉市武汉大学。

本发明的淡紫灰链霉菌X33，为发明人从柑橘根系土壤中分离而得。该菌株的形态特征、生理生化特征如下：

1、形态特征：在光学显微镜下，菌株X33由高氏一号培养基培养的菌丝发育良好，分支广泛，气生菌丝无横隔、不断裂；孢子丝长直，少数波曲，顶端大螺旋。在扫描电子显微镜下，菌株X33孢子呈柱状，表面光滑，孢子宽度约为6μm，这些显微形态均符合链霉菌属的典型特征。

2、生理生化特征及碳源利用如下：

生理生化特征：菌株X33不产生 H₂S和黑色素，不液化明胶，不分解纤维素，可水解淀粉，不凝固牛奶但可胨化。

碳源利用：容易利用蔗糖、乳糖、肌醇、半乳糖、海藻糖、D-果糖、D-木糖、D-甘露醇、L-鼠李糖和L-阿拉伯糖，较难利用麦芽糖，对D-葡萄糖利用可疑。

本发明所述的淡紫灰链霉菌，其培养方法为深层液体或固体培养，培养基中含有常用于微生物培养的碳源、氮源及其他无机盐类与生长因子。其中碳源可为淀粉、糖蜜、有机酸、脂肪酸、葡萄糖、蔗糖、果糖等含碳有机或无机化合物，氮源可为玉米浆、豆粉、蛹粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、花生粉、铵盐、尿素、硝酸盐以及其他有机或无机含氮化合物；适当添加无机或有机盐类物质，如磷酸盐、钠盐、钾盐、镁盐、铁盐等，必要时可添加一些动、植、矿物油等作为消泡剂。对温度、pH、时间等培养条件并无严格的限制，以适于产生菌的生产为准，并以选择活性最高的条件为好。微生物培养在需氧条件下进行，发酵初始pH值为5.0~ 10.0，以接近中性为好，发酵中后期调节pH值为6.0~ 9.0，温度为20 ~ 35℃。这些培养基的组份、通气条件、pH、培养温度等均应根据实际情况进行适当的调整，以获得最好的效果。

本发明的优点在于：无毒、无副作用，可同时防治多种植物病害且防治效果显著，制备工艺简单、成本低，使用方法简便。

具体实施方式

下面用实例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例一：菌株X33的筛选和鉴定

通过皿内抑菌试验，以指状青霉为指示菌，从柑橘根系土壤中分离放线菌，其中菌株X33抑菌活性最强。测定菌株X33抗菌谱发现其无菌发酵滤液对6种细菌，4种酵母菌和6种植物病原真菌均具有显著的抑制效果，且菌株X33具有良好的传代抑菌稳定性，根据培养特征、显微形态、生理生化特征及16SrDNA序列分析等，将菌株X33鉴定为淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendulae）。

实施例二：菌株X33的250mL摇瓶发酵培养

淡紫灰链霉菌X33接种于高氏一号斜面培养基上，待斜面孢子成熟后，按5~10%接种量接种于含30mL种子培养液的250mL三角瓶中，32℃、200r/min条件下震荡培养48h。将培养好的种子液按5~10%接种量接种于含30mL发酵培养液的250mL三角瓶中，先在32℃、200r/min条件下震荡培养48h ，然后再在28℃、180r/min条件下震荡培养24h。

各种培养基配方如下：

斜面培养基：可溶性淀粉2%，KNO₃0.1%，NaCl0.05%，MgSO₄0.05%，K₂HPO₄0.05%，FeSO₄·7H₂O0.001%，琼脂2%，pH7.2-7.4。

种子培养基：可溶性淀粉2%，牛肉膏0.3%，蛋白胨0.5%，KNO₃0.1%，K₂HPO₄0.05%，初始pH7.0。

发酵培养基:可溶性淀粉1%，蔗糖2%，玉米粉1%，黄豆粉2%，（NH₄）₂SO₄0.3%，K₂HPO₄0.02%，MgSO₄0.05%，FeSO₄0.001%，CaCO₃0.5%，初始pH7.0。

实施例三：淡紫灰链霉菌X33菌株的50L发酵培养

斜面和种子培养方式同实施例二。 50L发酵罐接种量5~10%，发酵温度30℃，罐压0.05Mpa，搅拌转速300r/min，通气比为0.6-1.2vvm，溶氧控制在10-80%，发酵液pH维持在6.5-7.5之间，发酵时间72h。测定发酵液效价。

实施例四：淡紫灰链霉菌X33菌株发酵液对植物病原菌的抑制。

采用菌丝生长速率法验证发酵液对不同植物病原真菌的抑制效果。实验使用双层平板，平板下层为15mL PDA培养基，上层为10mL含有发酵液的PDA培养基。上层培养基加入稀释10倍发酵液1mL，并以上层培养基加入1mL无菌水为对照。用打孔器打取培养好的植物病原真菌菌块，放置双层平板中心点，28℃恒温培养，每处理3次重复。待对照组中心菌落将要长满整个培养皿时，用十字交叉法测量并记录各组的菌落直径，按如下公式计算菌丝生长抑制率：

抑制率=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/（对照组菌落直径-菌饼直径）

淡紫灰链霉菌X33发酵液对白地霉的抑制率高达100%，对指状青霉、意大利青霉和葡萄坐腔菌的抑制率分别为88%、86%和98%。

实施例五：淡紫灰链霉菌X33发酵液对采后果蔬绿霉病的病害防治

以柑橘为例，将实施例二培养所得的培养物经过滤后取上清液，以无菌水稀释3、5、10倍，取用 75% 酒精处理晾干后的新鲜柑橘，先用解剖刀于果实腰部刺一伤口（3mm*3mm），在伤口处预先滴加15μL的发酵上清液进行处理，以无菌水处理作为对照，将各处理后的果实置于保鲜盒内，于室温放置24h后，再分别接种15μL的绿霉病菌孢子悬液（以无菌水洗下培养基上生长的绿霉病菌菌落，过滤，调整孢子终浓度为10⁶个/mL，塑料袋密封保鲜盒后置于28℃下保湿培养。重复3次试验。无菌水对照组柑橘绿霉病发病率为100%，3、5、10倍稀释的发酵液处理后的柑橘绿霉病发病率分别为13%、20%、31%。

表明本发明的淡紫灰链霉菌X33的培养物对果蔬绿霉病菌有很好的防治效果。

实施例六：淡紫灰链霉菌X33发酵液对采后果蔬青霉病的病害防治

以脐橙为例，处理方法同实施例五，脐橙的无菌水对照组青霉病发病率为97.8%，3、5、10倍稀释的发酵液处理后的柑橘绿霉病发病率分别为11%、20%、33%。

表明本发明的淡紫灰链霉菌X33的培养物对果蔬青霉病菌有很好的防治效果。

实施例七：淡紫灰链霉菌X33发酵液对采后果蔬酸腐病的病害防治

选取柑橘例，处理方法同实施例五，柑橘的无菌水对照组酸腐病发病率为100%，3、5、10倍稀释的发酵液处理后的柑橘酸腐病发病率分别为7%、16%、28%。

表明本发明的淡紫灰链霉菌X33的培养物对果蔬酸腐病菌有很好的防治效果。

实施例八：淡紫灰链霉菌X33发酵液在果蔬贮藏中的应用

实验设两个处理，每处理3箱（每箱20公斤，约160个果实），重复处理三次，在柑橘基本成熟期采果，刚采下的果实分别用清水和稀释5倍的淡紫灰链霉菌X33发酵液浸果1min，将果实晾干，1-2天后将将处理过的果实用聚乙烯薄膜单果包装，置于纸箱内，纸箱外覆聚乙烯薄膜，贮藏室为自然室温（贮藏室消毒和管理参照《柑橘一生产技术与科学实验》，科学出版社，1977年版），试验贮藏周期定为120天。从柑橘果实处理后入库开始，每天记录、观察柑橘果实感病（重点是柑橘青霉病、绿霉病和酸腐病）的发生时间和状况。结果发现清水浸果的柑橘青霉病、绿霉病和酸腐病发病率分别为50%、30%、12%；稀释5倍的淡紫灰链霉菌X33发酵液浸果的柑橘青霉病、绿霉病和酸腐病发病率分别为20%、11%、5%。

Claims

1.一株淡紫灰链霉菌X33（Streptomyces lavendulae X33），其保藏编号为CCTCC NO.M 2013163。

2.一株淡紫灰链霉菌X33的应用，其特征在于：利用培养基培养所述淡紫灰链霉菌X33产生的发酵液及其菌体应用于防治果蔬病害和树木病害。

3.根据权利要求2所述的淡紫灰链霉菌X33的应用，其特征在于：生产该霉菌时所述培养基含一种或一种以上的碳源物质、一种或一种以上的氮源物质及无机或有机盐类物质，其中碳源物质含量为2%-10%，氮源物质含量为2%-10%，盐类物质含量为0.01%-0.1%，所述的微生物培养在需氧条件下进行，发酵初始pH值为5.0- 10.0，发酵中后期调节pH值为6.0- 9.0，培养温度为20- 35℃。

4.根据权利要求3所述的淡紫灰链霉菌X33的应用，其特征在于：碳源物质包括淀粉、糖蜜、脂肪、有机酸、脂肪酸、纤维二糖、氨基酸、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖、肌醇、半乳糖、海藻糖、木糖、甘露醇、鼠李糖和阿拉伯糖。

5.根据权利要求3所述的淡紫灰链霉菌X33的应用，其特征在于：氮源物质包括玉米浆、豆粉、蛹粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、铵盐、硝酸盐。

6.根据权利要求3所述的淡紫灰链霉菌X33的应用，其特征在于：无机或有机盐类物质包括磷酸盐、钠盐、钾盐、镁盐、铁盐。

7.权利要求2所述的淡紫灰链霉菌X33的应用，其特征在于：应用于果蔬保鲜剂，果蔬保鲜剂用于防治果蔬的绿霉病、青霉病和酸腐病。

8.权利要求2所述的淡紫灰链霉菌X33的应用，其特征在于：应用于生物农药，生物农药用于防治葡萄座腔菌引起的树木的溃疡病和枯梢病病害。