CN104738093A - 一种凝结芽胞杆菌菌悬液的制备方法 - Google Patents

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CN104738093A CN201510134705.7A CN201510134705A CN104738093A CN 104738093 A CN104738093 A CN 104738093A CN 201510134705 A CN201510134705 A CN 201510134705A CN 104738093 A CN104738093 A CN 104738093A
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刘艳
杨文革
刘邮洲
章泳
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Abstract

本发明涉及一种凝结芽胞杆菌菌悬液的制备方法，将凝结芽胞杆菌CGMCC No.6681菌株接到固体培养基平板中菌种活化，然后种子培养、发酵培养，最后发酵培养得到的发酵液离心，弃上清液，取菌泥，对无菌水配成含有5×1010～8×1010cfu/mL菌悬液，再加入表面活性剂，得到凝结芽胞杆菌菌悬液。本发明所该方法制得菌悬液在植物的体表定殖能力增强，集促生、抑菌和杀虫于一体，其多种功效决定了其推广具有非常大的前景，符合现代农业的要求。

Description

一种凝结芽胞杆菌菌悬液的制备方法
技术领域
本发明属于微生态制剂领域，涉及一种凝结芽胞杆菌菌悬液的制备方法，还涉及所制备的菌悬液在在农业领域的应用。
背景技术
中国作为一个人口众多的农业大国，我国耕地面积达19.6亿亩，粮食安全生产事关国计民生与社会稳定。近20多年来，受耕作制度的变化、气候变异以及产业结构调整等因素的影响，全国农作物病害问题突发和爆发的频率增加，危害加剧。植物病害一直以来都是农作物优质高产最重要的制约因素之一。全球植物病害导致主要农作物的平均损失，约占总产量的10％～15％，每年直接经济损失高达数千亿美元。而农作物病害中，70％～80％是由真菌病原菌侵染所引致的。化学防治方法在我国农作物真菌病害防治中长期占据着重要位置，但化学农药的使用会增大农民生产成本，而且反复施用将不可避免地带来环境污染和农药残留等问题。
随着人们对环境和自身健康的日益关注，研究开发用量少、超高效、极低毒、安全可靠、易降解、无环境污染的生物农药已成为当今世界各国防治农作物病害研究的重要方向。生物农药产业将对绿色食品的生产提供可靠的生产资料，提升农产品的质量和价值，促进特色农业、生态农业和旅游观光农业的发展，从而带动农民的增收。现无论是迎接国际贸易间绿色壁垒的挑战，还是增强我国农业自身竞争力、实现数量型农业向质量型农业的转变，都迫切要求改变当前以化学防治为主的农作物真菌病害防治现状，提高农作物真菌病害防治技术水平，从农作物真菌病害防治的角度来推动农产品生产过程的无公害化。促进农村经济快速发展，建设社会主义新农村具有着重要意义。
凝结芽胞杆菌，现已广泛应用于医疗、食品保健和畜牧等领域，作为医药的研究最为成熟，已经形成了较完整的生产工艺，其医药商品爽舒宝等的应用也较成熟。但是在农作物病害防治方面的研究，只是处于刚刚起步阶段，大多数处于实验室内研究阶段，具有非常大的应用潜力。
发明内容
本发明的目的是为了改进现有技术的不足而提供一种凝结芽胞杆菌菌悬液 的制备方法。
本发明的技术方案为：一种凝结芽胞杆菌菌悬液的制备方法，包括菌种活化、种子培养、发酵培养、表面活性剂的添加四个步骤，其具体步骤如下：
A.菌种活化：将凝结芽胞杆菌CGMCC No.6681菌株接到固体培养基平板中，设定温度为34～38℃，培养时间为40～45h；
B.种子培养：从步骤A培养好的平板中挑取一个单菌落，转接到装有种子培养基的三角瓶中，在迴转式恒温调速摇瓶柜中，34～38℃，140～180r/min条件下摇床培养12～20h得到种子培养液；
C.发酵培养：是将种子培养液转接到装有发酵培养基的三角瓶中，在迴转式恒温调速摇瓶柜中以140～180r/min，34～38℃条件下培养40～45h，得发酵液；其中种子培养液与发酵培养基的体积比为0.02～0.07：1；
D.表面活性剂的添加：将步骤C发酵培养得到的发酵液离心，弃上清液，取菌泥，对无菌水配成含有5×1010～8×1010cfu/mL菌悬液，再加入表面活性剂，得到凝结芽胞杆菌菌悬液。
凝结芽胞杆菌菌种的拉丁学名是：Bacillus coagulans，保藏日期是2012年10月18日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.6681。
优选步骤A中所述的固体培养基组分为：蛋白胨10.00-15.00g/L，酵母膏5.00-8.00g/L，氯化钠5.00-8.00g/L，琼脂粉18.00-20.00g/L，pH 7.0～7.2。
优选步骤B中所述的种子培养基组分为：葡萄糖50.00-60.00g/L，蛋白胨10.00-15.00g/L，酵母膏5.00-8.00g/L，pH 7.5-8.0(葡萄糖分消)。
优选步骤C中所述的发酵培养基组分为：葡萄糖22.00-25.00g/L、蛋白胨10.00-12.00g/L、酵母膏10.00-15.00g/L、MnSO4·H2O 0.0002-0.0003g/L、CaCO30.02-0.05g/L，pH 7.5-8.0(葡萄糖与碳酸钙分消)。
优选上述的表面活性剂为甘油、吐温80或十二烷基葡萄糖苷(APG)中的一种；表面活性剂的添加量为表面活性剂在得到凝结芽胞杆菌菌悬液中的浓度为0.5-0.8g/L。
优选步骤B中种子培养基的体积占三角瓶体积的5～15％。优选步骤C中发酵培养基的体积占三角瓶体积的5～15％。
优选步骤D中离心转速为8000～10000r/min，离心时间为10～15min。
本发明还提供了上述所制备的凝结芽胞杆菌(CGMCC No.6681)菌悬液在 抑制作物病菌、杀灭作物害虫、促进作物生长方面的应用。
生防试验如下：
凝结芽胞杆菌抑菌谱测定
真菌的活化与培养：挑取真菌菌丝或胞子置PSA平板中央，28℃倒置培养。采用平板对峙法，待活化好的病原真菌菌落长至一元硬币大小时，用打孔器(d＝6～8mm)在活化好的病原菌的菌落边缘打取菌丝块，将菌丝块挑入PSA平板中线1/3处，培养40～45h后，在同一条中线1/3处打好的孔中接入15～20μL的凝结芽胞杆菌CGMCC No.6681菌悬液。接种后的培养皿置于28℃温度下培养，待凝结芽胞杆菌CGMCC No.6681菌悬液干了之后倒置，每处理重复3次，以只接病原菌的培养基作为对照。
以不接生防菌为阴性对照。以多菌灵做抑菌阳性对照试验。
多菌灵平板的制备：以0.02mol/L的稀盐酸稀释溶解多菌灵制备成母液，在培养基中添加合适的剂量，混合均匀，在超净台内倾注平板备用；
凝结芽胞杆菌防治根结线虫及促生效果的研究
(1)试验在江苏省南京市江宁区湖熟镇蔬菜园区的塑料大棚日光温室内进行，土壤为盐碱土，肥力中等。
(2)试验设计：田间试验按1000ml/500m2用量使用，将大田分为8个区，每一处理2个小区重复，单小区试验，每个小区20m2，各处理按完全随机区组排列。分别于20d和40d对形态指标进行测定(株高、干鲜重)，每个小区采样10株，与无菌水的对照组相比较，统计根结线虫的危害程度进行分级后计算防效，并统计增产率(％)。
病情指数(％)＝∑(各级植物数×极值)/(调查总株数×最高极值)×100
增产率(％)＝(菌剂处理后的产量-空白对照产量)/空白对照产量×100
形态指标测定：在每个处理小区中选择出5株长相基本一致的植株进行挂牌，调查株高、茎粗、果实重量等指标。
株高：样本植株子叶节到植株顶部的总长度。
茎粗：植株第一片真叶下1cm处的粗度。 
CGMCC No.6681菌株具有下述性质：
1、形态与培养特征：
该菌为革兰氏染色阳性菌，菌体呈杆形，(0.8～1)μm×(3～4)μm，单个或成短链。产生卵圆形芽孢，大多偏菌体一端菌，有的孢子囊膨胀，有运动性。对外界环境抵抗力很强，90℃处理10min，100℃处理5min不会失活，pH值为4.0～9.0时也能生长。在营养琼脂培养基上边缘不整齐，呈扁平圆形白色菌落，2～3mm大小。兼性厌氧菌，生长温度为20～55℃，最适生长温度为35～45℃。
2、生理生化特性
凝结芽孢杆菌CGMCC No.6681菌株的主要生理生化特征见表1：
表1 菌株的生理生化特征
注：+：阳性或生长；－：阴性或不生长
有益效果： 
本发明提供了一种凝结芽胞杆菌菌悬液的制备方法。该方法制得菌悬液在植物的体表定殖能力增强，集促生、抑菌和杀虫于一体，其多种功效决定了其推广具有非常大的前景，符合现代农业的要求。
保藏信息
上述凝结芽孢杆菌其分类命名为Bacillus coagulans，参据的微生物(株)为：NJYHHWG 877005，该菌株是本课题组自主筛选并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所)。其简称为CGMCC，保藏日期是2012年10月18日，登记入册的编号是CGMCC No.6681。
具体实施方式
下面对本发明的实施案例作详细说明，本实施案例以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的担任过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例。
实例1：
上述凝结芽胞杆菌菌株，菌种的拉丁学名是：Bacillus coagulans，参据的菌株：NJYHHWG 877005，保藏日期是2012年10月18日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.6681。
将凝结芽胞杆菌CGMCC No.6681菌种接到固体培养基(蛋白胨10.00g/L，酵母膏5.00g/L，氯化钠5.00g/L，琼脂粉18.00g/L，pH 7.0)平板中，设定温度为34℃，培养时间为40h。
从培养好的平板中挑取一个单菌落，接入到种子培养基(葡萄糖50.00g/L，蛋白胨10.00g/L，酵母膏5.00g/L，pH 7.5(葡萄糖分消))中，三角瓶的种子培养基的装液量(v/v)为5％，在迴转式恒温调速摇瓶柜中，34℃，140r/min条件下摇床培养12h。将种子培养液以2％(v/v)接种量转接到发酵培养基(葡萄糖22.00g/L、蛋白胨10.00g/L、酵母膏10.00g/L、MnSO4·H2O 0.0002g/L、CaCO30.02g/L，pH 7.5(葡萄糖分消))三角瓶中，三角瓶发酵培养基的装液量(v/v)为5％，在迴转式恒温调速摇瓶柜中以140r/min，34℃条件下培养40h。取培养40h凝结芽胞杆菌的发酵液，8000r/min下离心10min，弃上清液，取菌泥，对无菌水配成含有5×1010cfu/mL菌悬液，加入表面活性剂甘油，加入后表面活性剂甘油在菌悬液中的浓度为0.5g/L，得到凝结芽胞杆菌CGMCC 6681菌悬液。
待活化好的病原菌菌落长至一元硬币大小时，用打孔器(d＝6mm)在活化好的病原真菌的菌落边缘打取菌丝块，将菌丝块挑入PSA平板中线1/3处，培养 40h后，在同一条中线1/3处打好的孔中接入15μL的生防菌凝结芽胞杆菌菌悬液。接种后的培养皿置于28℃温度下培养，待发酵液干了之后倒置，每处理重复3次，以只接病原菌的培养基作为对照。
试验结果：以多菌灵做对照试验。Bacillus coagulans CGMCC 6681对几种不同真菌病原菌抑菌效果，结果见表1。
表1 不同药剂的抑菌率
由表1可知生防菌发酵液可以有效抑制番茄灰霉病、棉花黄萎病、番茄叶霉病、甘蓝黑斑病和油菜菌核病病原菌。其中Bacillus coagulans CGMCC 6681对番茄灰霉的防治效果最好，抑制率为68.58％。
②Bacillus coagulans CGMCC No.6681田间杀虫试验
将上述培养40h凝结芽胞杆菌的发酵液，8000r/min下离心10min，弃上清液，取菌泥，对无菌水配成含有5×1010cfu/mL菌悬液，加入表面活性剂甘油，控制甘油的浓度为0.5g/L，得到凝结芽胞杆菌CGMCC No.6681菌悬液。
采用喷洒叶面的方式进行田间试验，按1000ml/500m2用量使用，将大田分为8个区，每一处理2个小区重复，单小区试验，每个小区20m2，各处理按完全随机区组排列。选取试验对象为辣椒，每个小区采样10株，与多菌灵、无菌水的对照组相比较，分别于20d和40d统计蚜虫的危害程度进行分级后计算防效，并统计增产率(％)。
试验结果见表2：
表2 Bacillus coagulans CGMCC 6681对黄瓜蚜虫的防治效果
③Bacillus coagulans CGMCC No.6681田间促生实验
将上述培养40h凝结芽胞杆菌的发酵液，8000r/min下离心10min，弃上清液，取菌泥，对无菌水配成含有5×1010cfu/mL菌悬液，加入0.5g/L表面活性剂的甘油，得到凝结芽胞杆菌CGMCC No.6681菌悬液。
采用喷洒叶面的方式进行田间试验，按1000ml/500m2用量使用，将大田分为8个区，每一处理2个小区重复，单小区试验，每个小区20m2，各处理按完全随机区组排列。选取试验对象为辣椒，每个小区采样10株，与无菌水的对照组相比较，分别于20d和40d对形态指标进行测定(株高、干鲜重)，并统计增产率(％)。
试验结果见表3：
表3 Bacillus coagulans CGMCC 6681对辣椒促生的田间效果
实例2：
将凝结芽胞杆菌CGMCC No.6681菌种接到固体培养基(蛋白胨15.00g/L，酵母膏6.00g/L，氯化钠6.00g/L，琼脂粉19.00g/L，pH 7.1)平板中，设定温度为36℃，培养时间为43h。
从培养好的平板中挑取一个单菌落，接入到种子培养基(葡萄糖55.00g/L，蛋白胨12.00g/L，酵母膏6.00g/L，pH 7.8(葡萄糖分消))中，三角瓶种子培养基的装液量(v/v)为12％，在迴转式恒温调速摇瓶柜中，36℃，150r/min条件下摇床培养18h。将种子培养液以4％(v/v)接种量转接到发酵培养基(葡萄糖24.00g/L、蛋白胨11.00g/L、酵母膏12.00g/L、MnSO4·H2O 0.00025g/L、CaCO30.04g/L，pH 7.8(葡萄糖分消))三角瓶中，三角瓶发酵培养基的装液量(v/v) 为12％，在迴转式恒温调速摇瓶柜中以150r/min，36℃条件下培养43h。取培养43h凝结芽胞杆菌的发酵液，9000r/min下离心12min，弃上清液，取菌泥，对无菌水配成含有7×1010cfu/mL菌悬液，加入表面活性剂的十二烷基葡萄糖苷(APG)，控制其浓度为0.7g/L，得到凝结芽胞杆菌CGMCC 6681菌悬液。
待活化好的病原菌菌落长至一元硬币大小时，用打孔器(d＝6mm)在活化好的病原真菌的菌落边缘打取菌丝块，将菌丝块挑入PSA平板中线1/3处，培养43h后，在同一条中线1/3处打好的孔中接入18μL的生防菌凝结芽胞杆菌菌悬液。接种后的培养皿置于28℃温度下培养，待发酵液干了之后倒置，每处理重复3次，以只接病原菌的培养基作为对照。
试验结果：以多菌灵做对照试验。Bacillus coagulans CGMCC 6681对几种不同真菌病原菌抑菌效果，结果见表1。
表1 不同药剂的抑菌率
由表1可知凝结芽胞杆菌菌悬液可以有效抑制番茄灰霉病、棉花黄萎病、番茄叶霉病、甘蓝黑斑病和油菜菌核病病原菌。其中对番茄灰霉的防治效果最好，抑制率为72.32％。
②Bacillus coagulans CGMCC No.6681田间杀虫试验
将培养43h凝结芽胞杆菌的发酵液，9000r/min下离心12min，弃上清液，取菌泥，对无菌水配成含有7×1010cfu/mL菌悬液，加入表面活性剂十二烷基葡萄糖苷(APG)，控制其浓度为0.7g/L，得到凝结芽胞杆菌CGMCC No.6681菌悬液。
采用喷洒叶面的方式进行田间试验，按1000ml/500m2用量使用，将大田分为8个区，每一处理2个小区重复，单小区试验，每个小区20m2，各处理按完全随机区组排列。选取试验对象为辣椒，每个小区采样10株，与多菌灵、无菌水的对照组相比较，分别于20d和40d统计蚜虫的危害程度进行分级后计算防效，并统计增产率(％)。
试验结果见表2：
表2 Bacillus coagulans CGMCC 6681对黄瓜蚜虫的防治效果
③Bacillus coagulans CGMCC No.6681田间促生实验
将培养43h凝结芽胞杆菌的发酵液，9000r/min下离心12min，弃上清液，取菌泥，对无菌水配成含有7×1010cfu/mL菌悬液，加入0.7g/L表面活性剂十二烷基葡萄糖苷(APG)，得到凝结芽胞杆菌CGMCC No.6681菌悬液。
采用喷洒叶面的方式进行田间试验，按1000ml/500m2用量使用，将大田分为8个区，每一处理2个小区重复，单小区试验，每个小区20m2，各处理按完全随机区组排列。选取试验对象为辣椒，每个小区采样10株，与无菌水的对照组相比较，分别于20d和40d对形态指标进行测定(株高、干鲜重)，并统计增产率(％)。
试验结果见表3：
表3 Bacillus coagulans CGMCC 6681对辣椒促生的田间效果
实例3：
将凝结芽胞杆菌CGMCC No.6681菌种接到固体培养基(蛋白胨15.00g/L，酵母膏8.00g/L，氯化钠8.00g/L，琼脂粉20.00g/L，pH 7.2)平板中，设定温度为38℃，培养时间为45h。
从培养好的平板中挑取一个单菌落，接入到种子培养基(葡萄糖60.00g/L， 蛋白胨15.00g/L，酵母膏8.00g/L，pH 8.0(葡萄糖分消))中，三角瓶种子培养基的装液量(v/v)为15％，在迴转式恒温调速摇瓶柜中，38℃，180r/min条件下摇床培养20h。将种子培养液以7％(v/v)接种量转接到发酵培养基(葡萄糖25.00g/L、蛋白胨12.00g/L、酵母膏15.00g/L、MnSO4·H2O 0.0003g/L、CaCO30.05g/L，pH 8.0(葡萄糖分消))三角瓶中，三角瓶发酵培养基的装液量(v/v)为15％，在迴转式恒温调速摇瓶柜中以180r/min，38℃条件下培养45h。取培养45h凝结芽胞杆菌的发酵液，10000r/min下离心15min，弃上清液，取菌泥，对无菌水配成含有8×1010cfu/mL菌悬液，加入表面活性剂吐温80，控制吐温80在菌悬液中的浓度为0.8g/L，得到凝结芽胞杆菌CGMCC 6681菌悬液。
待活化好的病原菌菌落长至一元硬币大小时，用打孔器(d＝6mm)在活化好的病原真菌的菌落边缘打取菌丝块，将菌丝块挑入PSA平板中线1/3处，培养45h后，在同一条中线1/3处打好的孔中接入20μL的生防菌凝结芽胞杆菌菌悬液。接种后的培养皿置于28℃温度下培养，待发酵液干了之后倒置，每处理重复3次，以只接病原菌的培养基作为对照。
试验结果：以多菌灵做对照试验。Bacillus coagulans CGMCC 6681对几种不同真菌病原菌抑菌效果，结果见表1。
表1 不同药剂的抑菌率
由表1可知凝结芽胞杆菌菌悬液可以有效抑制番茄灰霉病、棉花黄萎病、番茄叶霉病、甘蓝黑斑病和油菜菌核病病原菌。其中对番茄灰霉的防治效果最好，抑制率为70.45％。
②Bacillus coagulans CGMCC No.6681田间杀虫试验
将培养45h凝结芽胞杆菌的发酵液，10000r/min下离心15min，弃上清液，取菌泥，对无菌水配成含有8×1010cfu/mL菌悬液，加入表面活性剂吐温80，控制其浓度为0.8g/L，得到凝结芽胞杆菌CGMCC 6681菌悬液。
采用喷洒叶面的方式进行田间试验，按1000ml/500m2用量使用，将大田分为8个区，每一处理2个小区重复，单小区试验，每个小区20m2，各处理按完 全随机区组排列。选取试验对象为辣椒，每个小区采样10株，与多菌灵、无菌水的对照组相比较，分别于20d和40d统计蚜虫的危害程度进行分级后计算防效，并统计增产率(％)。
试验结果见表2：
表2 Bacillus coagulans CGMCC 6681对黄瓜蚜虫的防治效果
③Bacillus coagulans CGMCC No.6681田间促生实验
将培养45h凝结芽胞杆菌的发酵液，10000r/min下离心15min，弃上清液，取菌泥，对无菌水配成含有8×1010cfu/mL菌悬液，加入表面活性剂吐温80，控制其浓度为0.8g/L，得到凝结芽胞杆菌CGMCC 6681菌悬液。
采用喷洒叶面的方式进行田间试验，按1000ml/500m2用量使用，将大田分为8个区，每一处理2个小区重复，单小区试验，每个小区20m2，各处理按完全随机区组排列。选取试验对象为辣椒，每个小区采样10株，与无菌水的对照组相比较，分别于20d和40d对形态指标进行测定(株高、干鲜重)，并统计增产率(％)。
试验结果见表3：
表3 Bacillus coagulans CGMCC 6681对辣椒促生的田间效果

Claims (8)

1.一种凝结芽胞杆菌菌悬液的制备方法，其具体步骤如下：
A.菌种活化：将凝结芽胞杆菌CGMCC No.6681菌株接到固体培养基平板中，设定温度为34～38℃，培养时间为40～45h；
B.种子培养：从步骤A培养好的平板中挑取一个单菌落，转接到装有种子培养基的三角瓶中，在迴转式恒温调速摇瓶柜中，34～38℃，140～180r/min条件下摇床培养12～20h得到种子培养液；
C.发酵培养：是将种子培养液转接到装有发酵培养基的三角瓶中，在迴转式恒温调速摇瓶柜中以140～180r/min，34～38℃条件下培养40～45h，得发酵液；其中种子培养液与发酵培养基的体积比为0.02～0.07：1；
D.表面活性剂的添加：将步骤C发酵培养得到的发酵液离心，弃上清液，取菌泥，对无菌水配成含有5×1010～8×1010cfu/mL菌悬液，再加入表面活性剂，得到凝结芽胞杆菌菌悬液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤A中所述的固体培养基组分为：蛋白胨10.00-15.00g/L，酵母膏5.00-8.00g/L，氯化钠5.00-8.00g/L，琼脂粉18.00-20.00g/L，pH 7.0～7.2。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤B中所述的种子培养基组分为：葡萄糖50.00-60.00g/L，蛋白胨10.00-15.00g/L，酵母膏5.00-8.00g/L，pH 7.5-8.0。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤C中所述的发酵培养基组分为：葡萄糖22.00-25.00g/L、蛋白胨10.00-12.00g/L、酵母膏10.00-15.00g/L、MnSO4·H2O 0.0002-0.0003g/L、CaCO30.02-0.05g/L，pH 7.5-8.0。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的表面活性剂为甘油、吐温80或十二烷基葡萄糖苷中的一种；表面活性剂的添加量为表面活性剂在得到凝结芽胞杆菌菌悬液中的浓度为0.5-0.8g/L。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤B中种子培养基的体积占三角瓶体积的5～15％。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤C中发酵培养基的体积占三角瓶体积的5～15％。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤D中离心转速为8000～10000r/min，离心时间为10～15min。
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