CN104560827A - 一种防治烟草青枯病的生防放线菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种防治烟草青枯病的放线菌菌株及其应用方法，属于微生物技术领域。所述的菌株为链霉菌（<i>Streptomyces？sp.</i>）K4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年3月24日，保藏号为CGMCC？NO.8949。该菌株通过产生活性物质抑制烟草青枯病菌的生长，对烟草青枯病表现出较好的防治效果。所述的生防放线菌菌株用于制备生防菌剂，应用时可以在烟苗移栽时随定根水使用；或者移栽4-5天后灌根使用。该菌剂也可与有机肥混合制成菌肥使用。所述菌株K4是从烟田根围土壤中获得，与土壤生态和谐相容，因此在烟草青枯病的生物防治中具有良好的应用前景。

Description

一种防治烟草青枯病的生防放线菌菌株及其应用
技术领域
    本发明属于微生物技术领域，涉及一种防治烟草青枯病的生防放线菌菌株及其应用。
背景技术
烟草青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)侵染引起的一种在世界范围内广泛传播的土传病害。该病菌株系复杂、寄主范围广、极易爆发流行，防治难度较大。烟草青枯病在我国长江流域及其以南地区普遍发生，尤以福建、广东、湖南、贵州等烟区危害较重，重病田块发病率高达90%以上，严重影响烟草的产量和品质，造成重大的经济损失。
目前，在生产中主要通过栽培抗病品种、改善耕作制度和采用化学防治等措施来防治烟草青枯病。但培育抗病品种周期长，且易受环境影响，防治效果不理想。改善耕作制度，采用轮作是目前对抗该病的有效措施，但是在实际生产中很难实现。化学药剂虽在一定程度上可减轻该病的危害，但是防治效果不高，且长期使用化学农药带来的环境污染、农药残留、病菌抗药性不断增强等问题日益突出。因此寻找一种有效、安全的防治措施是当务之急。生物防治具有无毒、无残留、可利用资源丰富等优点，已成为解决土传病害的有效途径。其中，利用拮抗微生物防治植物病害已成为生物防治中的重要方向。迄今为止，筛选出的生防菌主要有假单胞菌、芽孢杆菌、菌根真菌及少数放线菌。但总体来说，我国利用拮抗菌株防治烟草青枯病的研究基础还相对薄弱，特别是高效菌种明显匮乏。
放线菌（Actinomycetes）是一类具有重要经济价值和实用价值的微生物，种类丰富，广泛分布于自然界中。目前从微生物中发现的约8000 种生物活性物质当中，近70% 是由放线菌产生，特别是链霉菌产生的抗生素在农业生产中应用广泛，如中生菌素、阿维菌素等。土壤拮抗放线菌具有对环境友好、效果持久、针对性强等优点，展现出良好的应用前景。因此从烟田根围土壤分离获得对烟草青枯病菌具有拮抗作用的放线菌，对该病害的防治具有重要意义，符合农业的可持续发展要求。
发明内容
本发明的目的在于：针对烟草青枯病病发生面积逐年扩大，化学防治效果不理想，同时带来环境污染的实际情况，提供一种高效防治烟草青枯病的生防放线菌菌株及其应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
本发明首先提供了一种生防放线菌菌株，所述的菌株为链霉菌（Streptomyces sp.）K4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年3月24日，保藏号为CGMCC NO. 8949。
本发明还提供了所述的生防放线菌菌株在制备生防菌剂中的应用。
所述生防菌剂的制备方法如下：所述生防菌剂的制备方法如下：将所述的链霉菌（Streptomyces sp.）K4接种于高氏一号液体培养基中，28 ℃，180 r/min，培养2-3d后，制成种子液，接种于发酵培养基中；发酵培养基的配方为：淀粉2%、葡萄糖1.5%、黄豆粉2%、NaCl 0.3%、CaCO3 0.2%，发酵条件为：接种量10% v /v、装瓶量60mL /250mL、发酵培养基初始pH值8.0、28 ℃，180-200 r/min，培养5-6 d，制成浓度为108CFU/ml的K4菌株发酵液，作为生防菌剂。
以及，所述的生防放线菌菌株在烟草青枯病生物防治中的应用。具体应用为：所述生防菌剂在烟苗移栽时随定根水使用；或者在烟苗移栽4-5天后灌根使用；或者与有机肥混合制成菌肥使用。
灌根使用时，每株50ml，连续使用2-3次，每次间隔8-12天。
本发明的有益效果：
本发明筛选出的生防放线菌K4能够明显抑制烟草青枯病菌的生长。由于是生物制剂，因此没有化学农药的使用带来的一系列问题，对减少农业污染具有重要的作用，而且有利于烟叶的绿色生产。
本发明菌株分离自烟草根围土壤，与土壤生态和谐相容，有利于充分发挥菌株的优势。
盆栽试验结果显示，该生防菌对烟草青枯病的防治效果显著，高达82.91%。同时，该菌株培养条件简单，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1为菌株K4气生菌丝和孢子丝形态（光学显微镜下40×）。
图2为菌株K4孢子形态（电子显微镜7000×）。
图3为菌株K4 依据16SrDNA序列构建的系统发育树。
图4为菌株K4发酵液对烟草青枯病菌的平板抑菌效果图。其中，1为优化之前的抑菌效果，2和3为优化之后的抑菌效果。
图5为菌株K4对烟草青枯病的温室盆栽控病作用。其中，左边为施用K4发酵液，右边为清水对照。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步阐述，但并不是对本发明的限制。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
一株生防放线菌，菌种命名为K4，分类命名：链霉菌（Streptomyces sp.），其保藏编号：CGMCC No. 8949，保藏日期：2014年3月24日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例一拮抗放线菌的筛选
具体过程如下：
1、土壤样品的采集
从福建省政和县采集不同烟田地块5-20cm深处的根围土壤，共4份，分装标记后带回实验室，待自然风干后分离。
2、放线菌的分离
采用平板稀释法进行分离。称取土壤样品10g，倒入装有小玻璃珠和90ml无菌水的三角瓶中，震荡30min后静置5分钟，依次稀释10倍，分别配制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的悬浮液，吸取不同浓度的悬浮液各0.1ml加到高氏一号培养基（加入终浓度为50mg /L 的K2GrO7）平板上，均匀涂布后置于28℃培养观察，5-7天后挑取不同的单菌落划线纯化。将纯化后的菌株转接到高氏一号斜面培养基上培养，4℃保存备用，共分离得到126株放线菌。
3、拮抗放线菌的筛选
采用琼脂块法对分离得到的放线菌进行抑菌活性的初筛。将放线菌接种于高氏一号培养基上培养5d后，用灭过菌的直径6 mm的打孔器打出若干菌饼，挑取一块放入PDA平板中央，于28 ℃ 培养4 d后，倒入含烟草青枯病菌(108CFU/ml )的NA 培养基10mL，待凝固后置于28 ℃， 2d后记录抑菌圈的大小和有无，重复3 次。经初筛发现有15株放线菌对烟草青枯病菌具有不同程度的抑制作用（表1），其中菌株P10、P12、K2、K4、K13和K24 对烟草青枯病菌的抑菌圈直径都在30mm 以上。
表1 15株放线菌对烟草青枯病菌的抑制作用
注：同列不同小写字母表示数值间差异显著（P <0.05）
实施例二发酵液抑菌活性的测定
采用杯碟法对初筛得到的抑菌圈直径都在30mm以上的6株放线菌进行复筛。将菌株接种于种子培养基中，28℃摇瓶发酵2d 后，以5%的接种量接入发酵培养基中，28 ℃、200 r/min培养6d，发酵液于8000 r/min离心5 min，细菌过滤器过滤后得到无菌发酵液。在混好烟草青枯病菌(108CFU/ml) 的NA 平板中央打孔，孔内加入100 μl无菌发酵液，28℃培养2 d 后测量抑菌圈直径，重复3次。结果显示（表2），菌株P12和K4的抑菌圈都在20mm以上，其中K4发酵液的抑菌效果最强，抑菌圈直径达到25mm。通过以上两步筛选确定菌株K4的抑菌活性最强且效果稳定。
表2 6株放线菌发酵液对烟草青枯病菌的抑制作用
注：同列不同小写字母表示数值间差异显著（P <0.05）
实施例三菌株K4的鉴定
1、形态特征观察
将菌株K4划线接种在高氏一号培养基上，以45度角斜插入无菌盖玻片，28℃培养7d 后，取出盖玻片在光学显微镜和电子显微镜下观察菌丝和孢子的形态特征。发现菌株K4 的孢子丝螺旋状，常成簇生，孢子丝断裂成分生孢子，孢子椭圆形，表面粗糙（图1和图2）。
2、培养特征观察
采用《链霉菌鉴定手册》推荐的8种培养基，将菌株K4 于28℃培养7-10d后观察菌体生长情况，记录气生菌丝、基内菌丝的颜色以及是否产生可溶性色素。菌株K4在高氏一号培养基、察贝克培养基、PDA培养基、葡萄糖酵母膏培养基和燕麦培养基上生长良好，基内菌丝和气生菌丝发育良好；而在克氏一号培养基、淀粉铵培养基和葡萄糖天门冬素培养基上生长较差，在上述8种培养基上均无可溶性色素产生(表3)。根据以上形态特征分析，对照链霉菌鉴定手册，将K4初步鉴定为链霉菌粉红孢类群。
表3 菌株K4在不同培养基上的培养特征
3、16S rDNA 序列分析
细菌基因组提取试剂盒提取菌株K4基因组DNA后，采用通用引物F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，进行 16S rDNA 的PCR扩增。 回收PCR扩增产物，经连接、转化、鉴定后，阳性克隆送生工生物工程（上海）有限公司测序，序列全长为1555 bp。将所得序列提交到GenBank 数据库进行BLAST 分析比对，发现与K4同源性较高的菌株均属于链霉菌属，选取12个典型菌株的16S rDNA 序列用MEGA 5.0 软件构建系统发育树（图3）。结果表明，菌株K4与Streptomyces vinaceus 和 Streptomyces caelestis 属于同一分支，其中与菌株Streptomyces vinaceus相似性达到99.7%，并结合形态学特征和培养特征，将菌株K4 鉴定为酒红链霉菌（Streptomyces vinaceus）。
实施例四 K4菌株发酵工艺的优化
将上述菌株接种于高氏一号液体培养基中，28 ℃，180 r/min，培养2 d后，制成种子液。取6ml种子液接种于发酵培养基中。通过对碳源、氮源的筛选以及营养条件单因子试验和正交试验后，得到该菌株的最佳发酵配方为：淀粉2%、葡萄糖1.5%、黄豆粉2%、NaCl 0.3%、CaCO3 0.2%。通过对培养条件的摸索，得到最佳发酵条件为：接种量10% ( v /v)、装瓶量60mL /250mL、发酵培养基初始pH值8.0、28 ℃，200 r/min，培养5 d，得到浓度为108CFU/ml的K4菌株发酵液。经优化后抑菌圈直径达到34mm，比优化前提高了36%（图4）。
实施例五菌株K4温室盆栽防效试验
烟草品种为红花大金元。将催芽后的种子点播到至育苗盘，12天左右后移栽至盆钵中，每盆1株，置于26℃温室中培养。移栽4天后，每株苗浇灌50ml K4菌株发酵液（108个孢子/ml）。24h后灌根接种烟草青枯病菌，接种浓度107 cfu/mL，每株20ml。接种病原菌后第4天进行第二次发酵液处理。以72%农用链霉素灌根处理的植株作为农药对照，以发酵培养基和清水处理的植株作为空白对照。每个处理9株苗，每处理3次重复。待发病后每天调查发病情况，统计发病率和病情指数，直至清水对照发病率达到90%以上时结束实验。
病情分级标准如下：
0级：植株叶片无萎蔫症状；
1级：植株总体1/5以下的叶片出现萎蔫症状；
2级：植株总体1/5—1/3叶片出现萎蔫症状；
3级：植株总体1/3以上2/3以下叶片出现萎蔫症状；
4级：全株萎蔫死亡。
发病率（%）=发病株数／总株数×100%
病情指数（%）=[∑病级数×该病级植株数)／(最高病级数×总植株数)]×100%
防治效果（%）=[(对照病情指数－处理病情指数)／对照病情指数]×100%（对照指清水对照处理）
实验结果表明（表4），供试放线菌K4发酵液能够显著降低烟草青枯病的病情指数（图5），防治效果高达82.91%，显著高于72%农用链霉素的防治效果34.56%。另外从表中还可以看出，发酵培养基处理的病情指数略低于清水对照处理的病情指数，但两者差异不显著。温室盆栽实验结果说明，K4菌株能够有效防治烟草青枯病，展现出良好的应用潜力。
表4 放线菌K4对烟草青枯病的盆栽防治效果
    注：同列不同小写字母表示数值间差异显著（P <0.05）。

Claims (5)

1.一种生防放线菌菌株，其特征在于，所述的菌株为链霉菌（Streptomyces sp.）K4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年3月24日，保藏号为CGMCC NO. 8949。
2.如权利要求1所述的生防放线菌菌株在制备生防菌剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述生防菌剂的制备方法如下：将所述的链霉菌（Streptomyces sp.）K4接种于高氏一号液体培养基中，28 ℃，180 r/min，培养2-3d后，制成种子液，接种于发酵培养基中；发酵培养基的配方为：淀粉2%、葡萄糖1.5%、黄豆粉2%、NaCl 0.3%、CaCO3 0.2%，发酵条件为：接种量10% v /v、装瓶量60mL /250mL、发酵培养基初始pH值8.0、28 ℃，180-200 r/min，培养5-6 d，制成浓度为108CFU/ml的K4菌株发酵液，作为生防菌剂。
4.如权利要求1所述的生防放线菌菌株在烟草青枯病生物防治中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述生防菌剂在烟苗移栽时随定根水使用；或者在烟苗移栽4-5天后灌根使用；或者与有机肥混合制成菌肥使用。
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