CN114940962B - 具有促生作用的烟草种子内生菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有促生作用的烟草种子内生菌DW26，保藏编号：CCTCC NO：M2022821，分类命名为Paenibacillus odorifer，保藏于中国典型培养物保藏中心。本发明筛选的具有促生作用的种子内生菌DW26对青枯雷尔氏菌的抑菌效果强，是对烟草青枯病具有良好防治效果的生防细菌，能产生纤维素酶和淀粉酶，也对烟草具有良好的促生效果，能显著提高烟苗生物量，可单用或复配使用，对烟草青枯病生物防治具有广阔的应用前景，还具有影响烟株根际土壤微生物功能多样性的功能，可解决因烟草连作年限增加导致的植烟土壤养分供给和土壤微生态失衡等问题，避免造成烟草生长发育迟缓、质量和产量下降。

Description

具有促生作用的烟草种子内生菌及其应用
技术领域
本发明属于农业微生物防治技术领域，涉及一株具有促生作用的烟草种子内生菌及其应用。
背景技术
青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种毁灭性的土传病害，其病原菌极具破坏性，可侵染超过200种植物，造成巨大的经济损失，诸如使番茄减产0-91％，马铃薯减产33-90％，烟草减产10-30％，香蕉减产80-100％，花生减产20％等。烟草青枯病(Tobacco bacterial wilt)是当前烟草生产中危害严重、防控困难的一种土传病害。烟草青枯病在中国西南烟区为害广泛，并有向高海拔冷凉地区迁移的趋势，是实际生产中亟待解决的植物病害。在我国，由于长期以来烟草连作、施肥和管理方式不当等因素，烟草连作障碍严重、烟草青枯病大面积爆发，严重降低各大烟区烟叶的产质量。
烟草青枯病防治面临着极大挑战。对于烟草青枯病的防治，目前主要有选育抗性品种、生物防治、化学防治等措施。由于化学防治存在危害人类健康和破坏生态平衡等问题，而生物防治具有对人畜安全、环境友好等优点，因此，近年来对土传病害烟草青枯病的生物防治越来越受到重视，用于防治烟草青枯病的生防细菌的研究较为广泛。
目前，对烟草青枯病的防治研究主要集中在诱抗化合物对烟草青枯病的防治效果和机制、青枯病与根际微生物的互作等方面，对植物内生菌与烟草青枯病互作关系的相关研究较少。植物与内生菌协同进化，根据内生菌的作用，将其分为三类：一是中性内生微生物，该类微生物对植物没有明显的有害或者有益作用；二是有益内生微生物，能够发挥保护植物免受病原体或食草生物的侵害、促进植物生长等有益作用；三是潜在病原内生微生物，产生不利于植物生长的物质。所以找到对烟草植株有益内生微生物是亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株具有促生作用等多性能的烟草种子内生菌，还提供其可在农业产业化上的各种应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.具有促生作用的烟草种子内生菌，所述烟草种子内生菌为DW26，分类命名：Paenibacillus odorifer，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉，保藏日期：2022年6月7日，保藏编号：CCTCC NO：M 2022821。
进一步，具有促生作用的烟草种子内生菌的菌株呈白色圆形，不透明，在膨大胞囊内有椭圆形芽孢。
进一步，具有促生作用的烟草种子内生菌的菌株能产生纤维素酶和淀粉酶。
2、上述任一项所述具有促生作用的烟草种子内生菌作为生物菌剂用于抑制和/或防治青枯病中的应用。
进一步，具有促生作用的烟草种子内生菌作为生物菌剂用于抑制和/或防治青枯病中的应用中，生物菌剂中烟草种子内生拮抗菌的使用浓度为1×106cfu/mL-1×1012cfu/mL。
进一步，具有促生作用的烟草种子内生菌作为生物菌剂用于抑制和/或防治青枯病中的应用中，所述生物菌剂的制备方法为：将烟草种子内生菌DW26菌株活化后，挑取单菌落接种至LB液体培养基，30℃、180r/min培养至对数期，使用无菌水稀释至1×106cfu/mL-1×1012cfu/mL对植株进行灌根处理。
优选的，使用无菌水稀释至1×108cfu/mL对植株进行灌根处理。
3、上述任一项所述的具有促生作用的烟草种子内生菌作为生物菌剂用于促进烟株植株生长中的应用。
进一步，具有促生作用的烟草种子内生菌作为生物菌剂用于促进烟株植株生长中的应用中，生物菌剂中烟草种子内生拮抗菌的使用浓度为1×106cfu/mL-1×1012cfu/mL。
进一步，具有促生作用的烟草种子内生菌作为生物菌剂用于促进烟株植株生长中的应用中，所述生物菌剂的制备方法为：将烟草种子内生菌DW26菌株活化后，挑取单菌落接种至LB液体培养基，30℃、180r/min培养至对数期，使用无菌水稀释至1×106cfu/mL-1×1012cfu/mL对植株进行灌根处理。
4、一种生物菌剂，包含具有促生作用的烟草种子内生菌，菌株名称为DW26，分类命名：Paenibacillus odorifer，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉，保藏日期：2022年6月7日，保藏编号：CCTCC NO：M 2022821。
本发明的有益效果在于：本发明在实验室前期工作的基础上，通过室内灌根接种和田间病圃两种方法系统筛选了不同烟草品种对青枯病的抗病性表型；采用Illumina高通量测序技术系统比较了不同抗性表型的烟草种子内生细菌群落特征；进一步通过多种培养基分离、纯化并筛选出抗性烟草品种种子内生拮抗细菌，并验证内生拮抗细菌对烟草青枯病的防控效果以及这些内生拮抗细菌对烟草幼苗生长。本发明从前期筛选纯化的种子内生细菌328株中层层筛选出5株烟草种子内生拮抗细菌，对青枯雷尔氏菌都具有一定的拮抗作用，且有不同的促生效果。其中，生防效果最佳的为菌株G3-KB-15(DW15)和菌株6036-R2A-26(DW26)，在强致病力青枯雷尔氏菌CQPS-1的浸染下，菌株6036-R2A-26在接菌处理后7-15天的平均防效均在60％以上，在接菌后19天(发病末期)的平均防效仍能达到51.09％，菌株6036-R2A-26表现出良好的拮抗作用，对烟草的青枯病具有较好的抑制或防治青枯病作用。
本发明筛选的烟草种子内生菌6036-R2A-26能产生纤维素酶和淀粉酶，破坏病原菌细胞壁，从而杀死或抑制病原菌，协同起到较好的生防作用。且该菌株有一定的生物膜形成能力，说明该菌株具有良好的定殖能力。
菌株6036-R2A-26的菌悬液进行浸种处理，还可有效地促进烟草种子萌发，发酵液连续灌根能够显著提高地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重、地下部干重、最大根长、SPAD等烟苗生物量，有效促进烟草苗期生长，达到烟草早生快发的作用。菌株6036-R2A-26还具有影响烟株根际土壤微生物功能多样性的功能，可解决因烟草连作年限的增加导致的植烟土壤养分供给和土壤微生态失衡等问题，避免造成烟草生长发育迟缓、质量和产量下降。因此，本发明筛选出的内生拮抗细菌具有广阔的应用前景，对于实际生产应用中缓解连作障碍具有一定的指导意义。
保藏信息
菌株名称：DW26，分类命名：Paenibacillus odorifer，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉，保藏日期：2022年6月7日，保藏编号：CCTCC NO：M 2022821。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为不同烟草品种的青枯病室内发病情况。
图2为不同烟草品种的青枯病室内病情指数。
图3为不同烟草品种的烟草青枯病田间发病率和病情指数。
图4为不同烟草品种的烟草青枯病田间表现。
图5为不同烟草品种基于病情指数的病程进展曲线下面积。
图6为部分筛选和纯化的抗性烟草品种种子内生细菌。
图7为筛选的不同内生拮抗细菌的单菌落图。
图8为筛选的不同内生拮抗细菌的生物膜形成能力。
图9为筛选的不同内生拮抗细菌分泌胞外酶形成的透明圈。
图10为筛选的不同内生拮抗细菌在Ashby培养基上的生长情况。
图11为筛选的不同内生拮抗细菌处理对烟苗生物量的影响。
图12为筛选的不同内生拮抗细菌发酵液灌根处理对青枯病病情指数的影响。
图13为筛选的不同内生拮抗细菌发酵液灌根处理对青枯病的防治效果。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1、材料和方法：
本发明经前期多品种抗性筛选评价基础上，进一步筛选出6个烟草品种进行室内灌根接种和田间病圃的青枯病综合抗性评价，为后续抗感烟草品种种子内生细菌群落特征分析奠定基础。本实施例以不同烟草品种的四叶一心烟苗为研究对象，采用青枯菌CQPS-1灌根接种，以此评价不同烟草品种对青枯病的抗病性表型。
供试烟草种子：供试烟草品种于2020年5月种植于重庆市彭水县润溪乡茶树坪试验小区(海拔1360m，北纬29°7′43″、东经107°56′38″)。开花前选择具备各品种典型性状的标准株15-20株，疏花疏果后套袋留种；果皮变褐时采收，晾干，脱粒，密封于-20℃冰箱备用。各品种原始信息如表1所示。
表1供试品种原始材料信息
Figure BDA0003726784610000041
供试病原菌为本研究室由重庆市彭水县白果坪村(海拔1210m，北纬29°8′12″、东经107°56′31″)发病烟株中分离得到的强致病力青枯雷尔氏菌CQPS-1(Ralstoniasolanacearum)(简称为青枯菌)。
BG培养基：细菌蛋白胨10g/L、酪蛋白氨基酸1g/L、酵母膏1g/L、琼脂粉15g/L、葡萄糖5g/L。灭菌后冷却至约55℃时，加入1％TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)水溶液，使其终浓度为0.005％，
B液体培养基：细菌蛋白胨10g/L、酵母膏1g/L、酪氨酸蛋白胨1g/L。
所有培养基成分混装后，高压蒸汽灭菌(灭菌条件：121℃，20min，下同)。
烟草培育：使用上述收集的各烟草品种种子进行漂浮育苗，育苗条件为：温度25℃，相对湿度60％，光照与黑暗时间比为14/10h，培养至四叶一心备用。
青枯菌接种液的制备：将青枯菌于BG平板上划线活化，于30℃培养48h，挑选单菌落转接于B液体培养基，振荡培养(30℃、180r/min)至对数期(OD600nm＝0.8-1.0)。随后稀释至OD600nm＝0.1(108CFU/mL)备用。
灌根法接种菌悬液：对每株烟苗灌根接种108CFU/mL的10mL青枯菌菌悬液，每个处理重复4次，每个重复8株烟苗。接种病原菌后，置于温度30℃、相对湿度75％、光照与黑暗时间比为14/10h的温室内培养。
烟草青枯病病害调查：参照郑继法等人的室内调查分级标准，于发病初期开始系统调查不同品种发病情况，每隔一天调查一次，直至发病末期，计算发病率与病情指数。
Figure BDA0003726784610000051
Figure BDA0003726784610000052
不同烟草品种对青枯病的室内抗性评价标准如下：病情指数为0-20：高抗(HR)；病情指数为21-40：抗病(R)；病情指数为41-60：中抗(MR)；病情指数为61-80：低抗(LR)；病情指数为81-90：感病(S)；病情指数为91-100：高感(HS)。
数据分析：使用Excel 2016整理汇总数据，使用IBM SPSS Statistics 23进行方差分析以及显著性检验(P<0.05)，使用Origin 2017和GraphPad Prism9绘图。
2、结果与分析：
不同烟草品种的青枯病发病情况：接菌浓度为108CFU/mL时，其发病末期(接菌后23d)情况如图1，整个调查时期的病情指数如图2所示。由于接菌浓度相对较高，且供试病原菌为强致病力菌株，不同品种烟草发病较为严重。在接菌后5d，各烟草品种开始逐渐发病。随着时间推移，各品种病情指数逐渐提高，但在整个病害调查期间，品种HD、K326和YY87的病情指数均大于品种6036、YY97和G3。接菌后23d为发病末期，品种HD、K326和YY87平均病情指数分别为95.83、95.83和91.67，显著高于品种6036、YY97和G3的平均病情指数(分别为66.44、64.58和60.42)。综合整个调查时期的病情指数分析，各烟草品种对青枯病的抗性由高到低依次为：G3>YY97>6036>YY87>HD≥K326。
不同烟草品种的青枯病抗性等级：对发病末期(接菌后23d)的病情指数进行抗性等级划分的结果如表2所示。由于所用病原菌为强致病力菌株，因此接菌浓度为108CFU/mL时，各品种的病情指数较高，G3表现为中抗(MR)，6036和YY97表现为低抗(LR)，K326、YY87和HD的病情指数显著高于其他品种，表现为高感(HS)。
表2不同烟草品种青枯病抗性等级划分
Figure BDA0003726784610000061
实施例2
不同烟草品种对青枯病的田间抗性评价：烟草种子同实施例1，采用漂浮育苗，按当地相关技术标准进行统一大田移栽和后期管理。试验地选取重庆市彭水县润溪乡白果坪村的常年连作且烟草青枯病较为严重的平整地块(海拔1210m，北纬29°8′12″、东经107°56′31″)。不同品种设置3个小区重复，共计18个小区，随机区组设计，每个小区种植40株烟草。
烟草青枯病田间调查：
烟草青枯病的调查与分级标准参考国家标准GB/T 23222-2008《烟草病虫害分级及调查方法》进行。在青枯病发病初期开始调查，每隔5-7d调查一次，直至采收后期。计算发病率、病情指数与病程进展曲线下面积(Area Under the Disease Progress Curve，AUDPC)：
Figure BDA0003726784610000062
Figure BDA0003726784610000063
Figure BDA0003726784610000064
(Xi为第i次调查时的病情指数，ti为第i次调查时的日期)
不同品种田间抗性评价标准参考GB/T 23224-2008《烟草品种抗病性鉴定》，具体如下：病情指数为0：高抗或者免疫(I)；病情指数为0.1-20：抗病(R)；病情指数为20.1-40：中抗(MR)；病情指数为40.1-60：中感(MS)；病情指数为60.1-80：感病(S)；病情指数为80.1-100：高感(HS)。
不同烟草品种的青枯病发病情况：自青枯病零星发生时，系统调查不同烟草品种的青枯病发生情况，其发病率和病情指数分别如图3所示，其中a：发病率，b：病情指数。发病中期(2021.07.28)和发病中后期(2021.08.07)的田间表现如图4所示，其中a：发病中期；b：发病中后期。随着时间推移，烟草青枯病的发病率和病情指数逐渐提高。受高温高湿气候的影响，品种HD、YY87和K326在发病中后期的发病率和病情指数大幅增加。综合整个生育期的发病情况，不同品种的发病率和病情指数均表现为：HD>YY87>K326>G3>6036>YY97。
不同烟草品种的青枯病抗性等级
基于病情指数的病程进展曲线下面积(AUDPC)结果如图5所示。结果表明，病程进展曲线下面积(AUDPC)由大到小依次为：HD、YY87、K326、G3、6036、YY97，其中品种HD、YY87、K326显著高于品种G3、6036、YY97，品种HD、YY87、K326之间存在显著差异，品种G3、6036、YY97之间无显著差异，综合来看，不同烟草品种对青枯病的抗性表现为：YY97>6036>G3>K326>YY87>HD。对烟草不同生育期和发病时期的病情指数进行抗性等级划分结果如表3所示。打顶期(7月16日)处于发病中期，HD的病情指数最大，表现为中抗，其他品种表现为抗病。采收中后期(8月16日)处于发病高峰期，HD的病情指数最大，表现为感病；YY87的病情指数次之，表现为中感；K326的病情指数居中，表现为中抗；其他品种则表现为抗病。采收后期(8月22日)处于发病末期，HD的病情指数最大且显著高于其他品种，表现为感病；YY87的病情指数次之，表现为中感；K326和G3的病情指数表现为中抗，其他品种则表现为抗病。
表3不同烟草品种的青枯病抗性等级划分
Figure BDA0003726784610000071
注：病情指数：均值±标准误，字母不同表示各处理在0.05水平上差异显著。
实施例3
不同抗性烟草品种种子内生细菌结构特征分析：烟草种子同实施例1，将消毒合格的种子转移至无菌研钵，添加液氮研磨3-5min，直至将种子磨碎。每个重复称取0.5g研磨后种子，使用FastDNATMSPIN试剂盒，按照操作说明提取DNA。
建立PCR序列库及Illumina高通量测序：
首先检验DNA完整性、检测DNA浓度和纯度。质检合格后，对种子内生细菌16S rDNA的V5-V7可变区进行PCR扩增。
PCR反应体系为20μL：4μL 5×FastPfu Buffer，2μL 2.5mM dNTPs，0.8μL ForwardPrimer(5μM)，0.8μL Reverse Primer(5μM)，0.4μL FastPfu Polymerase，0.2μl BSA，10ngTemplate DNA，补足ddH2O至20μl。
扩增程序为两轮巢式PCR：第一轮扩增使用引物799F(AACMGGATTAGATACCCKG，5’-3’)和1392R(ACGGGCGGTGTGTRC,5’-3’)，以提取的DNA为模板，对内生细菌16SrDNA的V5-V8可变区进行PCR扩增，95℃预变性3min，27个循环(95℃变性30s，55℃退火30s,72℃延伸45s)，最后72℃延伸10min；第二轮以第一轮扩增产物为DNA模板，使用引物799F(AACMGGATTAGATACCCKG,5’-3’)和1193R(ACGTCATCCCCACCTTCC,5’-3’)，对16S rDNA V5-V7可变区进行PCR扩增，13个循环，其余条件同第一轮扩增。扩增产物质检合格后，委托上海美吉生物医药科技有限公司进行Illumina MiSeq测序。
本实施例对筛选出的不同青枯病抗性表型的烟草品种种子内生细菌进行高通量测序分析，共得到405651条优化序列片段，为内生细菌群落组成和多样性分析及抗性品种种子内生生防细菌挖掘提供了充分的数据基础。高通量测序分析结果：(1)Beta多样性分析结果表明，抗性与感病品种间烟草种子内生细菌群落结构存在较大差异。(2)抗性品种G3、YY97和6036的厚壁菌门相对丰度显著高于感病品种，分别是感病品种YY87的2.34、5.58和8.46倍，是感病品种HD的1.54、3.68和5.58倍；抗性品种YY97和6036的放线菌门相对丰度显著高于感病品种，分别是感病品种YY87的2.77倍和2.40倍，是感病品种HD的2.59倍和2.24倍。(3)不同烟草品种种子的内生细菌群落在属水平的组成较为相似，但相对丰度存在较大差异。对抗感品种间相对丰度存在显著性差异的细菌属进行分析，抗性品种G3的unclassified_f__Enterobacteriaceae相对丰度最高，显著高于感病品种HD；抗性品种G3和YY97的假单胞菌属(Pseudomonas)相对丰度较高，显著高于感病品种YY87；抗性品种G3、6036和YY97的类芽孢杆菌属(Paenibacillus)相对丰度显著高于感病品种；抗性品种6036的芽孢杆菌属(Bacillus)相对丰度最高，显著高于感病品种。
实施例4
本实施例在对不同烟草品种抗性表型评价和对种子内生细菌结构特征系统分析的基础上，进一步对抗性品种G3、YY97和6036种子内生可培养细菌进行分离纯化和筛选，并评价种子内生拮抗细菌的相关特性，以获得种子内生生防菌资源。
烟草种子同实施例1，供试培养基(所有培养基成分混装后，高压蒸汽灭菌)：
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。
BG培养基：同前。
NA培养基：蛋白胨5g/L，酵母膏1g/L，牛肉膏3g/L，葡萄糖10g/L，琼脂15g/L。(英国OXOID公司)
TSA培养基：胰蛋白胨15g/L，大豆胨5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L。(海博生物技术有限公司)
KB培养基：蛋白胨20g/L，K2SO4 10g/L，MgCl2 1.4g/L，甘油10g/L，琼脂15g/L。
R2A培养基：细菌蛋白胨0.5g/L，可溶性淀粉0.5g/L，酵母提取物0.5g/L，葡萄糖0.5g/L，酪蛋白氨基酸0.5g/L，KH2PO4 0.3g/L，丙酮酸钠0.3g/L，MgSO4 0.024g/L，琼脂15g/L。
1、内生细菌的分离纯化
采用稀释平板涂布法，称取2g表面消毒后的不同烟草品种种子置于研钵内充分研磨，加入8mL无菌水混匀。静置5min，吸取100μL上清液加入900μL无菌水进行稀释，记为10-2，按此方法梯度稀释至10-3、10-4和10-5。分别取每一稀释梯度的稀释液各100μL于NA、TSA、R2A和KB平板上，使用玻璃珠均匀涂布，每一浓度、每种类型平板设置3个重复，倒置于30℃培养2-5d，持续观察其生长情况，依据菌落形态、颜色、透明度等表型差异，挑选不同代表菌株进行命名(命名规则为品种—培养基—序号)，并挑取单菌落于相应的平板上继续划线纯化3-4次，直至平板上的菌落一致、无杂菌，视为纯化完成。
依据在不同培养基上的表型差异进行划线纯化，最终获得品种YY97的细菌101株，品种6036的细菌115株，品种G3的细菌112株，共获得所有抗性品种种子内生细菌328株。图6为部分抗性烟草品种种子内生细菌。对纯化完成的菌株，使用无菌棉签刮取单菌落，置于盛有25％甘油的1.5mL离心管中，于-80℃超低温保存。
2、拮抗细菌筛选
(1)平板抑菌活性筛选
将纯化后保存的细菌采用喷菌法进行拮抗菌株初步筛选。首先挑取单菌落点接于NA平板中央，各菌株重复3次。30℃倒置过夜培养，使用无菌喷壶将OD600nm＝0.1(108CFU/mL)的青枯菌液均匀喷涂于NA平板，30℃倒置培养24h后采用十字交叉法测量抑菌圈直径。选取抑菌圈较大的菌株进行继代培养，重复检测其抑菌稳定性，最终确定平板抑菌效果较好且稳定的潜在拮抗细菌。通过对抗性品种种子内生细菌进行平板抑菌活性评价，最终选取抑菌圈效果较好且稳定的细菌如表4所示。抗性品种种子内存在较多的潜在拮抗细菌，其中品种YY97为3株，品种G3为7株，品种6036为5株。
(2)盆栽效果评价筛选
以筛选获得的平板抑菌活性较好的菌株为材料，进行盆栽效果评价。挑取潜在拮抗细菌的单菌落转接于LB培养基振荡培养，挑取青枯菌的单菌落转接于B液体培养基振荡培养，分别震荡培养至OD600nm＝0.8-1.0，无菌水稀释至OD600nm＝0.1(108CFU/mL)备用。
首先进行潜在拮抗细菌发酵液灌根处理(108CFU/mL、10mL/株)，接菌后3d灌根青枯菌(108CFU/mL、10mL/株)，置于温度30℃、相对湿度75％、光照与黑暗时间比为14/10h的温室内培养，每个处理2个重复，每个重复8株烟苗。自发病初期开始调查烟草青枯病发病情况，每两天调查一次，病害调查方法同实施例1的烟草青枯病病害调查。
对筛选出的15株潜在内生拮抗细菌进行盆栽活性评价，结果发现平板抑菌圈直径大的菌株，温室生防效果不一定好，由此说明生防效果与平板抑菌圈的大小并不一定呈正相关关系。通过多次重复的盆栽试验，最终选择效果较好且稳定的5个内生拮抗细菌(YY97-KB-20、G3-NA-3、G3-KB-15、6036-KB-29、6036-R2A-26)进行后续实验。
表4潜在拮抗细菌抑菌效果评价
Figure BDA0003726784610000101
Figure BDA0003726784610000111
4、内生拮抗细菌菌落形态观察
将筛选出的内生拮抗细菌于对应的平板上划线活化，30℃培养36h，观察单菌落外观形态特征。
不同内生拮抗细菌的单菌落如图7所示。菌株YY97-KB-20呈白色圆形，表面湿润光滑；菌株G3-NA-3呈白色圆形，表面湿润光滑，微隆起；菌株G3-KB-15呈黄色圆形，表面湿润光滑，微隆起；菌株6036-KB-29呈乳白色，边缘不规则且不透明，菌落表面不光滑，有褶皱隆起；菌株6036-R2A-26呈白色圆形，不透明，在膨大胞囊内有椭圆形芽孢。
5、内生拮抗细菌分子鉴定
(1)细菌基因组DNA提取
挑取单菌落转接于LB液体培养基中，30℃、180r/min培养12-14h，离心收集菌体，使用细菌DNA提取试剂盒进行DNA提取。
(2)PCR扩增
以提取的总DNA为模板，使用细菌16S rDNA扩增通用引物27F和1429R、gyrA基因扩增引物GyrA-F和GyrA-R、gyrB基因扩增引物GyrB-F和GyrB-R进行扩增。表5为各细菌测序引物序列。
PCR反应程序：95℃预变性5min，34个循环(95℃变性30s，54℃退火30s,72℃延伸1min)，72℃延伸10min，4℃。PCR反应体系为25μL：模板DNA 1.0μL；上游和下游引物各1.0μL；2×Taq Master Mix 12.5μL；ddH2O 9.5μL。
表5细菌测序引物序列
Figure BDA0003726784610000112
PCR产物测序：
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测合格后，委托华大基因有限公司测序。测序结果通过NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库进行BLAST同源性比较，并使用MEGA X软件，采用Neighbor-Joining(NJ)法构建系统发育树，用自展法(Bootstrap)进行检验，自展数据集为1000次。
16S rRNA和gyrA基因或gyrB基因序列分析相结合能对目标细菌进行更准确的分子鉴定。不同内生拮抗细菌所获得的目标基因序列在GenBank数据库经过BLAST比对并构建系统发育树。结果表明，YY97-KB-20菌株为防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)，G3-NA-3菌株为阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)，G3-KB-15菌株为副黄假单胞菌(Pseudomonas parafulva)，6036-KB-29菌株为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，6036-R2A-26菌株为Paenibacillus odorifer。
将菌株G3-KB-15命名为DW15，分类命名：副黄假单胞菌Pseudomonas parafulva，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉，保藏日期：2022年6月7日，保藏编号：CCTCCNO：M 2022820。
将菌株6036-R2A-26命名为DW26，分类命名：Paenibacillus odorifer，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉，保藏日期：2022年6月7日，保藏编号：CCTCC NO：M2022821。
实施例5
对实施例4筛选的内生菌抗性相关特性(生物膜形成能力、分泌胞外酶能力、解磷和固氮能力)进行特性研究。
供试培养基(所有培养基成分混装后，高压蒸汽灭菌)：
酵素培养基：在LB固体培养基中加入1％酪蛋白。
CMC培养基：羧甲基纤维素钠20g/L，KNO3 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，琼脂15g/L。
淀粉琼脂培养基：可溶性淀粉2g/L、牛肉膏5g/L、细菌蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、琼脂20g/L。
革兰氏碘液：碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300mL。
NBRIP培养基：葡萄糖10g/L，KCl 0.2g/L，Ca3(PO4)25g/L，(NH4)2SO4 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，MgCl·6H2O 5g/L，琼脂20g/L。
Ashby培养基：KH2PO4 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，NaCl 0.2g/L，CaCO3 5g/L，甘露醇10.0g/L，CaSO4·2H2O 0.1g/L，琼脂18g/L。
1、内生拮抗细菌生物膜形成能力评价
使用结晶紫染色方法，利用生物膜能与染料结晶紫结合的特性，测定不同细菌的生物膜。将不同拮抗细菌的单菌落转接于LB液体培养基中培养至对数期，离心并用无菌水洗涤，获得去除残余培养基的菌体沉淀，利用新的LB液体培养基进行重悬稀释(先稀释至OD600nm＝0.1，再统一稀释10倍)，吸取200μL添加到96孔板中，每个处理6个重复，密封静置于30℃培养48h。培养结束后移除培养物，添加200μL无菌水清洗2次后加入150μL结晶紫溶液(0.1％)染色30min，随后每孔再次用200μL无菌水清洗2次，室温干燥30min后加入200μL95％无水乙醇进行溶解，30min后测定OD530nm值。
不同菌株的生物膜形成能力如图8所示，菌株6036-R2A-26和G3-KB-15的OD530nm分别为1.16和0.98，具有一定的生物膜形成能力。
2、内生拮抗细菌分泌胞外酶(蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶)能力检测
根据是否产生透明圈，进行分泌蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶能力的检测。将活化后的菌株分别点接至酵素培养基、CMC培养基和淀粉琼脂培养基中心，28℃倒置培养3d后，将菌体刮离，以1％刚果红为指示剂染色30min，再用5％NaCl反复冲洗2-3次后浸泡60min，菌落周围透明圈的形成表明菌株能够分泌蛋白酶和纤维素酶；28℃倒置培养3d后，将菌体刮离，革兰氏碘液浸泡15min，5％NaCl洗去浮色，菌落周围透明圈的形成表明菌株能够分泌淀粉酶。
不同菌株分泌胞外酶形成的透明圈直径大小如表6所示，透明圈如图9所示。菌株YY97-KB-20、G3-NA-3、G3-KB-15和6036-KB-29均能产生蛋白酶，菌株YY97-KB-20和G3-KB-15产生的蛋白酶透明圈最大，平均分别为4.20cm和4.14cm；菌株6036-KB-29、6036-R2A-26和G3-NA-3能产生纤维素酶，菌株6036-KB-29产生的透明圈最大，平均为2.91cm；菌株6036-R2A-26能产生淀粉酶，淀粉酶透明圈平均为1.25cm。
表6内生拮抗细菌透明圈直径
Figure BDA0003726784610000131
3、内生拮抗细菌解磷能力测定
参考许明双(番茄和水稻种子可培养内生细菌的多样性分析及促生菌功能研究[D].中国农业大学,2014.)等人的方法并加以改进，挑取单菌落点接于NBRIP平板中心，点接无菌水为对照，置于30℃条件下培养10d。以解磷圈与菌落的直径比值大小确定其解磷作用，比值越大，解磷能力越强，比值为1时表示无解磷能力。不同拮抗细菌解磷圈与菌落直径的比值如表7所示，其解磷能力存在较大差异。菌株YY97-KB-20和G3-KB-15的比值分别为2.20和1.81，具有较强的解磷能力。
表7不同内生拮抗细菌解磷圈
Figure BDA0003726784610000141
4、内生拮抗细菌固氮能力测定
参考刘惠英(凤梨内生菌筛选鉴定及拮抗效果评价[J].湖北大学学报(自然科学版),2020,42(2):158-164.)等人的方法，在Ashby培养基上采用划线法接种菌株，置于30℃条件下培养15d。若菌株生长良好，且能够产生透明生长带，表明有较强固氮能力。不同拮抗细菌在Ashby培养基上的生长情况如图10所示，菌株YY97-KB-20、G3-NA-3和G3-KB-15在Ashby培养基上正常生长且划线培养处产生明显的透明区域，说明具有较强的固氮能力。
实施例6种子内生拮抗细菌对促进烟草生长的作用研究
1、内生拮抗细菌对烟草种子萌发的影响
(1)制备菌悬液：挑取不同内生拮抗细菌的单菌落接种至LB液体培养基，30℃、180r/min培养至对数期，离心并用无菌水洗涤，获得去除残余培养基的菌体沉淀，使用无菌水稀释至OD600nm＝0.1(108CFU/mL)。
(2)菌悬液对烟草种子萌发的影响：将消毒后的种子置于底部铺有滤纸的无菌培养皿中(30粒/皿)，添加5mL菌悬液，每个处理重复3次。25℃密封培养7d和10d，分别计算相对发芽势和相对发芽率。
不同拮抗细菌处理对种子萌发的影响如表8所示，不同拮抗细菌菌悬液对烟草种子的相对发芽势和发芽率均有促进作用。在处理后第7d，除菌株G3-NA-3的平均发芽势为70.88％，与CK无显著差异外，其他处理均能够显著促进种子萌发；在处理后第10d，除菌株G3-NA-3和YY97-KB-20外，其他处理对种子萌发均具有显著促进作用。因此，菌株G3-KB-15、6036-KB-29和6036-R2A-26处理的种子相对发芽势和相对发芽率显著高于CK，能够显著促进烟草种子萌发。
表8内生拮抗细菌对种子萌发的影响
Figure BDA0003726784610000151
注：相对发芽势及相对发芽率：均值±标准误，字母不同表示各处理在0.05水平上差异显著。
2、内生拮抗细菌对烟草生长的影响
(1)制备细菌发酵液：挑取各内生拮抗细菌的单菌落接种至LB液体培养基，30℃、180r/min培养至对数期，使用无菌水稀释至OD600nm＝0.1(108CFU/mL)。
(2)细菌发酵液灌根：将云烟87裸种表面消毒后播种于灭菌的育苗基质，约35d后，挑取大小一致的幼苗移栽至口径为9cm的育苗盆。缓苗1d后，进行内生拮抗细菌发酵液灌根(108CFU/mL、10mL/株)，每处理3个重复，每个重复5株。每隔7d重复灌根，灌根用量同上，共计3次。烟苗置于25℃，14h光照(5000LX)和10h黑暗交替的人工培养箱内培养。
(3)烟苗生物量测定
最后一次接菌后10d分别测定不同处理组烟苗的生物量。首先选定每株烟苗同部位叶片测定SPAD值，随后小心抖去根部基质，清水洗净残余基质，并用吸水纸吸干植株表面水分，分别统计根长、地上部鲜重和地下部鲜重。烘干后(105℃杀青15min，75℃干燥4h)统计地上部干重和地下部干重。
不同内生拮抗细菌处理对烟苗生物量的影响如表9、图11所示。与CK相比，不同菌株均能够提高烟苗的地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重和叶绿素SPAD值，对于烟草植株，地上部干重越高，代表烟草生物量越大，表明菌株促生长效果更好。菌株G3-NA-3、6036-KB-29、6036-R2A-26能够显著提高烟苗地上部鲜重，6036-R2A-26能够显著提高烟苗地下部鲜重，不同菌株均能够显著提高烟苗地上部干重和叶绿素SPAD值；6036-KB-29、6036-R2A-26的根长大于CK。因此，不同拮抗细菌在烟草苗期连续灌根处理，能够有效促进烟草生长，达到早生快发的作用。
表9内生拮抗细菌对烟草生长的影响
Figure BDA0003726784610000161
注：生物量：均值±标准误，字母不同表示各处理在0.05水平上差异显著。
实施例7
对实施例4筛选的内生菌
1、青枯菌及内生拮抗细菌发酵液的制备
将青枯菌及内生拮抗细菌分别于对应平板上划线活化，挑取内生拮抗细菌的单菌落转接于LB培养基振荡培养，挑取青枯菌的单菌落转接于B液体培养基振荡培养，分别震荡培养至OD600nm＝0.8-1.0，无菌水稀释至OD600nm＝0.1(1×108CFU/mL)备用。
2、内生拮抗细菌对烟草青枯病的防控作用评价
首先进行内生拮抗细菌发酵液灌根处理(108CFU/mL、10mL/株)，接菌后3d灌根青枯菌(108CFU/mL、10mL/株)。每个处理设置3个重复，每个重复8株，置于温度30℃、相对湿度75％、光照与黑暗时间比为14/10h的温室内培养。自发病初期开始调查烟草青枯病发病情况，每两天调查一次，病害调查方法同前。病害调查结束后，计算发病率、病情指数及防效。病害调查时间以CK存活时间为准。
不同内生拮抗细菌发酵液灌根处理对青枯病病情指数的影响如图12所示。接种青枯菌5d后，各处理开始逐渐发病，随后各处理的病情指数随着时间推移逐渐提高，但CK的病情指数始终远高于拮抗细菌处理。分析拮抗细菌处理间的病情指数可得，G3-KB-15、G3-NA-3和6036-R2A-26处理的平均病情指数低于6036-KB-29和YY97-KB-20处理，因此G3-KB-15、G3-NA-3和6036-R2A-26处理对烟草青枯病具有更好的生物防治作用。
不同内生拮抗细菌发酵液灌根处理对青枯病的防治效果如图13所示，表10为具体数据。不同处理对青枯病的防效存在差异。6036-R2A-26处理在接菌后7-15d的平均防效均在60％以上，在接菌后19d(发病末期)的平均防效仍能达到51.09％；G3-KB-15处理在接菌后7-13d的平均防效均在60％以上，在接菌后19d的平均防效仍能达到52.17％，因此菌株6036-R2A-26和G3-KB-15的整体防效比其他三株菌株较高。G3-NA-3处理在接菌后19d的平均防效为53.26％，YY97-KB-20和6036-KB-29处理在接菌后19d的平均防效分别为44.57％和36.96％。因此，不同内生拮抗细菌处理的生防效果存在一定的差异，其中以菌株6036-R2A-26和G3-KB-15的防效相对较高，本研究采用的青枯雷尔氏菌CQPS-1是一株极强的致病力菌株，对一般的烟草植株侵染危害较严重，所以菌株6036-R2A-26和G3-KB-15的对其他青枯雷尔氏菌防效也应该更高更强，是防治烟草青枯病的有良好效果的生防细菌，而且这2株菌对烟草植株都有良好的促生效果，都能显著提高烟苗生物量，可单用或复配使用，对烟草青枯病生物防治具有广阔的应用前景，对保护生态环境也有重要意义。
表10对应防效数据
Figure BDA0003726784610000171
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.具有促生作用的烟草种子内生菌，其特征在于，所述烟草种子内生菌为DW26，分类命名：Paenibacillus odorifer，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉，保藏日期：2022年6月7日，保藏编号：CCTCC NO：M 2022821。
2.根据权利要求1所述的烟草种子内生菌，其特征在于，烟草种子内生菌菌株呈白色圆形，不透明，在膨大胞囊内有椭圆形芽孢。
3.根据权利要求1所述的烟草种子内生菌，其特征在于，烟草种子内生菌菌株能产生纤维素酶和淀粉酶。
4.权利要求1-3任一项所述的烟草种子内生菌在制备用于抑制和/或防治烟草青枯病的生物菌剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，生物菌剂中烟草种子内生菌的使用浓度为1×106cfu/mL-1×1012cfu/mL。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述生物菌剂的制备方法为：将烟草种子内生菌DW26菌株活化后，挑取单菌落接种至LB液体培养基，30℃、180r/min培养至对数期，使用无菌水稀释至1×106cfu/mL-1×1012cfu/mL对植株进行灌根处理。
7.权利要求1-3任一项所述的烟草种子内生菌在制备用于促进烟草植株生长的生物菌剂中的应用。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，生物菌剂中烟草种子内生菌的使用浓度为1×106cfu/mL-1×1012cfu/mL。
9.一种生物菌剂，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的烟草种子内生菌菌株。
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