CN112501242A - 一种利用活体生测体系筛选烟草青枯病生防菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苗期烟草青枯病生防菌的筛选方法，包括烟苗培育、生测初筛和复筛及温室盆栽等步骤。本发明采用漂浮育苗方式培育烟草青枯病感病烟苗，将烟苗分为试验组和对照组，分别对试验组和对照组接种候选生防菌和LB液体培养基，1～2d后挑战接种烟草青枯菌，将育苗盘置于28～30℃恒温温室培育，调查筛选具有控病能力的生防菌；再次用烟苗生测法验证防效，复筛时每个处理组和对照组的烟苗为6～16株，筛选具有明显控病能力的生防菌；最后在温室大棚内进行盆栽试验，评价生防菌对烟草青枯病的防治效果。运用该方法已获得多株非拮抗作用的烟草青枯病生防菌。

Description

一种利用活体生测体系筛选烟草青枯病生防菌的方法

技术领域

本发明涉及植物病理学领域，尤其涉及一种利用活体生测体系筛选烟草青枯病生防菌的方法。

背景技术

烟草青枯病(Tobacco bacterial wilt,TBW)是热带、亚热带和一些温带地区常见的植物细菌病害之一。该病害在我国长江流域及其以南各大烟区普遍发生，其中云南、贵州、四川、重庆、福建、广西、安徽等省市危害严重，常爆发流行，造成毁灭性损失。

烟草青枯病的防治方法主要包括利用抗病品种、化学防治、农业防治和生物防治等。其中生物防治因其对环境安全而受到了国内外研究者的广泛关注，是可持续绿色防控的理想措施之一。

目前利用生物防治方法防治植物病害取得较大的进展，并呈现多样化的发展趋势，在部分农作物上已成为防治病害的重要措施之一。生防菌筛选方法一直是生物防治研究领域的一个瓶颈，多数研究者常用离体平板法进行初筛选，即在平板上筛选对病原菌有抑菌活性的菌株(韩长志.植物病害生防菌的研究现状及发展趋势[J].中国森林病虫,2015,34(01):33-37,25.)。例如我国烟草上已注册的8种生防菌，主要为荧光假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等杀菌剂，多数菌剂具有拮抗青枯菌的能力。拮抗初筛获得潜在生防菌的方法在植物病害生物防治中发挥较大作用，但该方法也有其不足之处。传统的筛选方法不易筛选到以非拮抗作用防病的生防菌，例如许多菌还能通过竞争、促生长、诱导植物抗病等机制控病。近年来，活体生测体系逐渐被引入植物病害生防菌的筛选中，例如解志婷用活体生测法筛选获得多株(种)具有一定开发价值的棉花立枯病生防菌和药剂的筛选(解志婷.利用活体生测体系筛选棉花立枯病高效生防菌和化学药剂[D].河北农业大学,2015.)。目前暂无活体生测法在烟草病害生防菌筛选中的应用。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题及不足，本发明提供了一种利用活体生测体系筛选烟草青枯病生防菌的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案来实现：

一种利用活体生测体系筛选烟草青枯病生防菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1：生测初筛，

(1)以感病烟草品种红花大金元为生测对象，漂浮育苗培育烟苗至4～5叶期，并将生测对象分为试验组和对照组，每组2株烟苗；

(2)首先对烟苗根部造伤，然后将试验组接种培养48h的候选生防菌1mL，以接种LB培养液的烟苗设为对照组，将漂浮盘置于恒温人工气候室培育1～2d，对试验组和对照组挑战接种烟草青枯菌，在恒温人工气候室继续培养；

(3)观察试验组和对照组发病情况，当对照组发病率＞80％时，记录实验组烟株发病情况，筛选有控病能力的生防菌；

步骤S2：生测复筛，

(1)将生测初筛获得的生防菌再次进行生测复筛选，复筛选时处理组和对照组分别处理8～16株烟苗，烟苗根部造伤、生防菌接种、烟草青枯菌的接种方法同步骤S1；

(2)分别于接种青枯菌后10d和20d调查各处理烟苗的病害等级，计算病情指数，筛选有防效的生防菌用于温室盆栽验证防效；

步骤S3：温室验证，

(1)生防菌的温室防效评价于温控28～30℃温室大棚进行，试验设置青枯菌处理组、对照组，每处理3次重复，每重复10株烟株；

(2)生防菌用LB液体培养基，在225r/min 30℃摇培48h；病原青枯菌用CG液体培养基，在225r/min 30℃摇培24h；

(3)将红壤与有机质按3:1混匀后移栽烟苗，烟苗为二次剪叶的烟苗，约培育50d，移栽后将250mL生防菌发酵液稀释25倍后灌根处理试验组，并以等体积LB稀释液处理对照组；次日用烟草青枯菌挑战接种试验组和处理组；接种后每7d调查一次病情指数，连续调查5次。

(4)根据调查结果进行统计；计算发病率、病情指数和防治效果(可简称防效)。

进一步地，所述漂浮盘规格为8×14、9×18孔漂浮盘。

进一步地，所述LB液体培养基包含1％胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、1％氯化钠和0.5％蔗糖；所述CG培养基包含0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨。

进一步地，所述生防菌和青枯菌接种顺序为先用无菌刀片在烟苗根部两侧形成创伤后，用生防菌预处理烟苗根部，1～2d后再接种病原菌，或生防菌和病原菌同时灌根烟苗。

进一步地，所述步骤S1和S2中烟草青枯菌的接种量为1.0mL×10⁷～1.0mL×10⁹CFU/mL，生防菌的接种量为1.0mL×10⁸～1.0mL×10⁹CFU/mL。

进一步地，步骤S3中烟草青枯菌的接种量为50mL×10⁷～50mL×10⁸CFU/mL，生防菌的接种量为200mL×10⁷～200mL×10⁸CFU/mL。

进一步地，所述恒温人工气候室温度设置为28～30℃。

进一步地，所述生测复筛中，发病率＝发病植株/调查植株总数×100％。

进一步地，所述生测复筛中，病情指数＝100×∑(各级病株数×各级代表值)/调查总株数×最高级代表值，其中，烟株发病程度按病害等级划分为0、1、3、5、7和9级。

进一步地，所述生防菌防效＝100×(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数。

工作原理：

本发明通过生筛初测、生筛复测、温室验证三个步骤筛选烟草青枯病生防菌。首先采用漂浮育苗方式培育烟草青枯病感病烟苗，再将烟苗分为试验组和对照组，分别对试验组和对照组接种候选生防菌和LB培养基，1～2d后挑战接种烟草青枯菌，将育苗盘置于28～30℃恒温温室培育，调查筛选具有控病能力的生防菌；再次用烟苗生测法在室内验证生测初筛选获得的生防菌的防效，筛选具有明显控病能力的生防菌；最后对复筛选中防效较好的生防菌进行温室防效评价，筛选具有稳定防治效果的生防菌。

本发明与现有技术相比所产生的有益效果是：

(1)常规的离体平板拮抗法以室内平板为筛选环境，与自然土壤差异明显，而本发明采用活体生测法人工模拟发病条件，与自然发病条件更接近，更利于筛选出田间有应用价值的生防菌；

(2)本发明首先以活体生测体系筛选具有防病、控病能力的生防菌，再分析生防菌的防病机制，而常规技术则以离体平板拮抗法筛选拮抗菌再检测防病能力，因此本发明可筛选到包括拮抗、竞争、促生长或诱导抗病等作用防治病害的生防菌；

(3)本发明采用漂浮育苗的方式与常规营养袋移栽相比培育烟苗效率高，占用空间小，育苗、移栽的方式简便快捷，效率高，筛选生防菌通量大。

附图说明

图1为本发明的流程图。

图2烟苗悬根培养法结构爆炸图。

图3烟苗悬根培养法侧面图。

图中的附图标记：1-漂浮盘、2-一次性培养皿、3-厚塑料布。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。

实施例1

本试验从文山州采集土壤样品，采用土壤微生物诱集法培养和分离候选生防菌，并用活体生测体系在实验室内评价候选生防菌防治烟草青枯病的能力，最后再温室大棚内进一步验证生防的病害防治能力，具体方法如下：

试验前期准备工作，主要包括烟苗培养、微生物诱集培养、病原菌培养等步骤。

漂浮育苗

以感病烟草品种红花大金元为生测对象，漂浮育苗培育烟苗至4～5叶期。

微生物诱集与分离

将土壤样品去除杂质和较大块状物后，装入直径120mm的玻璃培养皿中，土层厚度约为1.5cm，用蒸馏水采用滴定瓶将土壤润湿；

制备微生物诱集装置：首先在直径50mm、孔径为0.45μm的微孔滤膜边缘涂布胶水，将不锈钢平底垫圈置于微孔滤膜上；然后向垫圈内腔加入3mL固体培养基(1.2％结冷胶和1.0％维生素)；再用胶水涂布金属垫圈上表面，盖上另一孔径为0.45μm微孔滤膜；

将微生物诱集装置置于玻璃培养皿中按前述方法湿润的土壤上，轻轻压实装置，确保微孔滤膜与土壤充分接触，再用剩余土壤将装置完全覆盖，并用蒸馏水采用滴定瓶再次润湿土壤；

盖好培养皿，用封口膜将培养装置封好，置于30℃培养箱培养7d，期间观察土壤湿度，若土壤湿度低则用无菌水补足；

从培养箱中取出经过诱集的培养装置，将固体培养基捣碎，加入3mL无菌水放置10min后，梯度稀释至10^-4；

取10^-4、10^-5菌液涂布于寡营养培养基CN，其中寡营养培养基CN含0.1％酪蛋白氨基酸，0.1％营养肉汤，1.5％琼脂，每个梯度涂布5皿，于超净工作台吹干，并置于30℃培养箱中培养7d。

候选生防菌培养

挑取寡营养培养基CN上生长的单一菌落接种于盛有2.5mL LB液体培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、1％氯化钠和0.5％蔗糖)的试管，置于28℃、225r/min恒温振荡培养48h。

病原菌培养

从-80℃超低温冰箱活化烟草青枯菌于TTC培养基[1％蛋白胨、1％葡萄糖、0.1％酪素水解物、1.5％琼脂及0.005％的氯化三苯基四氮唑(TTC)]表面，置于28℃恒温培养箱培养36～48h；

挑取具有较宽白边、流动性较强、中间呈粉红色或浅红色稀液状的典型菌落，接种于盛有100mL CG液体培养基(1％蛋白胨、1％葡萄糖、0.1％酪素水解物)的三角瓶内，置于28℃225r/min恒温振荡培养24h；

取100μL稀释至10^-7，取100μL 10^-5、10^-6、10^-7稀释液涂布TTC平板，并于48h后观察菌落形态及计数菌落数。

烟草青枯病生防菌的筛选与评价主要分为室内初筛选和复筛选、温室大棚验证防效三个阶段，具体操作如下：

步骤S1，生测初筛

烟苗处理：用苗前1d从育苗池中取出备用烟苗晾干漂盘，次日用无菌手术刀片在烟苗根部距烟株中心1.5cm的两侧造伤，将烟苗分为试验组和对照组，每组2株烟苗，设置若干处理组和对照组。

生防菌预处理：将试验组接种1mL候选生防菌，对照组接种等体积LB培养液；

烟苗悬根培养：在28℃恒温人工气候室内的培养架上放置一张尺寸比漂浮盘大的厚塑料布3，并在塑料布3的4角和中心共放置5个一次性培养皿2作为支撑(附图2和3)，将漂浮盘1置于其上培养1d，其间分早、中、晚三次用喷水器具浇水，浇水量以漂盘孔内的水不下滴为宜；

病原菌接种：生防菌预处理1d后，对试验组和对照组接种0.5mL前述病原菌10倍稀释液，在28℃恒温人工气候室内继续培养15～20d，其间分早、中、晚三次用喷水器具浇水保湿；

观察记录：观察试验组和对照组发病情况，当对照组发病率＞80％时，记录试验组烟株发病情况，烟株赋值为1分，烟株发病但未枯死赋值为0.5分，烟株枯死赋值为0分，每株供试细菌处理的烟株的分值为两株烟株赋值的总和，选择供试细菌中赋值最高的菌株为潜力生防菌，用于室内复筛选。

步骤S2生测复筛，除以下试验不同外，其余操作步骤与步骤S1生测初筛相同。

供试菌株为步骤S1生测初筛获得的潜力生防菌；

增加处理烟株数量，处理组和对照组均处理8株烟苗；

分别于接种青枯菌后10、20d调查各处理组烟株的病害发生情况。

步骤S3，温室验证

试验设置：于温控28～30℃温室大棚进行，试验设置青枯菌处理组、对照组(浇灌等体积LB培养基+自来水)，每次重复处理3次，每次重复处理10株烟株；

供试菌株培养：生防菌用LB液体培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、1％氯化钠和0.5％蔗糖)培养，在225r/min、30℃摇培48h；病原青枯菌用CG液体培养基(0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨)培养，在225r/min、30℃摇培24h；

烟苗移栽：将红壤与有机质按3:1混匀后移栽烟苗，烟苗为二次剪叶的烟苗，培育约50d；

接种：移栽后将250mL生防菌发酵液稀释25倍，每株烟灌根200mL稀释液，以等体积LB稀释液处理对照组；次日将CG培养基摇陪24h的青枯菌稀释100倍，每株烟接种100mL青枯菌稀释液。

调查统计：接种后每7d调查一次病情指数，连续调查5次。烟草青枯病的发病率、病情指数和防治效果按下式计算：发病率＝发病植株/调查植株总数×100％；病情指数＝[Σ(病情级数×此级菌株数)/(最高级数×总株数)]×100；防治效果＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100％。病情指数按照中华人民共和国烟草行业标准烟草病害分级及调查方法调查(GB/T 23222-2008)，病害分级如下：全株无病为0级，病侧二分之一以下叶片凋萎为1级，病侧二分之一至三分之二叶片凋萎为3级，病侧三分之二以上叶片凋萎为5级，病株叶片全部凋萎为7级，病株基本枯死为9级。

结果与分析

试验结果：采用土壤细菌诱集培养法从采集自云南省文山州的50份土壤样品中分离土壤细菌，经生测初筛选、复筛选和温室再次评价，获得温室内有一定防治效果的菌株5株，这5株菌在室内初筛选中赋值均大于等于1.50，且在室内复筛选的第一次调查时(10dpi)均表现出一定的防病能力。温室生测结果表明，在温室大棚内接种100mL 10⁷CFU/mL烟草青枯菌35d，编号为11E4、22-E5、4-4的3株菌仍有40％以上的防治效果。上述结果证明使用活体生测法经室内初筛选、复筛选和温室再次评价能筛选获得具有控病能力的生防菌。

表1实施例1中5株生防菌对烟草青枯病的防治效果

注：初筛选时给每株烟赋值，烟株健康赋值1.00，烟株部分萎蔫赋值0.5，烟株枯死赋值0.00；复筛选时记录存活的烟株数目；温室评价时每隔7d调查一次病害等级并计算病情指数；表中防效为接种病原菌35d时处理组相对于对照CK的防效。

实施例2

实施例2除以下试验和结果不同外，其余操作步骤与实施例1相同。

供试土壤样品采自临沧市的植烟土壤。

试验结果：从临沧市临翔区、双江县、沧源县、凤庆县和云县等地烟田采集植烟土壤，运用土壤微生物诱集法分离土壤细菌，经室内初筛选、复筛选和温室盆栽试验，从1248株土壤细菌中筛选获得5株对烟草青枯病有一定防治能力的菌株，其中编号为56D2、65D6、66C8的3株菌的温室防效大于50％，有一定防治潜力。与实施例1中的结果相似，实施例2中筛选到的这5株菌在室内初筛选时的赋值均大于等于1.50，且在室内复筛选时65D6、66C8、7E4等3株菌表现出较好的控病能力。

表2实施例2中5株生防菌对烟草青枯病的生防效果

注：初筛选时给每株烟赋值，烟株健康赋值1.00，烟株部分萎蔫赋值0.5，烟株枯死赋值0.00；复筛选时记录存活的烟株数目；温室评价时每隔7d调查一次病害等级并计算病情指数；表中防效为接种病原菌35d时处理组相对于对照CK的防效。

实施例3

实施例3除以下试验和结果不同外，其余操作步骤与实施例1相同。

1、供试土壤样品采集自红河州植烟土壤；

2、室内复筛选防效调查时调查病害等级，病技术病情指数；

3、温室盆栽评价潜力生防菌的防效时增加对照药剂噻菌铜及LB10倍稀释液处理的烟株为正对照和空白对照。

试验结果：采用土壤细菌诱集法，从红河州弥勒市、建水县、泸西县、开远县和石屏县的植烟土壤中分离土壤细菌，经室内初筛选、复筛选和温室盆栽，最终获得5株有一定防治能力的烟草青枯病生防菌。筛选获得的5株菌在室内初筛选时赋值均大于等于1.50；室内复筛选时这5株菌处理的烟株在接种20d时病情指数均在60以上，说明在病害发生严重时生防菌仅能延缓病害的发生。温室盆栽试验中，编号为221D2、221C8、219B1的3株菌的防效在38％以上，上述3株菌的防效优于对照药剂噻菌铜，噻菌铜防效为31.02％。上述结果表明通过土壤微生物诱集法分离土壤细菌，再经过室内初筛选、复筛选和温室盆栽评价防效等3次活体生测，能够获得具有一定防治效果的生防菌。

表3实施例3中5株生防菌对烟草青枯病的生防效果

注：初筛选时给每株烟赋值，烟株健康赋值1.00，烟株部分萎蔫赋值0.5，烟株枯死赋值0.00；复筛选时调查烟株病害等级，并计算病情指数；温室评价时每隔7d调查一次病害等级并计算病情指数；表中防效为接种病原菌35d时处理组相对于对照CK的防效。

实施例4

采用平板对峙培养法，测量菌株的抑菌带。操作步骤如下：将CG培养基(0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨)培养24h的青枯菌梯度稀释至10^-4；取100μL稀释液置于CGA(0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨、1.5％琼脂)培养基表面，用涂布株涂布均匀，置于超净工作吹干；挑取单菌落接种于含有青枯菌的培养基表面，培养2～3d后观测各菌株的抑菌情况，有抑菌效果的菌株用四点法对峙培养并测量菌株的抑菌圈和抑菌带。

试验结果：为了初步验证实施例1、2、3筛选到的生防菌的防病机理，采用平板对峙法检测上述15株潜力生防菌对烟草青枯菌的抑制能力，结果表明仅有编号为4-4菌株具有抑菌作用，抑菌带宽0.8cm。其余14株菌均对烟草青枯菌无抑制能力，推测这14株菌可能通过非拮抗作用发挥生防作用。上述结果说明采用本发明不仅能获得常规筛选中的拮抗菌，也能筛选获得无拮抗作用的生防菌。

本发明的保护范围不仅仅局限于上述实施例，上述实施例只是为了帮助解释和说明本发明，而不是对本发明的保护范围进行限制，只要设计与本发明的设计相同或者是只要是等同替换的都落在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (10)

1.一种利用活体生测体系筛选烟草青枯病生防菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1：生测初筛，

(1)以感病烟草品种红花大金元为生测对象，漂浮育苗培育烟苗至4～5叶期，并将生测对象分为试验组和对照组，每组2株烟苗；

(2)首先对烟苗根部造伤，然后将试验组接种培养48h的候选生防菌1mL，以接种LB液体培养基的烟苗设为对照组，将漂浮盘置于恒温人工气候室培育1～2d，对试验组和对照组挑战接种烟草青枯菌，在恒温人工气候室继续培养；

(3)观察试验组和对照组发病情况，当对照组发病率＞80％时，记录实验组烟株发病情况，筛选有控病能力的生防菌；

步骤S2：生测复筛，

(1)将生测初筛获得的生防菌再次进行生测复筛选，复筛选时处理组和对照组分别处理8～16株烟苗，烟苗根部造伤、生防菌接种、烟草青枯菌的接种方法同步骤S1；

(2)分别于接种青枯菌后10d和20d调查各处理烟苗的病害等级，计算病情指数，筛选有防效的生防菌用于温室盆栽验证防效；

步骤S3：温室验证，

(1)生防菌的温室防效评价于温控28～30℃温室大棚进行，试验设置青枯菌处理组、对照组，每处理3次重复，每重复10株烟株；

(2)生防菌用LB培养液培养，在225r/min 30℃摇培48h；病原青枯菌用CG液体培养基培养，在225r/min 30℃摇培24h；

(3)将红壤与有机质按3:1混匀后移栽烟苗，烟苗为二次剪叶的烟苗，约培育50d，移栽后将250mL生防菌发酵液稀释25倍后灌根处理试验组，并以等体积LB稀释液处理对照组；次日每株烟挑战接种烟草青枯菌100倍稀释液；接种后每7d调查一次病情指数，连续调查5次；

(4)根据调查结果进行统计；计算发病率、病情指数和防效。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述漂浮盘规格为8×14、9×18孔漂浮盘。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述LB液体培养基包含1％胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、1％氯化钠和0.5％蔗糖；所述CG培养基包含0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生防菌和青枯菌接种顺序为先用无菌刀片在烟苗根部两侧形成创伤后，用生防菌预处理烟苗根部，1～2d后再接种病原菌，或生防菌和病原菌同时灌根烟苗。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S1和S2中烟草青枯菌的接种量为1.0mL×10⁷～1.0mL×10⁹CFU/mL，生防菌的接种量为1.0mL×10⁸～1.0mL×10⁹CFU/mL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S3中烟草青枯菌的接种量为50mL×10⁷～50mL×10⁸CFU/mL，生防菌的接种量为200mL×10⁷～200mL×10⁸CFU/mL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述恒温人工气候室温度设置为28～30℃。

8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于：所述发病率＝发病植株/调查植株总数×100％。

9.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于：所述病情指数＝100×∑(各级病株数×各级代表值)/调查总株数×最高级代表值；

其中，烟株发病程度按病害等级划分为0、1、3、5、7和9级。

10.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于：所述防效＝100×(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数。

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