CN111778174A - 一种对柑橘砂皮病有抑制作用的枯草芽孢杆菌及其筛选方法 - Google Patents

一种对柑橘砂皮病有抑制作用的枯草芽孢杆菌及其筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种对柑橘砂皮病有抑制作用的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株、筛选方法和最佳发酵条件，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17205。该菌株的发酵液能安全、无毒、有效的防治柑橘砂皮病（Diaporthe citri），经过田间试验该菌的发酵液稀释30倍的发酵液对柑橘砂皮病的防治效果为79.09%，稀释50倍发酵液对柑橘砂皮病的防治效果为68.97%。同时该菌具有广谱抑菌性，对花生白绢病菌、花生冠腐病菌、水稻纹枯病菌、草莓灰霉病菌也有一定的抑制作用。目前国内还没有将枯草芽孢杆菌用柑橘砂皮病防治的报道。因此，该拮抗菌株具有很好的应用前景。

Description

一种对柑橘砂皮病有抑制作用的枯草芽孢杆菌及其筛选方法
技术领域
本发明涉及一种对柑橘砂皮病菌有抑制作用的新菌株及其筛选方法、和最适发酵条件优化。
背景技术
柑橘砂皮病的病原有性态为柑橘间座壳(Diaporth citri)，经Wolf等人分离发现，病原无性态为柑橘拟茎点霉(Phomopsis citri),由Fawsett等人分离发现，病原菌分生孢子器在表皮下形成，球形、椭圆形或不规则形，具有瘤状孔口，分生孢子无色透明，有两种形态：α型，孢子呈椭圆形或纺锤形，单孢，内一般含2个油球，有时含多个油球，易萌发；β型，正直细长或弯曲呈钩状，无油球，该类型孢子不易萌发。一般以α型孢子居多，β型孢子较少见。病原菌最适生长温度为25℃左右，高于35℃或低于20℃会导致菌丝生长缓慢，分生孢子在5℃～35℃均可萌发；在PDA培养基上培养，菌丝白色密集，呈放射状向四周生长，培养14d左右产生子实体，培养基表面出现单独或成堆的黑色分生孢子座，上着生分生孢子器，分生孢子器上产生白色或淡黄色滴状物即为分生孢子。
该病为真菌寄生性病害，由于绝大部分柑橘果树枝叶带刺，在雨季刮大风时，树枝被风刮动，互相之间摩擦会造成伤口，加上大量降雨也易导致孢子大量繁殖，孢子萌发后在空气中四处飞散会导致病害的大范围传播。病原菌为弱寄生菌，通常在树势衰弱时或有伤口时侵染柑橘，以菌丝体或分生孢子器在病叶、病枝上越冬，病株上的分生孢子器在环境适宜的情况下可以产生大量分生孢子，来年条件合适时进行新一轮的侵染。有人指出，这些黑点的出现，是柑橘作为寄主本身做出防卫反应的产物。也有研究指出，柑橘砂皮的发病条件也与柑橘的种类有一定关系。
目前来看，化学药剂是防治柑橘砂皮病的主要方法。但是长期单一使用某一种化学药剂，容易产生抗药性，影响防治效果。由于柑橘砂皮病的特性，需要在一年内多次施药进行防治，化学药剂大量使用对环境造成污染以及对人体健康的潜在危害。因此，筛选出对柑橘砂皮病菌有抑制作用的微生物是防治柑橘砂皮病的最佳途径。
发明内容
针对上述问题，本发明人从湖南省怀化市麻阳县柑橘砂皮病发生的不同橘园采集健康柑橘叶片，分离柑橘叶内生菌，通过稀释平板法获得细菌的单菌落，再采用平板对峙法筛选得到一株对柑橘砂皮病有较好抑制作用的细菌，将该菌命名为M-23，经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。本发明人经过研究发现该菌对人畜无致病性，能安全地用于柑橘砂皮病的生物防治。同时，M-23菌株对水稻纹枯病菌、花生冠腐病菌、花生白绢病菌、草莓灰霉病菌也有一定的抑制作用。
本发明提供的技术方案是：一种对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌，其是保藏号为CGMCC No.17205的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明所述的细菌M-23(枯草芽孢杆菌，拉丁名：Bacillus subtilis)已于2019年1月16日为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC所保藏(保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCC No.17205，经检测存活。
同时，本发明还提供所述对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌的筛选方法，其步骤如下：
(1)从叶片中分离细菌样品，将采集的柑橘叶片用流水冲洗，剪成1cm2的小块，用75％的酒精浸泡30s，然后1％的次氯酸钙溶液浸泡4min，无菌水冲洗5次，备用；
(2)利用稀释法进行分离，将消毒后的叶片小块放在无菌研钵中研磨成浆液，用无菌水稀释，制备10-2、10-3、10-4稀释液，吸取稀释液滴加到NA培养基平板上，涂布均匀，将培养皿放在恒温培养箱中28℃倒置培养；
(3)筛选对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌
采用平板对峙法筛选对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌：将纯化的细菌菌株，用NA培养基培养，柑橘砂皮病菌在PDA培养基上培养7天后，用7mm打孔器打菌饼，将其接入含PDA培养基的培养皿中央，四周均匀对称接入细菌，培养7-14d后观察测量抑菌圈直径，选择拮抗作用明显的细菌，保存。
同时，本发明还提供所述的细菌在防治柑橘砂皮病中的应用。
本发明所述的细菌对水稻纹枯病菌、花生冠腐病菌、花生白绢病菌、草莓灰霉病菌也有一定的抑制作用。
所述的应用，其利用所述细菌的发酵液、或发酵液提取物进行应用。
本发明还提供一种农用杀菌剂，其包含所述的细菌，优选的是其包含所述菌株的发酵液。
同时，本发明还通过单因素控制法和多因素正交分析确定了最佳发酵液成分为：葡萄糖15g/L，玉米粉15g/L，NaCl 3.5g/L，K2HPO4 1.5g/L；最佳发酵条件：以28℃、180r/min、pH＝7.5、发酵时间为72h。
本发明具有以下有益效果：
本发明细菌M-23是发明人从湖南省怀化市麻阳县有柑橘砂皮病发生的柑橘园采集的健康叶片样品中分离而得，经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，经过田间试验该菌的发酵液稀释30倍的发酵液对柑橘砂皮病的防治效果为79.09％，稀释50倍发酵液对柑橘砂皮病的防治效果为68.97％。同时该菌具有广谱抑菌性，对花生白绢病菌、花生冠腐病菌、水稻纹枯病菌、草莓灰霉病菌也有一定的抑制作用。该菌对人畜无致病性，能安全地用于柑橘砂皮病的生物防治，能够减少化学农药的使用量，降低环境的污染，促进绿色农业的发展。目前国内还没有将枯草芽孢杆菌用柑橘砂皮病防治的报道。因此，该拮抗菌株具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明细菌M-23发酵液不同浓度对柑橘砂皮病菌的抑制效果。
图2为本发明细菌M-23对花生白绢病菌、花生冠腐病菌、水稻纹枯病菌、草莓灰霉病菌的抑制效果，其中，(a).花生白绢病菌(b).花生冠腐病菌(c).水稻纹枯病菌(d).草莓灰霉病菌。
图3为本发明细菌M-23的培养性状、革兰氏染色和芽孢染色图片，其中，(a).菌落形态(b).革兰氏染色(c).芽孢染色。
图4为本发明细菌M-23DNA的PCR扩增凝胶电泳。
图5为本发明细菌M-23的16S rDNA的序列图。
图6为本发明细菌M-23序列基于16s rDNA序列构建的系统发育进化树。
具体实施方式
实施例1：菌株的筛选和鉴定
本发明对柑橘砂皮病有抑制作用的细菌的筛选方法如下：
1、柑橘叶片的采集
从湖南省怀化市麻阳县柑橘砂皮病发生的不同橘园采集健康柑橘叶片带回实验室。
2、细菌的分离
利用稀释法进行分离。将叶片用流水冲洗后，在75％的酒精中浸30s，在1％次氯酸钠溶液中浸泡4min，无菌水冲洗5次后，剪碎成大小约为1cm2的小块置于灭菌后的研钵中进行研磨，用无菌水稀释，制备10-2、10-3、10-4稀释液，分别吸取稀释液100μL滴加到NA培养基(牛肉膏3g、琼脂20g、氯化钠5g、蛋白胨10g、ddH2O 1000mL，调pH至7.2)平板上，涂布均匀，将培养皿放在28℃恒温培养箱中倒置培养。
3、拮抗细菌的筛选
采用平板对峙法初步筛选对柑橘砂皮病菌有拮抗作用的细菌。将纯化的细菌菌株，挑取单菌落在NA培养基上培养。用直径7mm的打孔器将柑橘砂皮病菌接入PDA培养基中央，四周对称接种细菌。用没有接种细菌的作为对照，CK对照长满培养皿后观察测量抑菌圈直径，选择拮抗作用明显的细菌纯化后使用甘油保藏法进行保存，共筛选到拮抗效果好的8个菌，分别为M-7、M-11、M-23、M-31、L-6、L-8、L-17、C-5。
4、拮抗细菌的复筛
将筛选到拮抗效果好的8个菌接种于NB培养基(牛肉膏3g、氯化钠5g、蛋白胨10g、ddH2O 1000mL，调pH至7.2)中，28℃摇床培养5d后，4℃、8000r/min离心10min后，用细菌过滤器过滤。过滤后的发酵液稀释10倍(2mL发酵液与18mL PDA混合倒平板)、20倍(1mL发酵液与19mL PDA混合倒平板)来进行抑菌活性检测，以加入等量无菌水的培养基作为CK对照。在培养基平板的中央接入7mm的柑橘砂皮病菌块，每个处理进行3次重复，将培养基封口后倒置于28℃恒温培养，待CK对照病菌菌丝即将长满平板时取出观察，用十字交叉法测量菌落直径并计算抑制率，结果如下表1，根据结果可知M-23菌株发酵液抑制效果最佳，发酵液10倍抑制率达72.67％，稀释至20倍抑制率仍有61.80％，请参见图1。
表1 对柑橘砂皮病菌有拮抗作用细菌的复筛
Figure BDA0002496214730000041
Figure BDA0002496214730000051
5、拮抗细菌M-23的抑菌广谱性测定
将M-23菌株与花生白绢病菌、花生冠腐病菌、水稻纹枯病菌和草莓灰霉病菌采用平板对峙法进行拮抗细菌广谱抑菌能力测定，测定结果如图2，M-23菌株对花生白绢病菌、花生冠腐病菌和草莓灰霉病菌有明显的抑制作用。
6、拮抗细菌M-23的发酵条件优化
通过控制培养基的碳源、氮源和无机盐种类作为单因素变量，原始的NB培养基作为对照，培养M-23菌株发酵液，通过对比发酵液上清液对柑橘沙皮病菌的抑制率来筛选最佳碳源、氮源和无机盐。对筛选出的最佳碳源、氮源、无机盐等因素设计多因素正交分析，根据结果得出碳、氮源、无机盐及其用量分别为葡萄糖15g/L，玉米粉15g/L，NaCl 3.5g/L，K2HPO4 1.5g/L。通过控制发酵温度、发酵转速、发酵pH值和发酵时间作为单因素变量培养M-23菌株发酵液，通过对比发酵液上清液对柑橘沙皮病菌的抑制率来筛选M-23菌株的最佳发酵条件，根据结果得出最佳发酵条件为28℃、180r/min、pH＝7.5、发酵时间为72h。
7、拮抗细菌M-23的鉴定
(1)形态特征
请参见图3a-c，细菌在NA培养基上菌落不透明、呈乳白色略带一点黄色，形状为边缘不整齐的圆形，中央隆起，表面粗糙不规则，有褶皱，有粘性。在显微镜下观察细胞革兰氏反应为阳性，能产生芽孢，菌体为杆状。
(2)生理生化实验
菌株的部分生理生化特征测定结果如表2所示：该菌株革兰氏反应呈阳性，能进行硝酸盐还原反应和V-P反应，能够利用柠檬酸盐，可以使淀粉水解、明胶液化，具有过氧化氢酶活性，能使甲基红指示剂变红色；吲哚试验结果为阴性。
表2 M-23菌株部分生理生化特征测试结果
Figure BDA0002496214730000061
注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性
(3)16S rDNA测序及序列分析
使用全式金EasyPure Bacteria Genomic DNA kit试剂盒按照说明书步骤逐步操作提取细菌DNA。采用细菌通用引物16S rDNA通用引物27F和1492R对M-23菌株DNA进行PCR扩增。
27F：5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'
1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
扩增体系选择25μL体系：
Figure BDA0002496214730000062
PCR扩增程序如下：
Figure BDA0002496214730000063
M-23菌株DNA经过PCR扩增，凝胶电泳检测，PCR产物测序得到大小为986bp(图4)的16s rDNA序列片段(图5)。将序列在NCBI上进行BLAST比对发现，与该序列同源性相近的均为芽孢杆菌属，下载其中10株序列相似度较高的序列，利用Mega 6软件进行序列分析，采用Neighbor Joining法构建M-23菌株的16s rDNA序列系统发育树(图6)。M-23菌株与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(登录号：MN910307.1)的同源性最高，结合对其进行的形态学观察和生理生化鉴定结果，故确定M-23菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
实施例2：应用实施例
进行枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M-23菌株的发酵液防治柑橘砂皮病的田间试验，试验地位于湖南省怀化市洪江市双溪柑橘园艺场，该橘园于1986年建园，品种为冰糖橙，柑橘砂皮病发生较重。田间试验分别在2019年3月中旬春梢长2-3cm时、4月中旬、谢花2/3时、果实蚕豆大小、果实乒乓球大小时共5次喷施，与柑橘砂皮病化学药剂防治同步进行，使用人工背负式电动喷雾器对叶片进行喷洒，每株柑橘树均匀喷洒3L。设置1个对照组和2个处理组，处理组1：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M-23发酵液用水稀释30倍，加入0.1％吐温20；处理组2：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M-23用水稀释50倍，加入0.1％吐温20；对照处理：设置空白对照喷施等量清水。
病害调查方法如下：
柑橘砂皮病分级：
0级：无病；
1级：叶片或果实上有1～25个病斑；
3级：叶片或果实上有26～50个病斑；
5级：叶片或果实上有51-75个病斑；
7级：叶片或果实上有76-100个病斑；
9级：叶片或果实上有101个病斑以上。
收获期间调查柑橘砂皮病病情指数并计算防治效果，每区调查3株柑橘，每株5个枝条，调查共15个枝条上叶片的发病情况。
病情指数＝100×∑(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)。
防治效果(％)＝100×(对照区病情指数-防治区病情指数)/对照区病情指数。
表3 菌株M23发酵液对柑橘沙皮病的防治效果
Figure BDA0002496214730000071
Figure BDA0002496214730000081
田间试验结果请见表3，30倍和50倍稀释的发酵液对柑橘砂皮病的防治效果分别为79.09％和68.97％，对比橘园内用化学药剂防治的效果有所不足，但是50倍也达到了68.97％，生防菌剂还有环境友好、不会产生耐药性等特点，本试验结果说明生防菌M-23对柑橘砂皮病的防治有一定应用前景。

Claims (8)

1.一种对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌，其是保藏号为CGMCC No.17205的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种权利要求1所述的对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌的筛选方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将采集的柑橘叶片用流水冲洗，剪成小块，用75%的酒精浸泡30s，然后1%的次氯酸钙溶液浸泡2～6min，无菌水冲洗4～7次，备用；
（2）利用稀释法进行分离，将消毒后的叶片小块放在无菌研钵中研磨成浆液，用无菌水稀释，制备10-2、10-3、10-4稀释液，吸取稀释液滴加到NA培养基平板上，涂布均匀，将培养皿放在恒温培养箱中28℃倒置培养；
（3）筛选对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌。
3.一种权利要求1所述的对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌在防治柑橘砂皮病中的应用。
4.一种权利要求1所述的对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌在防治水稻纹枯病菌、花生冠腐病菌、花生白绢病菌、草莓灰霉病菌所致植物病害中的应用。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于：其利用所述细菌的发酵液、或发酵液提取物进行应用。
6.一种农用杀菌剂，其特征在于：其包含如权利要求1所述的细菌。
7.如权利要求6所述的农用杀菌剂，其特征在于：其包含如权利要求1所述的细菌的发酵液，或其发酵液提取物。
8.一种制备抑制柑橘砂皮病发酵液的方法，其特征在于，该方法是将权利要求1所述的菌株以葡萄糖15 g/L，玉米粉15 g/L，NaCl 3.5 g/L，K2HPO4 1.5 g/L的培养基以28 ℃、180 r/min、pH=7.5、发酵时间为72h的条件进行发酵。
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