CN116410904A

CN116410904A - 一株卡氏芽孢杆菌bc30及其应用

Info

Publication number: CN116410904A
Application number: CN202310491585.0A
Authority: CN
Inventors: 黎妍妍; 常晓涵; 李凌峰; 杨勇; 杨林; 张洪郝
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2023-05-04
Filing date: 2023-05-04
Publication date: 2023-07-11

Abstract

本发明提供了一株卡氏芽孢杆菌BC30及其应用，其命名为卡氏芽孢杆菌(Bacillus cabrialesii)BC30，其保藏编号为CCTCC NO：M 2023167。本发明还提供了所述卡氏芽孢杆菌BC30在防治烟草黑胫病、促进烟草植株生长、种子萌发中的应用；该卡氏芽孢杆菌BC30烟草黑胫病具有良好防病效果、并对烟株具有显著促生作用。

Description

一株卡氏芽孢杆菌BC30及其应用

技术领域

本发明涉及微生物学术领域，特别涉及一株卡氏芽孢杆菌BC30及其应用。

背景技术

在我国，烟草种植业是解决我国许多地区农村就业问题的重要行业，据不完全估计，每年我国约有130多万农民种植烟草，烟草种植在解决许多农村地区的就业问题及增加收入等方面发挥了重要作用。由于种植方式的改变，农药、化肥的不合理施用，加上烟田被迫连作以及抗病品种抗性退化等问题，烟草黑胫病在我国地域开始广泛分布，并在烤烟、晒烟、晾烟、香料烟等所有栽培品种的任何生育阶段进行侵染危害。据调查表明，中国平均每年因烟草黑胫病造成的损失达上亿元，黑胫病也成为了国内危害最为严重的根茎病害之一、烟草生产上最具毁灭性的病害之一。其病害的蔓延与发生严重影响着烟草的产量和品质，给烟草产业造成了较大的影响，已然成为了限制烟草优质、高效、安全生产的重要因素。

烟草黑胫病是由烟草疫霉引起的真菌性土传病害，具有发病率高、分布广泛、危害性大、毁灭性强等特点。其存活时间长，能进行初侵染和多次再侵染，高温、高湿条件下更易促使病害的发生，且在苗床时期和大田生长阶段均能发生。苗期发病时，首先在烟株茎基部出现黑斑，当湿度较高时，病斑上布满白毛，并迅速传染附近幼苗，引起其他幼苗大面积死亡；大田发病时，发病部位主要为茎基部和根部，常常表现出黑胫、叶片萎蔫、褐色病斑、髓部干缩、茎部坏死等症状。发病严重时，病斑沿主脉到达叶基部，侵入叶髓，造成茎中部黑褐色坏死，呈腰烂状，纵剖病株茎部，茎秆内部产生黑褐色碟片状坏死，植株萎蔫，俗称“穿大褂”，感病部位产生圆形黑褐色的大块病斑，形如膏药状，俗称“黑膏药”，不及时防治便会迅速发生，大面积感染。

目前生产上多采用种植抗病品种和通过化学药剂进行黑胫病的防治，但是当前尚未发现对烟草黑胫病免疫种，且品种抗性会随着黑胫病菌生理小种的消长而减低；同时，化学农药易造成环境污染及烟叶中农药残留，长期使用还会使病菌产生抗药性。因此，寻找一种安全、高效、无公害的烟草黑胫病防治方法已成为烟草生产的当务之急。生物防治是一种环境友好和具有良好发展潜力的防治手段，有益微生物的利用已成为植物病害防治的研究热点。植物内生细菌是植物病虫害生物防治的天然资源菌，具有十分广泛的理论研究和开发应用价值，内生细菌存在植物体内，受到植物体的保护，不易受外界环境的影响，多种菌株对寄主植物具有防病、促生及生物固氮等广泛的生物学作用，并且能够在植物体内定殖传导，长期发挥作用。

发明内容

本发明目的是提供一株卡氏芽孢杆菌BC30及其应用，该株卡氏芽孢杆菌BC3对烟草黑胫病具有良好防病效果、并对烟株具有显著促生作用。

在本发明的第一方面，提供了一株卡氏芽孢杆菌BC30，所述卡氏芽孢杆菌BC30的保藏编号为：CCTCC NO：M 2022368。

在本发明的第二方面，提供了所述的卡氏芽孢杆菌BC30在防治烟草黑胫病中的应用。

在本发明的第三方面，提供了所述的卡氏芽孢杆菌BC30在促进烟草植株生长中的应用。

在本发明的第四方面，提供了所述的卡氏芽孢杆菌BC30在促进烟草种子萌发中的应用。

在本发明的第五方面，提供了一种发酵菌剂，所述发酵菌剂包括：

将所述的卡氏芽孢杆菌BC30进行发酵获得的发酵液；

或将所述发酵液经喷雾干燥获得干粉菌剂。

在本发明的第六方面，提供了采用所述的卡氏芽孢杆菌BC30降解邻甲酚或/和2，4-二叔丁基酚的方法，所述方法包括：

将所述的卡氏芽孢杆菌BC30或者所述的发酵菌剂活化制备成发酵液；

将所述发酵液浸泡烟草种子，或者将所述发酵液施用于烟草植株的根部。

进一步地，所述发酵液中活菌浓度调至(1～3)×108cfu/mL。

进一步地，所述发酵液施用于烟草植株的根部时，将烟株移植30天后浇灌所述发酵液，连续浇灌5次，每隔三天浇灌一次。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明提供的一株卡氏芽孢杆菌BC30及其应用，该卡氏芽孢杆菌BC30对烟草黑胫病具有良好防病效果、并对烟株具有显著促生作用。由此可见，该菌株具有良好的理论研究价值和应用前景，不仅可以作为研究内生细菌与宿主植物的互作及其作用机制的良好试验材料，还可用于内生生物肥料和生物杀菌剂的研制开发，同时还可能成为构防病促生等多功能工程菌的良好载体，为开展烟草黑胫病的生物防治提供了新的菌种资源。

本发明的卡氏芽孢杆菌BC30的保藏日期为2023年02月21日，保藏编号为CCTCCNO：M 2023167。其分类命名为卡氏芽孢杆菌(Bacillus cabrialesii)BC30，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为内生菌的抑菌效果；其中图1A为初筛的结果；图1B为复筛的结果；图1C为模式菌株BS168对烟草疫霉菌的抑菌效果；

图2为无菌发酵液的抑菌效果；

图3为BC30对烟草黑胫病的防病效果；其中图3A为对照组烟株生长情况，图3B为BC30处理后烟株生长情况，图3C为两组烟株茎部剖面对比图

图4为BC30系统发育树。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。

本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

本申请发明人从采集于湖北大学生命科学学院温室的烟草通过分离纯化、筛选，得到一株烟草内源菌，发现该菌株对烟草疫霉具有拮抗效果，该细菌经菌落形态、生化及16SrRNA测序分析，该菌株与卡氏芽孢杆菌(Bacillus cabrialesii)多个的菌株同源性均在96％以上，结合生理生化特性，初步确定该菌株属(Bacillus cabrialesii)，并命名为卡氏芽孢杆菌(Bacillus cabrialesii)BC30。

本发明的卡氏芽孢杆菌BC30对烟草种子萌发和烟株生长具有良好的促进作用。对烟草黑胫病具有良好的防病效果，为后续生物菌剂的开发提供了理论基础。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的一株卡氏芽孢杆菌BC30及其应用进行详细说明。

实验菌株：烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)购买于中国农业微生物菌种保藏中心(ACCC 36286)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis strains 168)购买于上海保藏生物技术中心模式菌株(ATCC 23857)。

供试培养基：NA培养基：牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂15g，蒸馏水补足1000mL，pH7.2，灭菌。LB固体培养基：氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，1000mL水，琼脂15g，灭菌。马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g、蒸馏水1000mL，pH7.0～7.4。

实施例1、菌株BC30的定向富集分离与鉴定

1、烟草内源菌的分离纯化

将烟草清洗干净后分别剪取1g的根、茎、叶样品，依次用75％乙醇浸泡1min，无菌水冲洗3次，5％NaClO浸泡6min，无菌水冲洗5次后，在无菌研钵中加入1mL无菌水研磨。采用稀释平板涂布法，制备10^-3、10^-4、10^-5、10^-6CFU/mL梯度稀释液，各取0.1mL涂布在固体LB平板上，28℃培养48h。挑取培养特征明显不同的单菌落，于LB平板进行划线纯化，将纯化好的菌株4℃保存备用。

2、菌株的分离筛选

(1)初筛：以烟草烟草疫霉为指示菌，采用平板对峙法测定其对真菌病菌的抑制活性。用直径为5mm的无菌打孔器在病菌菌落边缘打取菌饼，接种于PDA平板中央，在距离中心3cm处用打孔器打三个直径为5mm的空洞，每个洞中加入20uL菌悬液，设清水对照，每处理设3次重复，将平板置于37℃恒温箱内培养。待对照菌落长至培养皿2/3时，观察是否有明显的拮抗作用，筛选出对病原菌生长具有抑制作用的菌株进入复筛。将上述初筛平板取出，测量抑菌圈大小并计算抑菌率。抑菌率＝(处理组抑菌圈直径-对照组抑菌圈直径)/处理组抑菌圈直径×100％。

从烟株根茎部筛选出多种内生菌并分离纯化到6株，经过初筛，筛选到2株对烟草疫霉具有拮抗效果。

(2)复筛：将初筛得到的2株菌株采用PDA平板对峙法进行复筛。将纯化的待测细菌上下平行划线接种于距病原菌2.5cm处两边，以单接靶标菌为对照，每个处理重复3次，28℃恒温培养。待对照组病原菌菌落长满皿底时，对比是否有明显拮抗作用。

最终筛出一株对烟草疫霉具有良好拮抗效果的菌株，将其命名为BC30，拮抗效果如图1所示。购买芽孢杆菌模式菌株(Bacillus subtilis strains 168)进行抑菌测定对比试验，该芽孢杆菌模式菌株和本发明的BC30对烟草黑胫病的抑菌测定结果如表1所示。

表1 BC30对烟草疫霉的抑菌测定

由表1可知：菌株BC30对烟草疫霉菌的抑菌圈约为2.23cm，抑菌率可达到77.52％，相较于普通芽孢菌株(Bacillus subtilis 168)，显著提高了52.8％，且能够在平板上明显地观察到拮抗作用的产生。

3、菌株BC30的鉴定

(1)形态特征鉴定

将筛选到有明显拮抗作用的菌株从冰箱取出，NA平板划线，28℃培养48h后挑取单菌落，在新的NA平板上划线28℃培养60h，观察并记录菌落的颜色、形态等特征，并通过光学显微镜和革兰氏染色观察细胞形态。

通过鉴定，该菌为革兰氏阳性菌，好氧，以单细胞形式存在，最适生长温度为28-30℃，生长p H为6.0-8.0。在LB培养基上，28℃黑暗培养24h的菌落呈乳白色，圆形，扁平，不透明，直径约为4.0mm，不规则边缘，无晕环，表面光滑湿润，质黏，营养细胞呈杆状，符合卡氏芽胞杆菌特征。

(2)16S rDNA序列同源性分析及进化树构建

用菌悬液沸水浴法提取菌株基因DNA，采用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR扩增。PCR反应体系DNA模板1μL，上、下游引物各1μL，Taq聚合酶12.5μL，ddH2O补足至25μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min 30s、24个循环，最后72℃延伸10min。PCR反应产物经1％琼脂糖凝聚电泳检测，将16S rRNA的PCR扩增产物回收纯化后由武汉擎科创新生物科技有限公司测序。测序结果提交NCBI数据库进行BLAST同源性分析，再利用MEGA 7.0软件进行序列比对以及系统进化树的构建。数据处理采用Excel和DPS7.05软件分析。

将PCR获得的待测菌株的16S rDNA序列(如SEQ ID NO.1所示)在数据库中进行BLAST比对分析，结果如图4显示，菌株BC30(OP905596)与卡氏芽胞杆菌(Bacilluscabrialesii)的序列相似性高达100％，系统发育树构建结果表明BC30与卡氏芽胞杆菌(OP435777.1)属于同一分支(图4)，结合形态学和生理生化鉴定，鉴定该为卡氏芽孢杆菌，并命名为卡氏芽孢杆菌BC30(Bacillus cabrialesii)，并于2023年02月21日于中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2023167。

实施例2菌株无菌发酵滤液的抑菌活性测定

1、菌株发酵液的制备

将卡氏芽孢杆菌BC30菌株接于盛有100mL LB液体培养基中，28℃，230r/min振荡培养12h制成种子液，再按2％的接种量接种于LB培养液中，28℃，230r/min条件下扩大培养24h得到菌株发酵液。盆栽试验使用前，用LB培养液将发酵液中活菌浓度调至1×10⁸cfu/mL。

2、菌株无菌发酵滤液的抑菌活性测定

(1)生防菌株无菌发酵滤液的制备：将培养得到的菌液发酵液经12000r/min离心10min，上清液用细菌过滤器(0.22μm)除菌过滤两次后得到无菌发酵滤液。

(2)无菌发酵滤液对病原菌菌丝生长的影响：采用平板打孔法测试拮抗菌无菌发酵滤液的抑菌作用。用打孔器在距离平板(直径为9mm的培养皿)中央2.5cm处均匀打3个孔，每孔注入20μL的发酵滤液，以无菌的LB液体培养基为对照，在培养基中心接直径5mm的病原菌菌块，每个处理重复3次。28℃黑暗培养3d后，测量对照组和处理组靶标菌菌落半径，计算相对抑菌率。

3、结果

菌株无菌发酵滤液对烟草黑胫病病原菌菌丝生长的影响测定结果如图2和表2所示。

表2 BC30无菌发酵滤液的抑菌活性

由图2和表2的结果可知，BC30的发酵滤液同样对烟草疫霉菌菌丝生长具有抑制作用(图2)，抑菌圈大小为1.16cm，相对抑菌率为56.34％，抑菌效果均低于活体菌，降低了21.18％(表2)。

实施例3、对烟草种子萌发及促生作用测定

1、选择颗粒整齐均等的烟草种子，经浓度75％的乙醇表面消毒30s，无菌水洗涤三次，无菌滤纸吸干后，将种子浸于菌株发酵液中4h。取出种子均匀等距置于铺有4层湿润滤纸的培养皿中，每皿50粒，每个浓度处理设3个重复。光照培养箱中黑暗培养14d(湿度80％，温度28±2℃)，每2d统一补充定量无菌水保持滤纸湿润，统计种子萌发粒数并计算萌发率。

2、将菌株分别接种于LB培养基，28℃，230rpm摇菌24h后调节菌悬液浓度为1×10⁸cfu/mL，分别对4-5叶期烟苗进行灌根和叶面喷施处理，每隔5d灌施一次，总共灌施3次，15d后测量比较处理组与对照组苗长、叶长、叶宽、鲜重、根冠比的差异。

种子萌发率＝(萌发种子粒数÷供试种子粒数)×100％

根冠比＝地下部鲜重/地上部鲜重x100％

3、结果如表3所示。

表3 BC30对烟株的促生效果

由表3的结果可知，菌株BC30浸种处理后10天，种子萌发率显著上升，可达92.3％，较对照组相比总体提高了4.7％；且处理后农艺性状间具有明显差异，相较于对照组，菌株BC30处理后苗长、叶长、叶宽、鲜重、根冠比均有提高，这说明BC30对烟草种子萌发和烟株生长具有良好的促进作用。

实施例4、菌株对烟草黑胫病的防病效果分析

1、田间实验

烟株移植天50后浇灌实施例2所得的菌株发酵液，连续浇灌5次，每隔4天浇灌一次，15天后在土壤中接种烟草疫霉菌，处理烟株数为50株，以清水作为对照，90天后统计发病情况。

2、结果如图3所示，在烟株施用BC30发酵液后可显著提高植株对烟草黑胫病的的抗性诱导能力，对照组近土表的茎基部出现暗褐色至黑色的病斑，下部个别叶片凋萎，向上和横向扩展，纵剖病茎可看到髓部干缩成褐色碟片状，碟片之间有稀疏的白色菌丝；而处理组发病情况明显缓解，病害严重程度显著降低，说明菌株BC30对烟草黑胫病具有良好的防病效果，为后续生物菌剂的开发提供了理论基础。

综上可知，本发明提供的一株卡氏芽孢杆菌BC30对烟草黑胫病具有良好防病效果、并对烟株具有显著促生作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一株卡氏芽孢杆菌(Bacillus cabrialesii)BC30，其特征在于，所述卡氏芽孢杆菌BC30的保藏编号为：CCTCC NO：M 2023167。

2.一种权利要求1所述的卡氏芽孢杆菌BC30在防治烟草黑胫病中的应用。

3.一种权利要求1所述的卡氏芽孢杆菌BC30在促进烟草植株生长中的应用。

4.一种权利要求1所述的卡氏芽孢杆菌BC30在促进烟草种子萌发中的应用。

5.一种发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂包括：

将如权利要求1所述的卡氏芽孢杆菌BC30进行发酵获得的发酵液；

或将所述发酵液经喷雾干燥获得干粉菌剂。

6.一种利用权利要求1所述的卡氏芽孢杆菌BC30防治烟草黑胫病的方法，其特征在于，所述方法包括：

将权利要求1所述的卡氏芽孢杆菌BC30或者权利要求5所述的发酵菌剂活化制备成发酵液；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵液中活菌浓度调至(1～3)×10⁸cfu/mL。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵液施用于烟草植株的根部时，将烟株移植天50后浇灌所述发酵液，连续浇灌5次，每隔4天浇灌一次。