CN114806960A - 一株蜡样芽胞杆yx53及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用 - Google Patents

一株蜡样芽胞杆yx53及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用 Download PDF

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姚晨虓
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邢国珍
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房文祎
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    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/32—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Bacillus (G)

Abstract

本发明涉及微生物应用领域，具体涉及一株蜡样芽胞杆YX53及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用，包括蜡样芽胞杆YX53的筛选和分析测定方法，蜡样芽胞杆YX53在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用；本发明公开一种对烟草镰刀菌根腐病原具有明显拮抗效果的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）YX53，并对其抑菌机理和促生特性进行了初步分析。该菌株对烟草主要根茎类病害抑菌谱广，主要通过抑制孢子萌发和菌丝生长对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌产生较强的抑菌效果，且可促进烟株生长发育，为后续研究和田间生物防治的应用奠定基础。

Description

一株蜡样芽胞杆YX53及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长 中的应用
技术领域
本发明涉及微生物应用领域，具体涉及一株蜡样芽胞杆YX53及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用。
背景技术
烟草(Nicotiana tabacum L.)属于茄科烟草属，是一种商业化的叶用经济作物(曾文艺等，2022)。中国是烟草种植面积和产量最大的国家(
Figure BDA0003643651680000011
等，2020)，病害一直是影响烟草生产的重要因素之一，据不完全统计，我国每年因病害造成的烟叶产量损失约10％-30％。近年来随着气候条件、土壤微生态和耕作制度等变化，烟草镰刀菌根腐病已成为危害烟草的重要根茎类真菌病害(李小杰等，2020)，引起烟草镰刀菌根腐病的主要病原是尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和茄病镰刀菌(Fusarium solani)(邱睿等，2018)。目前防治作物镰刀菌根腐病的主要策略是利用抗病品种和化学防治，但抗病种植资源有限、选育抗病品种周期长，化学防治主要是通过化学杀菌剂来杀死或抑制病原菌生长达到防治效果，烟草镰刀菌根腐病在苗床和大田期均可发生(于庆涛等，2018)，因此需要多次施用才能达到一定的防治效果，但长期使用化学药剂会造成环境污染、农药残留、病原菌产生抗药性等问题(邱睿等，2016)，长期大量使用化学农药还可加速病菌群体遗传结构生理分化和变异(程海洋等，2021)。近年来，植物病害的防治已由化学防治逐渐向生物防治转变，其中以拮抗微生物或其代谢产物为核心的生物防治技术因其针对性强、可选择范围广、对人畜安全无害、对环境无污染、不易引起病原菌耐药性等特点而备受学者们关注(韩长志，2015)，生防微生物的应用成为防治植物病虫害的重要手段，利用拮抗菌防治烟草病害已有相关报道(赵誉强等，2022)。针对烟草镰刀菌根腐病生防菌研究较多的是木霉菌(Trichoderma spp.)。
2021年从豫中烟区烟草根际土壤中分离筛选出对烟草尖孢镰刀菌具有拮抗作用的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)Tr-0111；2015年通过平板稀释法从洛阳地区烟田土壤中获得对尖孢镰刀菌具有较好拮抗效果的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、棘孢木霉、深绿木霉(Trichoderma atroviride)和毛簇木霉(Trichoderma viride)；2020年通过平板对峙筛选出对烟草镰刀菌根腐病病原菌具拮抗作用的两种木霉菌，粗壮木霉(Trichoderma strigosum)和钩状木霉(Trichoderma hamatum)；2019年从烟草根际土壤中分离筛选出对烟草尖孢镰刀菌具有较强抑制作用的放线菌金黄垂直链霉菌(Streptomycesaureoverticillatus)；2020年通过平板对峙试验结果表明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对木香尖孢镰刀菌的抑菌率均达到66％以上；2019年研究发现生防细菌JK2015对菌尖孢镰刀菌茄子专化型(Fusariumoxysporum f.sp.melongenae，Fom)和尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种(Fusariumoxysporum f.sp.cubense race 4，Foc4)抑菌效果显著，抑菌率达到52％以上；由此可见，目前关于烟草镰刀菌根腐病生防细菌相关研究相对较少。为筛选出对烟草镰刀菌根腐病病原菌有高效拮抗效果的生防细菌，本研究以豫中和豫西烟区健康烟株根际土壤为分离来源，利用平板对峙法对分离菌株的拮抗效果进行筛选，对抑菌率较高的菌株进行抑菌谱测定、防病促生作用测定、分类鉴定以及生防机理探索，以期为烟草为烟草镰刀菌根腐病生物防治药剂研发提供理论基础。
发明内容
本发明提供蜡样芽胞杆YX53及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用，用于克服现有技术中缺陷。
本发明采用的技术方案为：一株蜡样芽胞杆YX53，所述的蜡样芽胞杆YX53的筛选和分析测定方法的操作包括以下步骤：
步骤一：提供实验用的供试材料，供试材料包括采集健康烟株根际土壤样本；
步骤二：提供实验用的供试菌株，供试菌株包括烟草镰刀菌根腐病病原菌尖孢镰刀菌B-9-1、茄病镰刀菌A-4-9，烟草黑胫病病原菌寄生疫霉烟草致病变种、烟草根黑腐病病原菌烟草根串珠霉，烟草白绢病菌，烟草立枯病病原菌立枯丝核菌，鸢尾丝囊霉菌及烟草溃疡病病原菌葡萄座腔球菌：
步骤三：提供实验用的供试培养基，供试培养基包括LB液体培养基与PDA培养基；
步骤四：进行微生物分离，采用稀释涂布平板法，从土壤中分离纯化细菌菌株；
步骤五：筛选拮抗菌株，利用平板对峙培养法，以烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌为靶标病原菌，筛选拮抗细菌，并计算抑菌率；
步骤六：拮抗菌株的抑菌谱测定，采用平板对峙培养法，进行生防菌株对多种常见烟草病原真菌抑菌试验，从而筛选出具有较强抑制作用且抑菌谱广的拮抗菌株；
步骤七：拮抗菌株对烟草种子萌发及促生作用测定，采用培养皿滤纸保湿法，测量种子萌发及计算增长率；
步骤八：拮抗菌发酵滤液的抑菌活性测定，制备拮抗菌发酵滤液，采用平板打孔法测试生防菌发酵滤液的抑菌作用，测定拮抗菌发酵滤液对病原菌孢子萌发的影响作用；
步骤九：拮抗菌挥发性化合物的抑菌活性测定，计算相对抑菌率；
步骤十：拮抗细菌的鉴定，结果显示菌株YX53的16S rDNA基因序列与其比对的芽孢杆菌属同源相似度在99％，与蜡样芽胞杆菌EH11等的序列相似性达到100％，且位于同一进化分支；
步骤十一：拮抗细菌对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用测定，挑出大小一致的健壮烟苗，将烟苗根部浸泡于在拮抗细菌悬浮液中，进行拮抗菌悬浮液灌根，设置对照组，根据中华人民共和国国家标准中烟草根茎类病害分级及调查方法调查发病情况，计算发病情况及生防菌防效，根据中华人民共和国烟草行业标准中的农艺性状测量方法测定生防菌对农艺性状的影响，测量指标包括烟株的有效叶片数、最大叶长、最大叶宽、地上鲜重和根系鲜重。
上述的蜡样芽胞杆YX53在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用。
本发明有益效果是：首先，本发明筛选出的蜡样芽胞杆YX53对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌具有良好的拮抗作用，对多种常见烟草病原真菌抑菌具有较强的抑制效果，由平板对峙法结果可知，该株菌株对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的平均防效都在57％以上，利用平板对峙法对该株菌株的抑菌谱进行了测定。测定结果显示，该株菌株对供试的8种烟草根茎类病害病原菌均有不同程度的抑制作用。该生防菌株对茄病镰刀菌的平均抑菌率大于80％，对尖孢镰刀菌和烟草疫霉菌的抑菌率均大于50％，对烟草根串珠霉的抑菌率为42.80％，对烟草白绢病菌、立枯丝核菌、鸢尾丝囊霉菌和葡萄座腔球菌的抑菌率在19-39％之间；其次，本发明筛选出的蜡样芽胞杆YX53对抗菌处理组的烟苗根系较对照组均有不同程度增长，以YC53处理组根系发育最好，长且有分支，烟苗根长增长率达到161.61％，该拮抗菌株发酵滤液能抑制病原菌孢子萌发，LB液体培养基处理病原菌孢子萌发率达到45％以上，拮抗菌发酵滤液处理孢子萌发率仅有7％；再次，本发明筛选出的蜡样芽胞杆YX53对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用效果好，对烟草尖孢镰刀菌根腐病和茄病镰刀菌根腐病的平均防效分别为85.67％和97.06％，使得本发明可作为防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用的有效手段。
附图说明
图1为为本发明的蜡样芽胞杆YX53发酵滤液的抑菌活性对照图。
图2为本发明的拮抗菌挥发性有机化合物抑菌活性测定图，上排为尖孢镰刀菌，下排为茄病镰刀菌，左侧为CK处理,右侧为YX53处理。
图3为本发明的拮抗细菌的基于16S rDNA构建的系统发育树。
具体实施方式
如图1、2、3所示，一株蜡样芽胞杆YX53，所述的蜡样芽胞杆YX53的筛选和分析测定方法的操作包括以下步骤：
步骤一：提供实验用的供试材料，供试材料包括采集健康烟株根际土壤样本，5-8月从河南许昌襄城县、三门峡卢氏县、渑池县等烟田病株周边健株根际采集根际土样82份；
步骤二：提供实验用的供试菌株，供试菌株包括烟草镰刀菌根腐病病原菌尖孢镰刀菌B-9-1(Fusarium oxysporum)、茄病镰刀菌A-4-9(Fusarium solani)，烟草黑胫病病原菌寄生疫霉烟草致病变种(烟草疫霉Phytophthora nicotianae)、烟草根黑腐病病原菌烟草根串珠霉(Thielaviopsis basicola)，烟草白绢病菌(Sclerotium rolfsiii Sacc)，烟草立枯病病原菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，鸢尾丝囊霉菌(Aphanomyces iridis)及烟草溃疡病病原菌葡萄座腔球菌(Botryosphaeria dothide)，供试烟草品种，中烟100：
步骤三：提供实验用的供试培养基，供试培养基包括LB液体培养基与PDA培养基，LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加蒸馏水定容至1L(固体培养基加15g琼脂)，121℃高压灭菌30min。1/2LB固体培养基中各成分减半；PDA培养基：马铃薯葡萄糖琼脂39g，琼脂粉18g，加蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌30min。；
步骤四：进行微生物分离，采用稀释涂布平板法，从土壤中分离纯化细菌菌株，采用稀释涂布平板法：分别称取10g混匀的健康烟株根基土壤，放入250mL无菌三角瓶中，加入90mL无菌水后置于摇床震荡10min，使土样均匀分散在稀释液中，为10-1土壤悬浮液，再进行梯度稀释，依次稀释至10-4、10-5和10-6，各吸取100L稀释液涂布与1/2LB固体培养基上，28℃黑暗培养2d，挑取颜色、光泽、边缘光滑度和厚度不同的单菌落与新的LB固体培养基上进行划线纯化后，所得菌株斜面保存备用；
步骤五：筛选拮抗菌株，利用平板对峙培养法，以烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌为靶标病原菌，筛选拮抗细菌，并计算抑菌率，采用平板对峙法：以烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌为靶标病原菌，筛选拮抗细菌。用接针将分离到的细菌上下平行划线接种于距培养皿中心2.5cm处的PDA培养皿两边，28℃培养24h后，取培养5d的靶标病原菌，用直径5mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，接种于接有细菌的PDA平板中央，以不接拮抗细菌的真菌平板作为对照，置于28℃培养箱中恒温培养。待对照组病原菌菌落长满皿底时，测量处理组抑菌带宽度，计算抑菌率，每个处理3次重复；
Figure BDA0003643651680000061
步骤六：拮抗菌株的抑菌谱测定，采用平板对峙培养法，采用平板对峙培养法略有改动(平行划线改为对称点接种)，进行生防菌株对8种常见烟草病原真菌抑菌试验，每个处理3次重复，进行生防菌株对多种常见烟草病原真菌抑菌试验，从而筛选出具有较强抑制作用且抑菌谱广的拮抗菌株；
步骤七：拮抗菌株对烟草种子萌发及促生作用测定，采用培养皿滤纸保湿法，测量种子萌发及计算增长率，培养皿滤纸保湿法：将中烟100裸种依次用75％的乙醇和0.5％的次氯酸钠消毒30s，无菌水漂洗干净后放入拮抗细菌悬浮液(浓度为1×109cfu/mL)中浸种3h，再用无菌水漂洗3-4次后，将种子整齐摆放在无菌脱脂棉和滤纸保湿的培养皿中，以无菌水浸泡同等时间的消毒种子作为对照，每皿25粒种子(5×5)，重复3次，第10天测量统计种子萌发率及烟苗根长，计算增长率；
Figure BDA0003643651680000071
步骤八：拮抗菌发酵滤液的抑菌活性测定，制备拮抗菌发酵滤液，拮抗菌发酵滤液的制备：将LB斜面保存菌株接1环于盛有150mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养48h得到菌液原液。将上述培养得到的菌液经12000r/min离心10min，留上清液，用细菌过滤器(22μm)除菌过滤两次后得到无菌发酵滤液；采用平板打孔法测试生防菌发酵滤液的抑菌作用，测定拮抗菌发酵滤液对病原菌孢子萌发的影响作用；
步骤九：拮抗菌挥发性化合物的抑菌活性测定，测定生防菌株挥发性物质对靶标菌的抑制活性；在活化的靶标菌边缘上取直径5mm菌块置于新的PDA平板中央，用接菌环在LB平板上化满生防细菌菌株，将前者反口与后者之上，两皿接触处用封口膜密封，以空白的LB平板做对照，每个处理重复3次。28℃黑暗培养7d，测定对照和处理的靶标菌菌落直径，并计算相对抑菌率；
步骤十：拮抗细菌的鉴定，进行对16S rDNA基因序列PCR扩增。以待测菌株基因组DNA为模板，用通用引物27F和1492R(见表1)扩增待测细菌的16S rDNA序列。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min 30s，35个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，回收后的目标片段连接到pMD-19TVector上，含目的片段的单克隆菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。应用NCBI进行序列比对分析，采用MEGA7.0软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树，结果显示菌株YX53的16S rDNA基因序列与其比对的芽孢杆菌属同源相似度在99％，与蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)EH11等(MN750766.1)的序列相似性达到100％，且位于同一进化分支；
步骤十一：拮抗细菌对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用测定，挑出大小一致的健壮烟苗，将烟苗根部浸泡于在拮抗细菌悬浮液中，进行拮抗菌悬浮液灌根，设置对照组，方法：挑选健康、饱满的中烟100种子，漂浮育苗法培养至大十字期(3-4片真叶)，用无菌镊子轻轻挑出大小一致的健壮烟苗，无菌轻轻水涮洗掉烟苗根部基质，将烟苗根部浸泡于浓度为1×109cfu/mL的拮抗细菌悬浮液中30min，移栽至装有无菌基质的灭菌花盆(85×70mm)中培养2d后，进行拮抗菌悬浮液灌根，每株20mL，灌根结束后24h，在烟根周围接种预先培养好的带有靶标菌的麦粒，5g/每株。共设置3个对照组，对照组1无菌水侵泡烟苗接种靶标菌，对照组2拮抗菌悬浮液浸泡烟苗接种无菌麦粒，对照组3无菌水侵泡烟苗接种无菌麦粒。接靶标菌后48h，再次进行拮抗菌悬浮液灌根，每株20mL，以等体积无菌水灌根处理对照1和3。每处理5株盆。培养第30d；根据中华人民共和国国家标准(GB/T23222-2008)中烟草根茎类病害分级及调查方法调查发病情况，计算发病情况及生防菌防效，根据中华人民共和国烟草行业标准(YC/T142-2010)中的农艺性状测量方法测定生防菌对农艺性状的影响，测量指标包括烟株的有效叶片数、最大叶长、最大叶宽、地上鲜重和根系鲜重；
测量指标包括烟株的有效叶片数、最大叶长、最大叶宽、地上鲜重和根系鲜重，叶面积(m2)＝0.6345×叶长(cm)×叶宽(cm)。
Figure BDA0003643651680000091
Figure BDA0003643651680000092
上述的蜡样芽胞杆YX53在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用。
本产品使用方法如下：(1)：提供实验用的供试材料，供试材料包括采集健康烟株根际土壤样本，5-8月从河南许昌襄城县、三门峡卢氏县、渑池县等烟田病株周边健株根际采集根际土样82份；
(2)：提供实验用的供试菌株，供试菌株包括烟草镰刀菌根腐病病原菌尖孢镰刀菌B-9-1(Fusarium oxysporum)、茄病镰刀菌A-4-9(Fusarium solani)，烟草黑胫病病原菌寄生疫霉烟草致病变种(烟草疫霉Phytophthora nicotianae)、烟草根黑腐病病原菌烟草根串珠霉(Thielaviopsis basicola)，烟草白绢病菌(Sclerotium rolfsiii Sacc)，烟草立枯病病原菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，鸢尾丝囊霉菌(Aphanomyces iridis)及烟草溃疡病病原菌葡萄座腔球菌(Botryosphaeria dothide)，供试烟草品种，中烟100：
(3)：提供实验用的供试培养基，供试培养基包括LB液体培养基与PDA培养基，LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加蒸馏水定容至1L(固体培养基加15g琼脂)，121℃高压灭菌30min。1/2LB固体培养基中各成分减半；PDA培养基：马铃薯葡萄糖琼脂39g，琼脂粉18g，加蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌30min。；
(4)：进行微生物分离，采用稀释涂布平板法，从土壤中分离纯化细菌菌株，采用稀释涂布平板法：分别称取10g混匀的健康烟株根基土壤，放入250mL无菌三角瓶中，加入90mL无菌水后置于摇床震荡10min，使土样均匀分散在稀释液中，为10-1土壤悬浮液，再进行梯度稀释，依次稀释至10-4、10-5和10-6，各吸取100L稀释液涂布与1/2LB固体培养基上，28℃黑暗培养2d，挑取颜色、光泽、边缘光滑度和厚度不同的单菌落与新的LB固体培养基上进行划线纯化后，所得菌株斜面保存备用；
(5)：筛选拮抗菌株，利用平板对峙培养法，以烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌为靶标病原菌，筛选拮抗细菌，并计算抑菌率，采用平板对峙法：以烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌为靶标病原菌，筛选拮抗细菌。用接针将分离到的细菌上下平行划线接种于距培养皿中心2.5cm处的PDA培养皿两边，28℃培养24h后，取培养5d的靶标病原菌，用直径5mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，接种于接有细菌的PDA平板中央，以不接拮抗细菌的真菌平板作为对照，置于28℃培养箱中恒温培养。待对照组病原菌菌落长满皿底时，测量处理组抑菌带宽度，计算抑菌率，每个处理3次重复；
Figure BDA0003643651680000101
(6)：拮抗菌株的抑菌谱测定，采用平板对峙培养法，采用平板对峙培养法略有改动(平行划线改为对称点接种)，进行生防菌株对8种常见烟草病原真菌抑菌试验，每个处理3次重复，进行生防菌株对多种常见烟草病原真菌抑菌试验，从而筛选出具有较强抑制作用且抑菌谱广的拮抗菌株；
(7)：拮抗菌株对烟草种子萌发及促生作用测定，采用培养皿滤纸保湿法，测量种子萌发及计算增长率，培养皿滤纸保湿法：将中烟100裸种依次用75％的乙醇和0.5％的次氯酸钠消毒30s，无菌水漂洗干净后放入拮抗细菌悬浮液(浓度为1×109cfu/mL)中浸种3h，再用无菌水漂洗3-4次后，将种子整齐摆放在无菌脱脂棉和滤纸保湿的培养皿中，以无菌水浸泡同等时间的消毒种子作为对照，每皿25粒种子(5×5)，重复3次，第10天测量统计种子萌发率及烟苗根长，计算增长率；
Figure BDA0003643651680000111
(8)：拮抗菌发酵滤液的抑菌活性测定，制备拮抗菌发酵滤液，拮抗菌发酵滤液的制备：将LB斜面保存菌株接1环于盛有150mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养48h得到菌液原液。将上述培养得到的菌液经12000r/min离心10min，留上清液，用细菌过滤器(22μm)除菌过滤两次后得到无菌发酵滤液；采用平板打孔法测试生防菌发酵滤液的抑菌作用，测定拮抗菌发酵滤液对病原菌孢子萌发的影响作用；
(9)：拮抗菌挥发性化合物的抑菌活性测定，测定生防菌株挥发性物质对靶标菌的抑制活性；在活化的靶标菌边缘上取直径5mm菌块置于新的PDA平板中央，用接菌环在LB平板上化满生防细菌菌株，将前者反口与后者之上，两皿接触处用封口膜密封，以空白的LB平板做对照，每个处理重复3次。28℃黑暗培养7d，测定对照和处理的靶标菌菌落直径，并计算相对抑菌率；
(10)：拮抗细菌的鉴定，进行对16S rDNA基因序列PCR扩增。以待测菌株基因组DNA为模板，用通用引物27F和1492R(见表1)扩增待测细菌的16S rDNA序列。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min 30s，35个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，回收后的目标片段连接到pMD-19T Vector上，含目的片段的单克隆菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。应用NCBI进行序列比对分析，采用MEGA7.0软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树，结果显示菌株YX53的16S rDNA基因序列与其比对的芽孢杆菌属同源相似度在99％，与蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)EH11等(MN750766.1)的序列相似性达到100％，且位于同一进化分支；
(11)：拮抗细菌对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用测定，挑出大小一致的健壮烟苗，将烟苗根部浸泡于在拮抗细菌悬浮液中，进行拮抗菌悬浮液灌根，设置对照组，方法：挑选健康、饱满的中烟100种子，漂浮育苗法培养至大十字期(3-4片真叶)，用无菌镊子轻轻挑出大小一致的健壮烟苗，无菌轻轻水涮洗掉烟苗根部基质，将烟苗根部浸泡于浓度为1×109cfu/mL的拮抗细菌悬浮液中30min，移栽至装有无菌基质的灭菌花盆(85×70mm)中培养2d后，进行拮抗菌悬浮液灌根，每株20mL，灌根结束后24h，在烟根周围接种预先培养好的带有靶标菌的麦粒，5g/每株。共设置3个对照组，对照组1无菌水侵泡烟苗接种靶标菌，对照组2拮抗菌悬浮液浸泡烟苗接种无菌麦粒，对照组3无菌水侵泡烟苗接种无菌麦粒。接靶标菌后48h，再次进行拮抗菌悬浮液灌根，每株20mL，以等体积无菌水灌根处理对照1和3。每处理5株盆。培养第30d；根据中华人民共和国国家标准(GB/T23222-2008)中烟草根茎类病害分级及调查方法调查发病情况，计算发病情况及生防菌防效，根据中华人民共和国烟草行业标准(YC/T142-2010)中的农艺性状测量方法测定生防菌对农艺性状的影响，测量指标包括烟株的有效叶片数、最大叶长、最大叶宽、地上鲜重和根系鲜重；
测量指标包括烟株的有效叶片数、最大叶长、最大叶宽、地上鲜重和根系鲜重，叶面积(m2)＝0.6345×叶长(cm)×叶宽(cm)。
Figure BDA0003643651680000131
Figure BDA0003643651680000132
本发明实验结果与分析：
(1)数据统计与分析，根据表1所示，数据处理采用Excel和DPS7.05软件分析，方差分析采用Duncan新复极差法。
表1检测引物信息
Table1 PCR primers for bacterial species identification and genetesting
Figure BDA0003643651680000133
(2)生防菌株的分离筛选的实验结果与分析，根据表2所示，从82份土壤样品分离得到90株细菌，通过平板对峙法筛选得到拮抗作用较好的菌株YX53，该菌株分离自河南渑池县烟区健株根际土壤。由平板对峙法结果可知，该株菌株对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的平均防效都在57％以上。
表2生防菌对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的抑菌效果
Table 2 Biocontrol effect of the selected bacteria onF.oxysporum andF.solani of tobacco
Figure BDA0003643651680000134
注：表中数据为3次重复的平均值；同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；下同
Note:The data in the table were means±SE.The different lowercaseletters in the table represents 5％significant difference level(P<0.05).Thesame below.
(3)生防菌株抑菌谱测定结果与分析，根据表3所示，为了研究筛选的生防菌株的生防潜力，利用平板对峙法对该株菌株的抑菌谱进行了测定。测定结果显示，该株菌株对供试的8种烟草根茎类病害病原菌均有不同程度的抑制作用。该生防菌株对茄病镰刀菌的平均抑菌率大于80％，对尖孢镰刀菌和烟草疫霉菌的抑菌率均大于50％，对烟草根串珠霉的抑菌率为42.80％，对烟草白绢病菌、立枯丝核菌、鸢尾丝囊霉菌和葡萄座腔球菌的抑菌率在19-39％之间。
表3生防菌株YX53对8种病原菌抑菌效果
Table3 Inhibitory effort of the selected strainYX53 on the 8 plantpathogens
Figure BDA0003643651680000141
(4)拮抗菌株对烟草种子萌发及促生作用测定结果与分析，根据表4与图1所示，试验结果表明，拮抗菌处理组的烟苗根系较对照组均有不同程度增长，以YC53处理组根系发育最好，长且有分支，烟苗根长增长率达到161.61％。
表4生防菌对烟草根系发育影响测定
Table 4 Effects of the strain YX53 on root development
Figure BDA0003643651680000142
(5)拮抗菌发酵滤液的抑菌活性测定结果与分析，根据表5所示，孢子萌发试验结果表明，该拮抗菌株发酵滤液能抑制病原菌孢子萌发，LB液体培养基处理病原菌孢子萌发率达到45％以上，拮抗菌发酵滤液处理孢子萌发率仅有7％。
表5生防菌发酵液对病原菌孢子萌发的影响
Table 5 Effects of fermentation filtrate of the strain YX53 on sporegermination rate
Figure BDA0003643651680000143
(6)拮抗菌挥发性化合物的抑菌活性测定结果与分析，根据表6所示，测定结果显示，该拮抗菌株挥发性化合物对茄病镰刀菌的抑菌效率为26.41％，且影响菌落形态，对照菌株菌落边缘整齐、边缘菌丝直，显微观察有孢子产生，拮抗菌处理菌株气生菌丝丰富浓密，菌落中心凸起，菌落边缘不整齐、菌丝相互交织，显微观察无孢子。该拮抗菌VOC对尖孢镰刀菌没有抑制作用，但对尖孢镰刀菌菌落形态有较大影响，对照菌株菌落边缘整齐、边缘菌丝直，菌落表面有白色粉样组织，背面培养基中有粉色色素产生，YX53处理菌株气生菌丝旺盛，中央白色菌丝外圈紧贴培养基产生紫色色素圈，产孢量降低，如图2所示。
表6生防菌株VOC对病原菌抑菌效果
Table6 Inhibitory effort of the strain YX53 on the plant pathogens
Figure BDA0003643651680000151
(7)拮抗细菌的鉴定结果与分析，根据图3所示，BLAST结果显示，YX53的16S rDNA基因序列与其比对的芽孢杆菌属同源相似度在99％，与蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)EH11等(MN750766.1)的序列相似性达到100％，且位于同一进化分支。
(8)拮抗细菌对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用测定结果与分析，根据表7所示，盆栽防效试验结果表明，该生防细菌对烟草镰刀菌根腐病有防治效果，接种烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的对照处理发病率均为100％，病情指数分别为81.00和40.00，该生防细菌处理均能显著降低烟草镰刀菌根腐病的发病率和病情指数，该菌株对烟草尖孢镰刀菌根腐病和茄病镰刀菌根腐病的平均防效分别为85.67％和97.06％；盆栽促生实验结果表明，该生防菌处理烟株有效叶片数与对照组无显著差异，在最大叶面积、地上鲜重、根系鲜重、总根长、总根表面积等农艺性状指标上均较对照有显著的促进作用，其处理烟株最大叶面积、地上鲜重、根系鲜重、总根长、总根表面积和总根体积较对照分别提高了353.28％、610.57％、1528.57％、194.31％、97.99％和940％。
表7生防菌株对烟草镰刀菌根腐病的防治效果
Table 7 Control effect of antibacterials on tobacco Fusarium root rot
Figure BDA0003643651680000161
表8生防细菌对盆栽烟草的促生效果
Table 8 Growth-promoting effect of the 4 strains on potted tobaccoseedlings
Figure BDA0003643651680000162
本发明公开一种对烟草镰刀菌根腐病原具有明显拮抗效果的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)YX53，并对其抑菌机理和促生特性进行了初步分析。该菌株对烟草主要根茎类病害抑菌谱广，主要通过抑制孢子萌发和菌丝生长对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌产生较强的抑菌效果，且可促进烟株生长发育，为后续研究和田间生物防治的应用奠定基础。

Claims (2)

1.一株蜡样芽胞杆YX53，其特征在于：所述的蜡样芽胞杆YX53的筛选和分析测定方法的操作包括以下步骤：
步骤一：提供实验用的供试材料，供试材料包括采集健康烟株根际土壤样本；
步骤二：提供实验用的供试菌株，供试菌株包括烟草镰刀菌根腐病病原菌尖孢镰刀菌B-9-1、茄病镰刀菌A-4-9，烟草黑胫病病原菌寄生疫霉烟草致病变种、烟草根黑腐病病原菌烟草根串珠霉，烟草白绢病菌，烟草立枯病病原菌立枯丝核菌，鸢尾丝囊霉菌及烟草溃疡病病原菌葡萄座腔球菌：
步骤三：提供实验用的供试培养基，供试培养基包括LB液体培养基与PDA培养基；
步骤四：进行微生物分离，采用稀释涂布平板法，从土壤中分离纯化细菌菌株；
步骤五：筛选拮抗菌株，利用平板对峙培养法，以烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌为靶标病原菌，筛选拮抗细菌，并计算抑菌率；
步骤六：拮抗菌株的抑菌谱测定，采用平板对峙培养法，进行生防菌株对多种常见烟草病原真菌抑菌试验，从而筛选出具有较强抑制作用且抑菌谱广的拮抗菌株；
步骤七：拮抗菌株对烟草种子萌发及促生作用测定，采用培养皿滤纸保湿法，测量种子萌发及计算增长率；
步骤八：拮抗菌发酵滤液的抑菌活性测定，制备拮抗菌发酵滤液，采用平板打孔法测试生防菌发酵滤液的抑菌作用，测定拮抗菌发酵滤液对病原菌孢子萌发的影响作用；
步骤九：拮抗菌挥发性化合物的抑菌活性测定，计算相对抑菌率；
步骤十：拮抗细菌的鉴定，结果显示菌株YX53的16S rDNA基因序列与其比对的芽孢杆菌属同源相似度在99%，与蜡样芽胞杆菌EH11等的序列相似性达到100%，且位于同一进化分支；
步骤十一：拮抗细菌对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用测定，挑出大小一致的健壮烟苗，将烟苗根部浸泡于在拮抗细菌悬浮液中，进行拮抗菌悬浮液灌根，设置对照组，根据中华人民共和国国家标准中烟草根茎类病害分级及调查方法调查发病情况，计算发病情况及生防菌防效，根据中华人民共和国烟草行业标准中的农艺性状测量方法测定生防菌对农艺性状的影响，测量指标包括烟株的有效叶片数、最大叶长、最大叶宽、地上鲜重和根系鲜重。
2.根据权利要求1所述的蜡样芽胞杆YX53在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115486338A (zh) * 2022-10-24 2022-12-20 河北科技师范学院 一种用于提高北苍术成苗率的育苗方法
CN116286536A (zh) * 2023-03-28 2023-06-23 吉林农业大学 一种芽孢杆菌属蜡样芽孢杆菌yz-228及其应用
CN116286536B (zh) * 2023-03-28 2024-05-10 吉林农业大学 一种芽孢杆菌属蜡样芽孢杆菌yz-228及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107384831A (zh) * 2017-08-28 2017-11-24 福建省农业科学院农业生物资源研究所 拮抗根腐的芽孢杆菌
CN113980846A (zh) * 2021-10-27 2022-01-28 河南省农业科学院烟草研究所 一种拮抗尖孢镰刀菌的高效抗逆贝莱斯芽孢杆菌

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107384831A (zh) * 2017-08-28 2017-11-24 福建省农业科学院农业生物资源研究所 拮抗根腐的芽孢杆菌
CN113980846A (zh) * 2021-10-27 2022-01-28 河南省农业科学院烟草研究所 一种拮抗尖孢镰刀菌的高效抗逆贝莱斯芽孢杆菌

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115486338A (zh) * 2022-10-24 2022-12-20 河北科技师范学院 一种用于提高北苍术成苗率的育苗方法
CN115486338B (zh) * 2022-10-24 2024-05-14 河北科技师范学院 一种用于提高北苍术成苗率的育苗方法
CN116286536A (zh) * 2023-03-28 2023-06-23 吉林农业大学 一种芽孢杆菌属蜡样芽孢杆菌yz-228及其应用
CN116286536B (zh) * 2023-03-28 2024-05-10 吉林农业大学 一种芽孢杆菌属蜡样芽孢杆菌yz-228及其应用

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