CN114703101A - 一株铜绿假单胞菌yz66及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用 - Google Patents

一株铜绿假单胞菌yz66及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用 Download PDF

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Abstract

一株铜绿假单胞菌YZ66在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用；本发明公开一种对烟草镰刀菌根腐病原具有明显拮抗效果的铜绿假单胞菌YZ66，并对其抑菌机理和促生特性进行了初步分析；该菌株对烟草主要根茎类病害抑菌谱广，主要通过菌体产生的抗生素抑制孢子萌发和菌丝生长对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌产生较强的抑菌效果，且可促进烟株生长发育，为后续研究和田间生物防治的应用奠定基础。

Description

一株铜绿假单胞菌YZ66及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生 长中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株铜绿假单胞菌YZ66及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用。
背景技术
烟草镰刀菌根腐病是由镰刀菌属病原菌(Fusarium spp.)引起的一种真菌性病害，尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和茄病镰刀菌(F.solani)是优势致病菌，主要从烟株根部入侵，导致根部变黑，叶片变黄萎靡，维管束腐烂，最终植物整株死亡，给烟叶生产带来严重灾害(Berruezo等，2018)。生产上以化学药剂蘸根移栽和穴施药剂进行防治，但长期施用化学药剂会造成病原菌的耐药性和农药残留，给生态环境和人体健康带来负面影响(李明等，2002)。近年来，植物病害的防治已由化学防治逐渐向生物防治转变，其中以拮抗微生物或其代谢产物为核心的生物防治技术因其针对性强、可选择范围广、对人畜安全无害、对环境无污染、不易引起病原菌耐药性等特点而备受学者们关注(乔康等，2009)，利用拮抗菌防治烟草病害已有相关报道(赵誉强等，2022)，针对烟草镰刀菌根腐病生防菌研究较多的是真菌木霉菌(Trichoderma spp.)(姚晨虓等，2021)。部分研究者发现链霉菌(Streptomycesaureoverticillatus)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)等细菌也对尖孢镰刀菌有较好防效。目前关于烟草镰刀菌根腐病生防细菌相关研究相对较少。为筛选出对烟草镰刀菌根腐病病原菌有高效拮抗效果的生防细菌，本研究以豫中和豫西烟区健康烟株根际土壤为分离来源，利用平板对峙法对分离菌株的拮抗效果进行筛选，对抑菌率较高的菌株进行抑菌谱测定、防病促生作用测定、分类鉴定以及生防机理探索，以期为烟草为烟草镰刀菌根腐病生物防治药剂研发提供理论基础。
发明内容
本发明提供一株铜绿假单胞菌YZ66及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用。
本发明采用的技术方案为：
一株铜绿假单胞菌YZ66，所述的铜绿假单胞菌YZ66的筛选和分析的具体操作步骤如下：
(1)从河南豫中和豫西烟区健康烟株根基土壤中分离纯化细菌菌株；
(2)拮抗细菌的筛选；
(3)拮抗细菌的抑菌谱测定；
(4)拮抗菌株对烟草种子萌发及促生作用测定；
(5)拮抗菌发酵滤液的抑菌活性测定；
(6)拮抗菌挥发性化合物的抑菌活性测定；
(7)拮抗细菌的鉴定；
(8)拮抗菌抗生素合成基因检测；
(9)拮抗细菌对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用测定。
一株铜绿假单胞菌YZ66在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用。
本发明的有益效果是：本发明筛选出对烟草尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和茄病镰刀菌(Fusariumsolani)均具有良好拮抗作用的菌株YZ66，利用分子生物学方法分别鉴定为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa。平板抑菌试验测定表明，菌株YZ66对尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的抑制效率均在80％左右，对烟草疫霉菌、根串珠霉菌等其他5种烟草根茎类病害病原菌均有较强的抑制效果。促生作用测定结果表明，细菌YZ66对烟苗根系增长率可达66.96％。盆栽试验结果显示，菌株YZ66对烟草根腐病的防治效果高于85％，且能协调改善盆栽烟草的生长发育，在一定程度上增加了烟株叶面积、根长、地上和地下部鲜重具有显著的促进作用。抑菌机理研究结果表明，菌株YZ66挥发性有机化合物可通过抑制菌丝生长及孢子产量达到抑菌效果；菌株发酵滤液处理的病原菌孢子萌平均发率较对照降低了87％以上；YZ66含吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylic acid，PCA)合成基因。菌株YZ66对烟草镰刀菌根腐病有较好生防潜力，具有进一步开发的前景。
附图说明
图1为本发明的拮抗菌YZ66的抑菌谱测定结果，图1中从左到右依次为茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌、葡萄座腔球菌、烟草疫霉菌、鸢尾丝囊霉菌、烟草白绢病菌、烟草根串珠霉、立枯丝核菌。
图2为本发明的拮抗菌挥发性有机化合物抑菌活性测定结果，图2中上排为尖孢镰刀菌，下排为茄病镰刀菌，左为CK，右为YZ66处理。
图3为本发明的基于16S rDNA构建的系统发育树。
图4为本发明的菌株PCA合成相关基因检测结果，图4中：M：DL2000 Marker；1-4为枯草芽孢杆菌，5-6为YZ66的PCA合成相关基因，7为无菌水对照。
具体实施方式
一株铜绿假单胞菌YZ66，所述的铜绿假单胞菌YZ66的筛选和分析测定的具体操作步骤如下：
(1)从河南豫中和豫西烟区健康烟株根基土壤中分离纯化细菌菌株；
(2)拮抗细菌的筛选；
(3)拮抗细菌的抑菌谱测定；
(4)拮抗菌株对烟草种子萌发及促生作用测定；
(5)拮抗菌发酵滤液的抑菌活性测定；
(6)拮抗菌挥发性化合物的抑菌活性测定；
(7)拮抗细菌的鉴定；
(8)拮抗菌抗生素合成基因检测；
(9)拮抗细菌对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用测定。
一株铜绿假单胞菌YZ66在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用。
1材料与方法
1.1供试材料
1.1.1供试土样
2021年5-8月从河南许昌襄城县、三门峡卢氏县、渑池县等烟田病株周边健株根际采集根际土样82份。
1.1.2供试菌株
烟草镰刀菌根腐病病原菌尖孢镰刀菌B-9-1(Fusariumoxysporum)、茄病镰刀菌A-4-9(Fusariumsolani)，烟草黑胫病病原菌寄生疫霉烟草致病变种(烟草疫霉Phytophthoranicotianae)，烟草根黑腐病病原菌烟草根串珠霉(Thielaviopsisbasicola)，烟草白绢病菌(SclerotiumrolfsiiiSacc)，烟草立枯病病原菌立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)，鸢尾丝囊霉菌(Aphanomycesiridis)及烟草溃疡病病原菌葡萄座腔球菌(Botryosphaeriadothide)均由河南省农业科学院烟草研究所提供。
1.1.3供试烟草品种中烟100。
1.1.4供试培养基
LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加蒸馏水定容至1L(固体培养基加15g琼脂)，121℃高压灭菌30min。1/2LB固体培养基中各成分减半。
PDA培养基：马铃薯葡萄糖琼脂39g，琼脂粉18g，加蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌30min。
1.2试验方法
1.2.1拮抗细菌分离纯化
采用稀释涂布平板法。分别称取10g混匀的健康烟株根基土壤，放入250mL无菌三角瓶中，加入90mL无菌水后置于摇床震荡10min，使土样均匀分散在稀释液中，为10-1土壤悬浮液，再进行梯度稀释，依次稀释至10-4、10-5和10-6，各吸取100μL稀释液涂布于1/2LB固体培养基上，28℃黑暗培养2d，挑取颜色、光泽、边缘光滑度和厚度不同的单菌落与新的LB固体培养基上进行划线纯化后，所得菌株斜面保存备用。
1.2.2拮抗细菌的筛选
采用平板对峙法，以烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌为靶标病原菌，筛选拮抗细菌。用接针将分离到的细菌上下平行划线接种于距培养皿中心2.5cm处的PDA培养皿两边，28℃培养24h后，取培养5d的靶标病原菌，用直径5mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，接种于接有细菌的PDA平板中央，以不接拮抗细菌的真菌平板作为对照，置于28℃培养箱中恒温培养。待对照组病原菌菌落长满皿底时，测量处理组抑菌带宽度，计算抑菌率，每个处理3次重复。
Figure BDA0003590348320000051
1.2.3拮抗细菌的抑菌谱测定
采用平板对峙培养法(2010)略有改动(平行划线改为对称点接种)，进行生防菌株对8种常见烟草病原真菌抑菌试验。每个处理3次重复。
1.2.4拮抗菌株对烟草种子萌发及促生作用测定
参照姚晨虓等(2021)的培养皿滤纸保湿法，将中烟100裸种依次用75％的乙醇和0.5％的次氯酸钠消毒30s，无菌水漂洗干净后放入拮抗细菌悬浮液(浓度为1×109cfu/mL)中浸种3h，再用无菌水漂洗3-4次后，将种子整齐摆放在无菌脱脂棉和滤纸保湿的培养皿中，以无菌水浸泡同等时间的消毒种子作为对照，每皿25粒种子(5×5)，重复3次，第10天测量统计种子萌发率及烟苗根长，计算增长率。
Figure BDA0003590348320000061
1.2.5拮抗菌发酵滤液的抑菌活性测定
拮抗菌发酵滤液的制备：将LB斜面保存菌株接1环于盛有150mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养48h得到菌液原液。将上述培养得到的菌液经12000r/min离心10min，留上清液，用细菌过滤器(22μm)除菌过滤两次后得到无菌发酵滤液。
拮抗菌发酵滤液对病原菌孢子萌发的影响作用：参照千慧敏等的方法(2020)，收集病原菌分生孢子，将孢子浓度调至1×107孢子/mL，分别与4株拮抗菌株发酵滤液等体积混合，25℃共培养24h，在光学显微镜下观察孢子萌发情况，无菌LB液体培养基滤液处理为对照，每个处理重复3次。
1.2.6拮抗菌挥发性化合物的抑菌活性测定
参照杨艺炜等(2018)的方法，测定生防菌株挥发性物质对靶标菌的抑制活性。在活化的靶标菌边缘上取直径5mm菌块置于新的PDA平板中央，用接菌环在LB平板上化满生防细菌菌株，将前者反口与后者之上，两皿接触处用封口膜密封，以空白的LB平板做对照，每个处理重复3次。28℃黑暗培养7d，测定对照和处理的靶标菌菌落直径，并计算相对抑菌率。
1.2.7拮抗细菌的鉴定
参考千慧敏(2019)等方法进行16S rDNA基因序列PCR扩增。以待测菌株基因组DNA为模板，用通用引物27F和1492R，见表1，扩增待测细菌的16S rDNA序列。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min 30s，35个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，回收后的目标片段连接到pMD-19T Vector上，含目的片段的单克隆菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。应用NCBI进行序列比对分析，采用MEGA7.0软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树。
1.2.8拮抗菌抗生素合成基因检测
将拮抗假单胞菌菌株接于LB液体培养基中，180r/min振荡培养24h，取2mL菌液离心后留沉淀，用细菌DNA提取试剂盒提取菌株DNA。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成假单胞杆菌的DAPG和PCA合成基因的特异性引物，见表1，PCR扩增后将特异性条带回收并克隆，送由生工测序。用NCBI BLAST比对分析DNA序列。
1.2.9拮抗细菌对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用测定
挑选健康、饱满的中烟100种子，漂浮育苗法培养至大十字期(3-4片真叶)，用无菌镊子轻轻挑出大小一致的健壮烟苗，无菌水轻轻涮洗掉烟苗根部基质，将烟苗根部浸泡于浓度为1×109cfu/mL的拮抗细菌悬浮液中30min，移栽至装有无菌基质的灭菌花盆(85×70mm)中培养2d后，进行拮抗菌悬浮液灌根，每株20mL，灌根结束后24h，在烟根周围接种预先培养好的带有靶标菌的麦粒，5g/每株。共设置3个对照组，对照组1无菌水侵泡烟苗接种靶标菌，对照组2拮抗菌悬浮液浸泡烟苗接种无菌麦粒，对照组3无菌水侵泡烟苗接种无菌麦粒。接靶标菌后48h，再次进行拮抗菌悬浮液灌根，每株20mL，以等体积无菌水灌根处理对照1和3。每处理5株盆。培养第30d根据中华人民共和国国家标准(GB/T23222-2008)中烟草根茎类病害分级及调查方法调查发病情况，计算发病情况及生防菌防效；根据中华人民共和国烟草行业标准(YC/T142-2010)中的农艺性状测量方法测定生防菌对农艺性状的影响，测量指标包括烟株的有效叶片数、最大叶长、最大叶宽、地上鲜重和根系鲜重，叶面积(m2)＝0.6345×叶长(cm)×叶宽(cm)。
Figure BDA0003590348320000081
Figure BDA0003590348320000082
1.3数据统计与分析
数据处理采用Excel和DPS7.05软件分析，方差分析采用Duncan新复极差法。
表1检测引物信息
Figure BDA0003590348320000083
2结果与分析
1.1生防菌株的分离筛选
从82份土壤样品分离得到90株细菌，通过平板对峙法筛选得到拮抗作用较好的菌株YZ66，该菌株分离自河南襄城县烟区健康烟株根际土。由平板对峙法结果可知，该菌株对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的抑菌效率达到约80％，见表2。
表2生防菌对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的抑菌效果
Figure BDA0003590348320000091
注：表中数据为3次重复的平均值；同列数据后的不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；下同
1.2生防菌株抑菌谱测定
究生防菌株的生防潜力，利用平板对峙法对菌株YZ66的抑菌谱进行了测定。测定结果显示，该菌株对供试的8种烟草根茎类病害病原菌均有不同程度的抑制作用，如表3、图1所示。该生防菌株对烟草疫霉菌的平均抑菌率均大于80％，对尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、烟草根串珠霉的抑菌率均大于74％，对烟草白绢病菌、鸢尾丝囊霉菌和葡萄座腔球菌的抑菌率均大于60％，对立枯丝核菌的抑菌率最低，为44.36％。
表3 4株生防菌株对8种病原菌抑菌效果
Figure BDA0003590348320000092
Figure BDA0003590348320000101
2.3拮抗菌株对烟草根系促生作用测定
试验结果表明，拮抗菌处理组的烟苗根系较对照组有显著增长，拮抗菌处理组烟苗根系生长率达到了65％以上，见表4。
表4生防菌对烟草根系发育影响测定
Figure BDA0003590348320000102
2.4拮抗菌发酵滤液的抑菌活性测定
孢子萌发试验结果表明，拮抗菌株发酵滤液可抑制病原菌孢子萌发，LB液体培养基处理病原菌孢子萌发率达到45％以上，拮抗菌发酵滤液处理孢子萌发率仅有3.11％-6.47％，见表5。
表5生防菌发酵液对病原菌孢子萌发的影响
Figure BDA0003590348320000103
2.5拮抗菌挥发性化合物的抑菌活性测定
测定结果显示，拮抗菌株YZ66挥发性化合物对茄病镰刀菌的抑菌效率为29.25％，见表6，且影响菌落形态，对照菌株菌落边缘整齐、边缘菌丝直，显微观察有孢子产生，拮抗菌处理菌株气生菌丝丰富浓密，菌落中心凸起，菌落边缘不整齐、菌丝相互交织，显微观察无孢子。拮抗菌VOC对尖孢镰刀菌没有抑制作用，但对尖孢镰刀菌菌落形态有较大影响，对照菌株菌落边缘整齐、边缘菌丝直，菌落表面有白色粉样组织，背面培养基中有粉色色素产生，YX66气生菌丝浓密，菌落边缘整齐，呈现淡粉色圆圈，背面产生淡紫色色素，见图2。
表6 4株生防菌株VOC对病原菌抑菌效果
Figure BDA0003590348320000111
2.6拮抗细菌的鉴定
BLAST结果显示，菌株YZ66的16s RDNA序列与铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)NC5(MT903394.1)等的序列相似性达到100％，且位于同一分支，如图3所示，鉴定YZ66为假单胞菌属的铜绿假单胞菌。
2.7拮抗菌抗生素合成基因检测
序列扩增结果显示，菌株YZ66可以扩增到600bp左右的特异性条带，如图4所示，样品经测序，YZ66得到595bp的序列，NCBI数据库Blast结果显示，YZ66 PCA合成相关基因(OM719879)序列与Pseudomonas aeruginosastrain PA1201 phzG2(KX180138.1)基因的相似性为98.99％，与Pseudomonas aeruginosastrain PA2101 PhzG2(MN044391.1)基因的相似性为98.82％，未扩增出DAPG相关基因片段。
2.8拮抗细菌对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用测定
盆栽防效试验结果表明，生防细菌YZ66对烟草镰刀菌根腐病有很好防治效果，接种烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的对照处理发病率均为100％，病情指数分别为81.00和40.00，生防细菌YZ66处理能显著降低烟草镰刀菌根腐病的发病率和病情指数。YZ66对烟草尖孢镰刀菌根腐病的平均防效为85.67％，对茄病镰刀菌的防效均达到89.16％，见表7。
表7生防菌株对烟草镰刀菌根腐病的防治效果
Figure BDA0003590348320000121
盆栽促生实验结果表明，生防菌YZ66处理烟株有效叶片数与对照组无显著差异，在最大叶面积、地上鲜重、根系鲜重、总根长、总根表面积等农艺性状指标上均较对照有显著的促进作用，最大叶面积、地上鲜重、根系鲜重、总根长、总根表面积和总根体积较对照分别提高了127.58％、195.12％、528.60％、113.98％、48.07％和440％，见表8。
表8生防细菌对盆栽烟草的促生效果
Figure BDA0003590348320000122
3讨论与结论
由镰刀菌属(Fusariumspp)真菌侵染引起的烟草根腐病是我国各植烟区重要土传病害之一，近年来，随着烟区农业耕作制度变迁和区域性环境变化，促使该病害在我国烟区发生面积逐年增加，损失逐年加大，特别是河南、云南、福建、湖南等各大烟区发生流行性增强，已成为我国烟区重大病害之一。
铜绿假单胞菌在自然界分布广泛，是土壤中存在的最常见的细菌之一。在各种水、空气、人体皮肤和肠道等都有存在。铜绿假单胞菌定殖能力强，能分泌吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylicacid,PCA)和藤黄绿菌素(Pyoluterion,Plt)等抗生素，具有强烈的抗病原真菌活性，其吩嗪-1-羧酸产品申嗪霉素，因其高效、低毒和良好的环境相容性，已广泛应用于水稻纹枯病等影响国家粮食生产安全的重要作物病害防治中。另有许多学者将分离到的铜绿假单胞菌用于番茄枯萎病、草莓灰霉病、秀丽隐杆线虫、松墨天牛幼虫等病虫害生物防治中，发现铜绿假单胞菌通过分泌抗生素等抗菌物质直接抑制植物病原微生物的活动。目前，关于铜绿假单胞菌进行烟草镰刀菌的生物防治尚未有相关文献报道。
综上所述，本发明公开一种对烟草镰刀菌根腐病原具有明显拮抗效果的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)YZ66，并对其抑菌机理和促生特性进行了初步分析。该菌株对烟草主要根茎类病害抑菌谱广，主要通过菌体产生的抗生素抑制孢子萌发和菌丝生长对烟草尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌产生较强的抑菌效果，且可促进烟株生长发育，为后续研究和田间生物防治的应用奠定基础。

Claims (2)

1.一株铜绿假单胞菌YZ66，其特征在于：所述的铜绿假单胞菌YZ66的筛选和分析测定的具体操作步骤如下：
（1）从河南豫中和豫西烟区健康烟株根基土壤中分离纯化细菌菌株；
（2）拮抗细菌的筛选；
（3）拮抗细菌的抑菌谱测定；
（4）拮抗菌株对烟草种子萌发及促生作用测定；
（5）拮抗菌发酵滤液的抑菌活性测定；
（6）拮抗菌挥发性化合物的抑菌活性测定；
（7）拮抗细菌的鉴定；
（8）拮抗菌抗生素合成基因检测；
（9）拮抗细菌对镰刀菌根腐病的盆栽防效及生防菌促生作用测定。
2.根据权利要求1所述的一株铜绿假单胞菌YZ66在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用。
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CN116790417A (zh) * 2023-04-24 2023-09-22 河南省农业科学院植物保护研究所 能够抑制多种植物的病原菌并对多种作物有促生作用的假单胞菌及筛选方法和应用

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