CN109536425A - 一种特基拉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种特基拉芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种特基拉芽孢杆菌及其应用。所述的特基拉芽孢杆菌，名称为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13，于2018年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：中国北京，保藏编号为：CGMCC No.16618。该菌株对牡丹白绢病的病原真菌齐整小核菌具有显著的抑制作用，能够有效的防治牡丹白绢病，且对其他植物病害也具有显著的抑制作用，例如牡丹褐斑病、番茄早疫病、月季枝枯病或辣椒疫病，而且该菌株对生态环境无害，不会引起病原的抗药性，培养条件简单，容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

Description

一种特基拉芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种特基拉芽孢杆菌及其应用。
背景技术
牡丹为我国的传统名花，国色天香。其独特文化底蕴和观赏性，深受人们喜爱。洛阳自古便是著名的牡丹之乡，是中国乃至世界牡丹的栽培中心之一。随着牡丹种植面积的不断扩大，病虫害发生也呈上升趋势，严重影响了牡丹的观赏价值和经济价值。因此，牡丹病虫害防治问题日益受到研究人员的关注。
牡丹虫害较少，但病害发生种类多且危害严重。牡丹白绢病是较为严重的病害之一，病原真菌为齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)，主要发生在牡丹近地面的茎基部。染病后在土壤表面及牡丹茎基部出现白色绢丝状菌丝，茎基部及根部皮层腐烂，长出白色菌丝片及菌核，导致牡丹水分和养分的输送被阻断，叶片变黄枯萎，最后全株枯死。部分栽植地块牡丹白绢病发病率高达50％以上，造成牡丹整株及成片死亡。而且，由于牡丹白绢病发病部位在茎基部和根颈处，初期不易发现，甚至根部皮层腐烂过半，地上部分仍保持“正常”状态，失去早期防治的时机。
牡丹白绢病的防治目前主要依赖化学药物的使用，这不仅对人体健康和生态环境安全有害，而且容易引起病原真菌的抗药性。生物防治是利用生物或其代谢产物控制病虫害的防治方法，具有对人畜安全，对环境无污染，不易产生抗药性，高效广谱，能够促进植物生长等特点，日益受到人们的重视。然而目前利用生物防治手段，筛选抑菌效果显著的微生物菌株在牡丹白绢病防治的研究和应用几乎为空白。为了加快我国牡丹产业的发展，筛选鉴定具有抑菌效果显著、生长速度快的微生物菌株，并以其为出发菌株，研制对人体健康和生态环境安全无害、不易引起病原抗药性、高效广谱的微生物制剂迫在眉睫。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种特基拉芽孢杆菌，该菌株可以抑制牡丹白绢病病原真菌齐整小核菌的生长和繁殖。
本发明的另一目的在于提供上述特基拉芽孢杆菌的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种特基拉芽孢杆菌，名称为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13，于2018年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：中国北京，保藏编号为：CGMCC No.16618；
用于培养上述特基拉芽孢杆菌的培养基包含如下组分：红薯渣2.5～3.0wt％、豆渣1.0～2.0wt％，MgSO4·7H2O 0.5wt％，KH2PO4·2H2O 0.2wt％，pH 6.8～7.2；
所述的用于培养上述特基拉芽孢杆菌的培养基的pH优选为7.0；
所述的特基拉芽孢杆菌的培养条件优选为28～37℃培养15～30h；
所述的特基拉芽孢杆菌的培养条件进一步优选为30℃培养18h；
所述的特基拉芽孢杆菌从土壤中分离纯化得到；
所述的特基拉芽孢杆菌具有如下形态特性：
(1)在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上菌落呈土黄色，近圆形，凸起，光滑，湿润，半透明；
(2)菌体为杆状，0.5～0.7μm×1.7～5.2μm，单个或成对排列，芽孢椭球形，中生或近端生，胞囊膨大，周生鞭毛，有荚膜，革兰氏染色阳性；
所述的特基拉芽孢杆菌在微生物制剂领域中的应用；
所述的微生物制剂优选为杀菌剂；
所述的特基拉芽孢杆菌在防治植物病害中的应用；
所述的植物病害为牡丹白绢病、牡丹褐斑病、番茄早疫病、月季枝枯病或辣椒疫病；
所述的牡丹白绢病的病原真菌为齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13对牡丹白绢病的病原真菌齐整小核菌具有显著的抑制作用，能够有效地防治牡丹白绢病，同时对其他植物的真菌病害也具有显著的抑制作用，例如牡丹褐斑病、番茄早疫病、月季枝枯病或辣椒疫病。
(2)本发明提供的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13对生态环境无害，不会引起病原真菌的抗药性。
(3)本发明提供的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13的培养条件简单，容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1是特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13的抑制齐整小核菌抑菌圈试验结果图。
图2是特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13的菌落形态图。
图3是特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13的扫描电镜图。
图4是特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13革兰氏染色结果分析图。
图5是特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13鞭毛染色结果分析图。
图6是特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13荚膜染色结果分析图。
图7是特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13的系统发育树结果分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明筛选分离了特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.16618。该菌株对牡丹白绢病病原真菌齐整小核菌具有显著的抑制作用，可用于制备防治牡丹白绢病的微生物制剂。
实施例1特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13的筛选、分离和纯化
一、菌株的筛选分离方法
1、样品中微生物的分离
(1)在洛阳市伊滨区牡丹栽培园，采集牡丹根部表层土壤，在不同地点采集50个样本，装袋带回实验室风干。风干后的各样品经研磨后，从每个样品中称取5g分别加入到装有45mL无菌生理盐水和5颗玻璃珠的三角瓶(规格为250mL)中，充分摇动20～30min，制得样品悬液。
(2)在无菌条件下吸取1mL的样品悬液加入到装有9mL无菌生理盐水的试管中，振荡混匀，制得10-2样品稀释液(包含制备土壤样品悬液稀释倍数)。按上述方法依次制得10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的稀释液，分别吸取10-5、10-6、10-7浓度梯度的各样品稀释液0.1mL涂布相应的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏一号琼脂培养基和察氏合成琼脂培养基平板上，30℃倒置培养20h。根据菌落特征挑取形态和颜色等性状差异比较明显的菌落，反复平板划线获得纯培养后，编号后保存备用。
2、牡丹白绢病抑制微生物的筛选
抑制微生物的筛选采用牡丹白绢病的病原真菌齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)为靶标，方法采用对峙培养筛选法。
用于筛选的齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ACCC 36154，购自于山东深海生物科技股份有限公司。
将齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)接种于PDA平板中央，30℃培养3d后，接入初筛得到的菌株，30℃恒温培养2d后观察抑菌情况，测量抑菌圈直径，每组试验重复3次。根据抑菌直径的大小选取抑菌效果较为显著的菌株，转移至牛肉膏蛋白胨琼脂培养基斜面试管保存备用。
3、细菌鉴定方法
(1)形态特征观察
形态特征观察包括对菌落形态和细菌个体形态两方面，主要采用《常见细菌系统鉴定手册》中的实验方法进行。
1)菌落形态观察
将菌种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上划线培养24h，对其菌落形态、菌落质地、菌落的颜色、菌落边缘、光学特性及是否分泌可溶性色素等进行观察记录。
2)个体形态观察
菌体进行扫描电镜观察、革兰氏染色、鞭毛染色、荚膜染色及菌体大小的测量等。
(2)生理生化鉴定
生理生化鉴定按照《常见细菌系统鉴定手册》的方法，对各菌株进行生理生化特征的鉴定。
(3)16S rDNA序列分析
用细菌基因组提取试剂盒提取细菌基因组DNA，作为PCR反应的模板。引物用16SrDNA全长扩增通用引物。PCR扩增反应体系(30μL)：PCR预混料15μL、模板DNA 1μL、引物各0.5μL、双蒸水13μL。PCR反应条件：95℃3min；95℃50s，52℃50s，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min。用PCR胶回收试剂盒回收PCR产物，经质量分数为1.5％的凝胶电泳检测后，与克隆载体pGM-T在T4连接酶作用下于16℃过夜连接，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。引物及阳性克隆菌测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。利用Blast将菌株的16S rDNA的序列与GenBank数据库中已知的序列进行比较，分析其同源性。
二、筛选分离结果
1、样品中微生物的分离纯化
从样品中分离纯化共获得36株细菌、7株放线菌和3株霉菌，分别编号保存，用于抑制微生物的筛选。
2、牡丹白绢病病原真菌抑制微生物的筛选
以牡丹白绢病病原真菌齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)作为靶标，采用对峙培养法，测定抑菌效果即抑菌圈大小，进行抑制微生物的筛选。结果表明，从样品中分离得到的微生物中，对牡丹白绢病有抑制作用的有3株细菌和1株放线菌，其中抑菌圈直径在5mm以上的有1株细菌，抑菌圈直径为7.3mm(图1)，命名为QX13，进行微生物鉴定。
3、个体及菌落形态观察结果
对菌株QX13进行菌落形态和个体形态的观察，结果见图2～6。
所分离得到的菌株QX13菌落土黄色，近圆形，凸起，光滑，湿润，半透明(图2)；
所分离得到的菌株QX13的菌体为杆状，0.5～0.7μm×1.7～5.2μm，单个或成对排列，芽孢椭球形，中生或近端生，胞囊膨大，周生鞭毛，有荚膜，革兰氏染色阳性(图3～6)。
根据《常用细菌系统鉴定手册》，初步推断菌株QX13可能属于芽孢杆菌属(Bacillus)。
4、生理生化特征鉴定结果
由表1可知，所分离得到的菌株QX13的生理生化特征与《常用细菌系统鉴定手册》中芽孢杆菌属特征相符，进一步确定菌株QX13属于芽孢杆菌属(Bacillus)。
表1菌株QX13生理生化特征
注：+表示阳性反应；-表示阴性反应。
5、16S rDNA测序结果
以细菌基因组为模板，经过PCR扩增后，所分离得到的菌株QX13的PCR产物经质量分数为1.5％琼脂糖凝胶电泳检测出现大约1400bp荧光条带。通过阳性克隆菌质粒的目标区域测序，16S rDNA片段大小为1386bp，具体序列如下所示：
基于此序列，采用MEGA5.0软件，构建系统发育树，如图7所示。菌株QX13在系统发育上与特基拉芽孢杆菌同属一个分支。16S rDNA序列分析结果显示与已知菌株特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis KCTC 13622T(AYTO01000043)的亲缘关系最为接近，同源性达到100％。结合菌株菌落形态、个体形态以及生理生化鉴定的结果，菌株QX13为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)。该菌株于2018年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：中国北京，保藏编号为：CGMCC No.16618。
实施例2特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13抑菌活性物质分析
试验方式：盆栽试验，试验时间：5～6月，具体方法为：特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)QX13由牛肉膏蛋白胨培养基斜面试管转接到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，在恒温摇床上培养20h(180rpm，30℃)，取出培养液3000r/min离心30min，收集上清液备用；沉淀物即菌体，用生理盐水制备菌体悬浮液，调整菌体浓度为108CFU/mL；分别将菌体悬浮液、菌体培养液(浓度为108CFU/mL)和上清液分别以100mL/株均匀喷洒于齐整小核菌感染的牡丹植株(齐整小核菌接种于马铃薯蔗糖液体培养基，30℃培养3d后，菌丝体悬浮液按100mL/株均匀喷洒牡丹植株，不做任何处理5d)。试验以清水作为对照。调查并记录感染牡丹白绢病牡丹植株数，每5天调查1次。其中，发病率(％)＝发病株数/试验总株数×100％，防效(％)＝(对照发病率-处理发病率)/对照发病率×100％。
表2特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13抑菌活性物质研究结果
试验结果如表2所示，菌体培养液和上清液处理效果明显，而菌体悬浮液处理几乎没有抑菌效果。该结果证明，特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13是通过胞外代谢产物对齐整小核菌达到抑制作用的。
实施例3
(1)特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13对牡丹白绢病的抑制作用
2017年5月20日，选取洛阳市伊滨区牡丹栽培园的80株牡丹作为试验对象，将牡丹均分为A、B两组，B组为对照组。对A、B两组中的牡丹苗接种等量的病原真菌齐整小核菌，具体方法为：齐整小核菌接种于马铃薯蔗糖液体培养基，30℃培养3d后，菌丝体悬浮液按100mL/株均匀喷洒牡丹植株；5d后A组使用特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13菌体培养液(浓度为108CFU/mL)100mL/株均匀喷洒于牡丹植株，每隔两周喷洒一次，共喷洒四次；B组使用等量清水进行喷洒，每隔两周喷洒一次，共喷洒四次。调查并记录感染牡丹白绢病牡丹植株数，每5天调查1次。
2017年7月20日检查结果：A组仅有1株牡丹白绢病生成，B组有15株牡丹白绢病生成。
结果表明，本发明中的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13能够有效的抑制牡丹白绢病的生成，防效达93.33％。
(2)特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13对多种病原真菌的抑制作用
采用对峙培养法，用直径为6mm的打孔器分别在培养好的牡丹褐斑病、番茄早疫病、月季枝枯病和辣椒疫病病原真菌的菌落(牡丹褐斑病病原真菌牡丹枝孢霉(Cladosporium paeoniae)，菌株保藏号为ACCC 36063，番茄早疫病病原真菌茄链格孢(Alternaria solani)，菌株保藏号为ACCC 36023，月季枝枯病病原真菌蔷薇盾壳霉(Coniothyrium corda fuckelii)，菌株保藏号为ACCC 36408，辣椒疫病病原真菌辣椒疫霉(Phytophthora capsici)，菌株保藏号为ACCC 36278；以上菌种购自于山东深海生物科技股份有限公司)边缘取菌块，将菌块接种到PDA平板中央，然后把特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)QX13接种到距离平板中央距离相等的位置，以只接病原真菌的平板为对照，做3次重复，之后置于温度为30℃的恒温箱中培养。至对照平板上病原真菌长满平皿，测量病原菌菌落直径，计算对病原真菌生长的抑制率。抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％。结果如表3。
表3特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13对多种病原真菌的抑制作用
结果表明：本发明中的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13能够有效的抑制牡丹褐斑病、番茄早疫病、月季枝枯病和辣椒疫病，其抑菌谱广，效果明显。
实施例4特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13发酵培养基和培养条件的优化
特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13在种子培养基(牛肉膏蛋白胨液体培养基)中30℃培养15h，接种量3％(V/V)接入装有80mL发酵培养基(红薯渣、豆渣为碳源和氮源，具体见表4)的三角瓶中，培养温度30℃，摇床180rpm进行培养。以红薯渣、豆渣、培养时间、起始pH为4种因素，各选取3个水平，以发酵液中的活菌数为指标，采用L9(34)正交表，利用SPSS软件设计正交试验，试验重复两次，且重复采用随机区组设计，进行方差分析和单因素统计，如表4所示。其中，将红薯渣和豆渣(两者按表4和表5中不同水平组合数值称量)放入锅中，加水500mL，在加热器上加热至沸腾20min，在烧杯上用8层纱布过滤，弃滤渣，取滤液；将滤液、MgSO4·7H2O(添加量0.5wt％)和KH2PO4·2H2O(添加量0.2wt％)以及水混合，定容到1000mL，调pH(按表4和表5中不同水平组合调节pH)，得到发酵培养基。
表4试验因素水平
红薯渣、豆渣、培养时间和起始pH对发酵液菌数影响的正交试验结果如表5、表6和表7所示。由表6可以看出，红薯渣、豆渣、培养时间和起始pH的P<0.01，差异极显著。F检验结果表明，红薯渣、豆渣、培养时间以及起始pH对发酵液菌数的影响达显著水平。由表7可以分析得到各因素水平的优劣顺序是：A3>A2>A1，B2>B3>B1，C1>C3>C2，D2>D1>D3。最后得出最佳的组合是A3B2C1D2，即为红薯渣3.0wt％、豆渣1.5wt％，培养时间18h，起始pH为7.0。按照正交试验设计的培养条件进行发酵培养，发酵液活菌数达到11.7×108CFU/mL。特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13的培养条件简单，碳源和氮源可以使用常见的廉价农业副产物，易于工业化生产，能否产生芽孢，容易保存，具有良好的开发应用前景。
表5 L9(34)正交试验表
表6方差分析表
表7单因素统计
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南科技大学
<120> 一种特基拉芽孢杆菌及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1386
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 菌株QX13 16S rDNA测序结果
<400> 1
agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa 60
gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggatg gttgtttgaa ccgcatggtt 120
caaacataaa aggtggcttc ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt 180
tggtgaggta atggctcacc aaggcaacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc 240
acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc 300
aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa 360
gctctgttgt tagggaagaa caagtaccgt tcgaataggg cggtaccttg acggtaccta 420
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tgtccggaat tattgggcgt aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc 540
ccccggctca accggggagg gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagaggagag 600
tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg 660
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ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct 780
tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac 840
tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac 900
gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaatcc tagagatagg acgtcccctt 960
cgggggcaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1020
taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta 1080
aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct 1140
tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacagaacaa agggcagcga aaccgcgagg 1200
ttaagccaat cccacaaatc tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg 1260
aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt 1320
gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt 1380
ttagga 1386

Claims (10)

1.一种特基拉芽孢杆菌，其特征在于名称为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)QX13，于2018年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：中国北京，保藏编号为：CGMCC No.16618。
2.根据权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌，其特征在于：
用于培养特基拉芽孢杆菌的培养基包含如下组分：红薯渣2.5～3.0wt％、豆渣1.0～2.0wt％，MgSO4·7H2O 0.5wt％，KH2PO4·2H2O 0.2wt％，pH 6.8～7.2。
3.根据权利要求2所述的特基拉芽孢杆菌，其特征在于：
所述的用于培养特基拉芽孢杆菌的培养基的pH为7.0。
4.根据权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌，其特征在于：
所述的特基拉芽孢杆菌的培养条件为28～37℃培养15～30h。
5.根据权利要求4所述的特基拉芽孢杆菌，其特征在于：
所述的特基拉芽孢杆菌的培养条件为30℃培养18h。
6.权利要求1～5任一项所述的特基拉芽孢杆菌在微生物制剂领域中的应用。
7.根据权利要求6所述的特基拉芽孢杆菌在微生物制剂领域中的应用，其特征在于：
所述的微生物制剂为杀菌剂。
8.权利要求1～5任一项所述的特基拉芽孢杆菌在防治植物病害中的应用。
9.根据权利要求8所述的特基拉芽孢杆菌在防治植物病害中的应用，其特征在于：
所述的植物病害为牡丹白绢病、牡丹褐斑病、番茄早疫病、月季枝枯病或辣椒疫病。
10.根据权利要求9所述的特基拉芽孢杆菌在防治植物病害中的应用，其特征在于：
所述的牡丹白绢病的病原真菌为齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)。
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