CN110423707A - 枯草芽孢杆菌菌株nh-6及其应用 - Google Patents

枯草芽孢杆菌菌株nh-6及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及芽孢杆菌领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌菌株NH‑6及其应用。一种枯草芽孢杆菌菌株NH‑6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 17815。本发明的枯草芽孢杆菌菌株NH‑6具有培养方法简单、生长速度快、抗菌谱广和抗逆性强等优点。由该枯草芽孢杆菌菌株NH‑6制备的生物防治制剂，可以作为生物农药或者生物肥料，防治根结线虫病害和多种植物病原真菌，包括黑斑病菌、纹枯病菌和灰霉病菌等。

Description

枯草芽孢杆菌菌株NH-6及其应用
技术领域
本发明涉及芽孢杆菌领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌菌株NH-6及其应用。
背景技术
枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，枯草芽孢杆菌广泛应用于饲料、肥料及作为杀菌剂使用。其制剂是无毒、无残留、无污染的绿色菌剂，具有广阔的发展前景，显示出巨大的社会效益和生态效益。
然而现有的枯草芽孢杆菌很多只能单一的对某种植物病害起到防治作用，而有些虽然能够防治多种植物病害，但是作用效果不太理想。因此，继续发明一种新的能够高效防治多种植物病害的枯草芽孢杆菌。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于高效防治多种植物病害和根结线虫病害的新的细菌-枯草芽孢杆菌菌株NH-6，本发明的菌株具有生长速度快、抗菌谱广和抗逆性强等优点。
本发明所提供的枯草芽孢杆菌菌株NH-6，是从土壤中分离筛选得到，已于2019年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 17815，其具有以下形态学特征：
枯草芽孢杆菌菌株NH-6的革兰氏染色呈阳性，菌体为杆状，PYS培养基培养26℃培养24h后产生芽孢，芽孢呈椭圆形，中生。培养初期菌落为圆环形、乳白色，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落为淡黄色，边缘呈小齿状，表面干燥有褶皱。在液体培养基中静止培养时，菌体在培养基表面形成白色菌膜结合《常见细菌系统鉴定手册》，该菌应为芽孢杆菌属。
枯草芽孢杆菌菌株NH-6的常规培养方法或者繁殖方法包括：
将枯草芽孢杆菌菌株NH-6接种于PBGA培养基进行常规培养，培养温度为25-30摄氏度，培养基配方包括胰蛋白胨、牛肉浸膏、葡糖糖和琼脂。
本发明第二个方面公开了枯草芽孢杆菌菌株NH-6在防治根结线虫和防治植物病原真菌中的应用。所述植物病原真菌包括黑斑病菌、纹枯病菌和灰霉病菌。
应该理解，本发明并不限于根结线虫、黑斑病菌、纹枯病菌和灰霉病菌任何能够利用本发明方法枯草芽孢杆菌菌株NH-6进行防治目的虫类或者病菌都在本发明的保护范围之内。
本发明第三个方面公开了一种生物防治制剂，该生物防治制剂包括上述的枯草芽孢杆菌菌株NH-6。
本发明第四个方面公开了一种制备上述的生物防治制剂的方法，包括以下步骤：
S1：制备枯草芽孢杆菌菌株NH-6的种子液；
S2：将S1中的得到的种子液接种到培养基中进行发酵培养即得到生物防治制剂。
本发明第五个方面公开了一种用于防治农作物的根结线虫病害的方法，包括向根部有根结线虫的农作物施用上述的枯草芽孢杆菌菌株NH-6或者上述的生物防治制剂。
优选的，所述农作物为番茄。
应当理解，本发明的保护范围农作物并不限于番茄，本领域技术人员在本发明的教导之下，本领域技术人员能够采用其他合适的农作物，并且在本发明的保护范围之内。
与现有技术相比，本发明具有以下优点或者有益效果：
本发明的枯草芽孢杆菌菌株NH-6具有培养方法简单、生长速度快、抗菌谱广和抗逆性强等优点。由该枯草芽孢杆菌菌株NH-6制备的生物防治制剂，可以作为生物农药或者生物肥料，防治根结线虫病害和多种植物病原真菌，包括黑斑病菌、纹枯病菌和灰霉病菌等。
附图说明
利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制。
图1为本发明实施例中枯草芽孢杆菌菌株NH-6对纹枯病菌拮抗作用示意图；
图2为本发明实施例中枯草芽孢杆菌菌株NH-6对黑斑病菌拮抗作用示意图；
图3为本发明实施例中枯草芽孢杆菌菌株NH-6对灰霉病菌拮抗作用示意图；
图4为本发明实施例中枯草芽孢杆菌菌株NH-6对根结线虫生长具有拮抗作用的示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1枯草芽孢杆菌菌株NH-6的分离与纯化
本实施例中的枯草芽孢杆菌菌株NH-6是从土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：在根结线虫发病设施番茄中，选取健康根部采集土壤，无菌水溶解，上清液依次稀释涂布平板，挑取单菌落斜面培养，以纹枯病原菌为指示菌，进行初筛、复筛和定量筛选。
分离得到的枯草芽孢杆菌菌株NH-6的革兰氏染色呈阳性，菌体为杆状，PYS培养基培养26℃培养24h后产生芽孢，芽孢呈椭圆形，中生。培养初期菌落为圆环形、乳白色，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落为淡黄色，边缘呈小齿状，表面干燥有褶皱。在液体培养基中静止培养时，菌体在培养基表面形成白色菌膜结合《常见细菌系统鉴定手册》，该菌应为芽孢杆菌属。分离得到的枯草芽孢杆菌菌株NH-6具体生理生化特性如表1所示。
表1 NH-6的生理生化特性
其中，表1中的接触酶具体是过氧化氢酶。
该枯草芽孢杆菌菌株NH-6已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 17815。
实施例2NH-6菌株16S rDNA鉴定
将实施例1中提取得到的NH-6菌株的DNA,进行PCR扩增，扩增基因片段克隆分析，测序结果表明，菌株16S rDNA序列长度为l510bp，将测序结果(GenBank登陆号为DF520956)与NCBI中芽抱杆菌16S rDNA基因序列进行同源性比较，菌株16S rDNA序列与枯草芽孢杆菌16S rDNA序列同源性达到99％。综合NH-6菌株形态特征、生理生化指标测定结果，初步确定NH-6为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
实施例3NH-6菌株对多种植物病害具有拮抗作用
NH-6菌株挑取移植到PBGA斜面，26℃下培养36h。以纹枯病菌、黑斑病菌和灰霉病菌为指示菌进行抑菌试验，拮抗作用必须在环境条件一致的情况下进行。将供试病原菌移植活化PDA平板上，26℃下培养48h，然后用打孔器在带菌PDA平板上打孔，在不带菌PDA平板上呈对角点接NH-6菌株，生长10h后在平板中央移入供试病菌菌块，26℃下培养48h，放置病原菌块但不接NH-6的平板作对照，当对照长满平板，测量拮抗带宽度，每个病原菌株3个重复处理。结果如图1-图3所示，图中A图为对照组，B组为处理图。通过分析比较图1-图3的实验结果，可以得出NH-6菌株对多种植物病害具有拮抗作用。
实施例4NH-6菌株对根结线虫生长具有拮抗作用
番茄苗移栽3d后，接种NH-6菌株。随机抽取移栽好的番茄苗，灌根接种NH-6菌悬液(1010CFU/mL)25mL；灌根处理3d后，将5mL(90条/mL)线虫悬浮液稀释滴注到番茄的根部，以直接接种线虫悬浮液5mL(90条/mL)的处理作为对照。NH-6和清水作为处理组。每一处理20株苗，重复3次。温度26℃、相对湿度50％条件下，培养5周。取出接种植株，统计病害发生情况，计算病害严重度和防效。结果如图4所示，图中A图为对照组，B组为处理图，从图中可以得出NH-6菌株对根结线虫生长具有拮抗作用。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (8)

1.一种枯草芽孢杆菌菌株NH-6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 17815。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株NH-6在防治根结线虫中的应用。
3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株NH-6在防治植物病原真菌中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物病原真菌包括黑斑病菌、纹枯病菌和灰霉病菌。
5.一种生物防治制剂，包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株NH-6。
6.一种制备权利要求5所述的生物防治制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备枯草芽孢杆菌菌株NH-6的种子液；
S2：将S1中的得到的种子液接种到培养基中进行发酵培养即得到生物防治制剂。
7.一种用于防治农作物的根结线虫病害的方法，其特征在于，包括向根部有根结线虫的农作物施用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株NH-6或者权利要求5所述的生物防治制剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述农作物为番茄。
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